Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi Published: July 24, 2013 doi: 10.3791/50412
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg, 2Institut de recherches cliniques de Montreal
* These authors contributed equally

Summary

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine rağmen,

Abstract

Gelişmekte olan memeli beynin belirli bölgelerde genetik modifikasyonu çok güçlü bir deneysel bir yaklaşımdır. Ancak, yeni fare mutantlar üreten genellikle sinir bozucu yavaş. Makul post-operatif sağkalım rahimde gelişmekte olan fare beyin erişimi mümkün olduğu gösterilmiştir. Yine de, bu prosedüre sonuçlar gelişmekte olan beynin en yüzeysel ve kolay erişilebilir kısmı için neredeyse sadece bildirilmiştir, korteks yani. Talamus, daha dar ve daha orta bölgesinden bir hedef, daha zor olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle derin çekirdek, hipotalamus bu içine Transfeksiyon, en zorlu ve bu nedenle çok az sonuç bildirilmiştir belki de. Burada tüm hipotalamik epitele veya elektroporasyon ile transfeksiyon için bunun bir parçası (hipotalamik bölgeler) hedef için bir prosedürü göstermektedir. Bizim yaklaşım anahtarları t uzun narkoz kez, enjeksiyon olarakHird ventrikül ve uygun tür ve elektrot konumlandırma. Ayrıca, hedef ve en girintili hipotalamik çekirdek, göğüs vücudun sonraki histolojik analiz sonuçları göstermektedir.

Introduction

Embriyonik fare beyin genetik manipülasyon gelişimsel düzenleme hakkında bilgi almak için tercih edilen bir yaklaşımdır. Mutant fare hatları üretimi ne kadar yavaş ve pahalıdır. Memeli beyin nöronların geliştirilmesinde belirli genetik değişiklikler tanıtmak için bir güçlü bir yöntem utero elektroporasyon olduğunu. Esasen, teknik daha sonra embriyo, belirli bir zaman süresi boyunca hayatta beyin toplamak ve olası yeni, bilgilendirici, fenotip için bunları incelemeye izin veren elektrik darbeleri vasıtasıyla embriyonik beyin epitele DNA transfekte oluşur. Bu şekilde, fare deneyi mutantlarının üretimi için gerekli olan uzun bekleme süreleri olmaksızın hemen hipotezleri test edebilir.

Gelişmekte olan embriyo içine DNA Transfeksiyon civciv embriyoları 1 ovo elektroporasyon ile başladı. Fare için proof-of-concept temel kültüründe yapıldı utero 3,4 fare üzerindeki tekniğin ilk açıklamaları izledi.

Asıl sorun onları ya da anne öldürmeden rahimde gelişmekte olan embriyo beyin transfect etmektir. (Laparotomi, enjeksiyon, elektroporasyon) gerekli ameliyat öğrenmek uzun bir eğitim süresi gerektirir. Ameliyat embriyo hayatta kalma oranı kabul edilebilir noktaya hakim sonra, bir sonraki önemli bir soru: beyin yapıları erişilebilir olan? Beklendiği gibi, utero elektroporasyon ile elde edilen sonuçlar gösteren ilk yayınlanan bildiri kortikal gelişim 5-9 odaklanmıştır. Cerrahi işlemler için en kolay gelişmekte olan fare beyin bölgesi korteks (Şekil 1), bu durum, bu yöntem kullanılarak yayın çoğu için de geçerlidir. Korteks içine utero elektroporasyon prosedürü tarif edilmiştirbaskı 10 ve video 11-14. Tekniğin bir değişiklik telencephalon bir karın kısmı, bazal ganglion 15 hedeflemek için kullanılabilir.

Telencephalon ötesinde, diensefalon (klasik talamus ve hipotalamus ayrılmıştır) ulaşmak için daha zor ön beyin bir bölgedir. Onun dorsal ve en kolay kısmı, talamus 16-19 hedef kağıtları raporların az sayıda.

Hipotalamus, ön beyin en karın kısmı bu nedenle bir dorsal yüzeyi (korteks), (Şekil 1) 'den en derin lokalize. Bu bölge genetik rahimde fare beyin işlemek için taahhüt araştırmacılar için zor bir sorun olmaya devam etmektedir. Bildiğimiz kadarıyla, sadece çok az sayıda makale fare hipotalamus 20,21 içine utero transfeksiyon içinde sonuçları rapor. Ancak, hipotalamus bulaşmıyor işlevsel önemibu, çiftleşme, üreme ve ebeveynlik 22 yeme ve içme gibi davranışları düzenleyen beri t, abartılmış. Ayrıca, hipotalamik gelişiminde değişiklikler daha sonra obezite, hipertansiyon, diyabet ve erken ergenlik 23 gibi yaşam koşulları kaynaklı katkıda bulunur. Gelişimi sırasında genetik hipotalamus değiştirmek için güçlü olmak bunu anlamak için çok güçlü bir araç sağlayacaktır.

Burada kullandığımız gebe farelerin laparotomi için temel cerrahi protokolü diğer protokoller 11,13,14,24 kullanılan benzemektedir. Biz bütünlüğü için kısaca bunları anlatacağız. Bizim prosedüre anahtar, diğer taraftan, anestezi tipi, enjeksiyon yeri, elektrotların türü ve ekleme ve embriyonun kafası ile ilgili olarak pozitif elektrot pozisyonu vardır. Eski sağlar beri, basit intraperitoneal anestezi üzerinden gaz solunması anestezi teşvik ve korumak için tercihnarkozu biraz daha uzun süre zor bir ameliyat için gerekli. Anestezi daha hızlı kurtarma izofluran inhalasyon sonuçları, genellikle anne zaten ameliyattan sonra dakika normal bir davranışı gösterir beri. Cam mikropipet ile DNA çözüm enjeksiyon en kolay nokta ancak hipotalamus elektroporasyon için tamamen uygun değildir lateral ventrikül vardır. Doğrudan üçüncü ventrikül enjeksiyon gerçekten derin diensefalik yapıları hedef için çok önemlidir. Bu standart, off-the-raf elektrotlar ile E12.0 veya E12.5 gelen hipotalamus transfect mümkündür. Biz özellikle bu amaç için uygun Nepa, Gene (Chiba, Japonya) tarafından üretilen bazı elektrodların bulduk.

Bizim işlem ile, tüm hipotalamik neuroepithelium veya elektrot yönüne bağlı olarak kısmi, bölgesel aktarılmasının transfeksiyon edinin. Burada muhtemelen, göğüs vücut transfecting tarafından tekniği göstermekderin ve bütün hipotalamik çekirdek en gömme. Buna ek olarak, çözünürlük, hücresel seviyede için transfekte edilmiş hücrelerin ayrıntılı histolojik analizi aşağı göstermektedir.

Utero fare gelişen beyin transfecting diğer yaklaşımlarla utero elektroporasyon karşılaştırılması Tartışma bölümünde bulunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Enjeksiyon için DNA ve Cam mikropipetler hazırlanması

  1. İyi kaliteli cam mikropipetler amniyotik sıvı kaybı nedeniyle ilk yüksek kürtaj oranını azaltmak için gereklidir. Cam mikropipetler çekmek için prosedür de 13,18,25 belgelenmiştir. Isı = 300,, 1.2 mm çapında kılcal kullanın ayarları p = 500 ile geleneksel bir Sutter P-97 cihazı çekti = 40 çekin; Hız = 50; Zaman = 50. 3 mm "çukur" filamentler (Sutter Instrument FT330B) ile çektirme takın. 2 mm boyutu filamentler bize daha az tatmin edici sonuçlar için vermiştir. Öte yandan, mikropipet ipuçları beveling bizim için sonuçlarını geliştirmek için görünmüyor.
  2. 1-2 mg / ml bir son konsantrasyona kadar hızlı şekilde yeşil% 0.1 içeren PBS içinde saflaştınldı, endotoksin içermeyen DNA (Hücre Kültürü Sınıf) içinde çözülür. Hızlı Yeşil embriyonik beyin ventrikül görünür enjekte çözüm yapacaktır.
  3. Cam mikropipet içine DNA çözüm 10 ul yükleyin. Enjeksiyon sistemi (Pico Pompa) veya ağız pipet cam mikropipet bağlayın.

2. Anestezi

Bir ısıtma yastığı ve cerrahi aletler ile cerrahi tablo hazırlayın. Embriyoların görselleştirme kolaylaştırmak için soğuk ışık kaynakları açın. Örneğin bir cam boncuk sterilizatör için kullanarak cerrahi aletler dezenfekte edin.

Üç farklı anestezi prosedürleri (Tartışma) bu protokol için mümkündür. Burada biz (debisi 0,5 L / dk) anestezi indüksiyonunda izofluran inhalasyon kullanarak, iyi düşünün bir de bakım (akış hızı 1 L / dk) anlatacağız.

  1. Boru kısa bir uzunluğu Komesaroff Mark 5 Anestezi Cihazı bağlı bir (yani fare görünür kalır) şeffaf küçük bir kapta hamile fare tanıtmak.
  2. Izofluran ile buharlaştırıcı doldurun, daha sonra cihaza bağlı oksijen şişe açın. Isofl bir ya da iki darbe Darbeurane / narkoz set in için fare ve saat tutan kaba oksijen (0.5 L / dk)
  3. Onları kurumasını önlemek ve hemen kendi kafasına akış anestezi maskesi uygun merhem ile göz kapağı, fareyi çıkarın.

3. Laparotomi

  1. Isıtma yastığı (aksi takdirde vücut ısısı kurtarma şansı azalan, çok hızlı aşağı gidecek) kadar göbek fare yerleştirin ve bant ile yanlarına dört ayakları sabitleme tarafından yerine gövdesi sabitleyin. Refleks stimülasyon (firma basınç ile örneğin parmak veya kuyruk tutam) yanıt kaybı denetleyerek anestezi derinliği değerlendirin.
  2. Karın yüzeyi Tıraş ve iodophorpovidone-iyot (Braunoderm) ile dezenfekte edin.
  3. Karın derisi üzerinde bir uzunlamasına kesik (1-1,5 cm uzunluğunda) olun. Daha sonra periton kesti. Kesi etrafında pamuk gazlı bez yerleştirin. Bir uterin boynuz görünür yapın ve PBS-durulanır gauz üzerine künt forseps ile dikkatli bir şekilde çekine. Çok sık, her zaman (Şekil 2A ve 2B) nemlendirilmiş tutmak için PBS ile rahim durulayın. Tüm işlem sırasında rahim içinde yüksek basınç kürtaj ile sonuçlanan enjeksiyon üzerine sıvı kaybı şansı artan embriyo ilettiğiniz çünkü, sıkı mesometrium veya rahim çekerek kaçının.

4. Beyin Ventrikül içine DNA Enjeksiyon

  1. Beyin ventriküller görülebilmesi şekilde rahim tutun. Yaygın olumsuz bir pozisyonda yatıyor bir embriyo yeniden konumlandırmak etmeyin - bu sadece kürtaj şansını artırır.
  2. Üstten embriyonun kafası bakıldığında, sol ve sağ kortikal hemisfer arasındaki görsel boşluğu veya fissür lokalize. Hemisfer ayırt etmek kolaydır ve içlerinde lateral ventriküller (hedef olmamak), genellikle biraz daha koyu şekiller olarak algılanabilir. Bir embriyo (Figür DNA enjeksiyonu için mükemmel odaklı olduğu bulunursaes 2C ve 2D), bu delmek için rahim duvarı mevcuttur ve aynı anda üçüncü ventrikül girin. Yaklaşık 1 mm delici, rahim duvarı ve kortikal hemisfer arasındaki farkın rostral sonunda delinme buna 45 ° cam mikropipet tutun. Bu şekilde, cam mikropipet ucu beyin (değil yanal ventrikül) (Şekil 2C ve 2D) üçüncü ventrikül girecektir. Bu embriyonik baş çevresinde ilk delmek rahim duvarına (her zaman 45 °) için yararlıdır az olumlu odaklı embriyolarda, kortikal hemisfer arasında doğru pozisyonda mikropipet ucu yerleştirin ve ancak o zaman beyin perfore. Üçüncü ventrikül (iyi bir enjeksiyon yeşil sıvı ile ventrikül doldurur) içine DNA çözüm 1 ul hakkında enjekte edilir. Bir rahim boynuzu tüm embriyolar ile aynı işlemi tekrarlayın. Bu DNA çözümü için bir süre ventriküler sıvı ile eşit karıştırın ve entir ulaşmasını sağlare neuroepithelium.

5. Elektroporasyon için Hipotalamus Hedefleme

  1. Üzerinde Elektroporatör açın ve embriyonik yaş (E12.5 için biz 5 kare-dalga darbeleri kullanın, 50 V, 50 msn ON/950 msn OFF) göre ayarlayın. Pozitif kutbu paslanmaz çelik iğne elektrot (CUY550-10) olarak ve negatif kutup yuvarlak düz elektrot (CUY700P4L) olarak kullanın. (Bu, aksi takdirde mevcut değil, sadece bu kadar embriyo çevresinde akar yana elektrotlar, embriyo daha küçük olması önemlidir.)
  2. Elektroporasyon için olan sırt tarafında (yani deneyci dönük) kadar (bunlardan çoğu gibi) bu embriyoların seçin, ve olan yönelim elverişli değildir bu atın. Bu etanol-dezenfekte parmakları ile veya eldiven ile rahim dokunmak artık güvenlidir. Forseps ile rahim Holding Ancak, elektroporasyon sırasında elektrik akımını bozabilir.
  3. Pierce amn arasındaki embriyonun başkanı tarafından rahim duvarıiğne elektrot ucu ile aşağı doğru sokmak tarafından iotic kese ve plasenta. Itme blok gibi diğer elin işaret parmağınızı kullanın. Elektrot ucu yaklaşık 5 mm orta beyin (Şekil 2E ve 2F) yaklaşık düzeyinde, amniyon kesesi ve uterus duvar arasında şimdi olmalıdır. Bu "hedef elektrot", bu nedenle konumunu hipotalamik neuroepithelium parçası transfekte almak için büyük olasılıkla belirlemek unutmayın. Embriyo çok yavaşça elektrotlar arasında "sıkıştırılmış" olmak zorundadır.
  4. Öte yandan, pozisyon ile embriyo kafası (Şekil 2E ve 2G) ters tarafında rahim dış duvarın yuvarlak yassı elektrod.
  5. (, 950 msn kapalı, 5 kare dalga darbeleri ON 50 V, 50 msn) gerilim uygulamak için pedal anahtarı kullanın.
  6. Diğer elin işaret parmağı ile rahim geri tutarak yavaşça rahim iğne elektrot çekin - eğer Amniotik sıvı Patlak duvarından kaybolur, genellikle embriyo kürtaj geçirecek. Tüm embriyolar ile aynı işlemi tekrarlayın.
  7. Karın içine rahim boynuz dönün ve kalan boynuz içinde enjeksiyon ve elektroporasyon tekrarlayın.

6. Cerrahi Bitirme

  1. Tüm embriyoların enjeksiyon ve elektroporasyon sonra, kapatmadan önce serum fizyolojik ile periton boşluğuna önce ve nemli tam olarak konumlandırılmış, çok dikkatli bir şekilde karın geri rahim yerleştirin.
  2. Cerrahi katgüt (Vicryl poliglaktin 910, 5-0, Ethicon V4914) ile periton dikin. Cilt kullanım kapatılması için methodwith daha dayanıklı sütür (Supramid Naylon, 6-0, Serag Wiessner 07171L TO) "dikiş kesildi".
  3. Povidon-iyot (Braunoderm) ile karın yüzeyi dezenfekte edin ve bir non-steroid subkutan anti-inflamatuar (örneğin% 0.9 NaCl içinde Rimadyl içinde 1:10 çözüm 100 ul) veya, daha iyi, met gibi bir opioid enjekteprenorphine (Temgesic,% 0.9 NaCl 0.05 ile 0,1 mg / kg vücut ağırlığı) ağrı gidermek için.
  4. Anestezi makineden anne çıkarın ve bir ısıtma yastığı ile ısıtılan bir kafes yerleştirin. Tamamen anestezi kurtarıldı kadar sürekli fare izleyin. Daha sonra, onlar enfeksiyon veya ağrı belirtisi olmadan prosedürü gelen kurtarma sağlamak için her gün hayvanları kontrol edin.

7. Sonuçları analiz

  1. Analiz istenilen güne göre embriyolar (veya postnatals) hasat. Doğum Sonrası fareler (1 ile 2 günlük) dekapitasyon tarafından öldürüldü.
  2. Bir önceki elektroporasyon açıklama göre her embriyo ayırın. Bir stereo mikroskop altında beyin incelemek ve uygun bölgede yeşil floresan sinyal (GFP muhabiri itibaren) için mikroskop altında kontrol edin.
  3. Seçilen beyin "taze" analiz edilebilir:% 4 paraformaldehid kısa bir süre için doku düzeltmek ve agaroz% 4 veya jelatin-bir gömmeklbumin, o zaman bir vibratome tipi cihaz bölümü (Şekil 3). Daha detaylı immünohistokimyasal analizi için (Şekil 4), OKT montaj orta (Doku Tek) gömmek% 30 sakaroz çözüm, beyinde kriyo-koruma sonra kriyostat 20 mikron bölümleri kesti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En hipotalamus nöronlar biraz daha kısa fare geliştirme 27,28 tercüme sıçan 26 doğum kalma analizine göre, E11.5 arasında E15.2 için doğarlar. Hipotalamik nöron zirve E12.5 29-31 ulaşılır. Buna göre, bu çalışmada (E12.5) için seçilen transfeksiyon yaşta, hipotalamus nöronları büyük bir kısmı, herhangi bir rostro-kaudal seviyesinde etiketlenebilir.

Kalın vibratome tip bölümlerde E18.5 de analizi (Şekil 3A ve 3B), hipotalamik neuroepithelium tüm rostro-kaudal uzantısı elektroporasyon (Şekil 3A) için erişilebilir olduğunu gösterir. Herhangi bir yaşta, nöronlar soy çalışmaları 32 ile anlaşarak, tüm medio-yan düzeyleri (Şekil 3B) olarak etiketli olabilir. Memelere ait gövde (MBO) en Ventra bir girinti astar epitele gelişen bir nöronal çekirdeğil ve ön beyin kaudal bölümü. Bu hedef, ilke olarak MBO çok zor hale getirir. İşlevsel olarak, MBO ileriye dönük bellek 33 bellek konsolidasyon ve patolojik dejenerasyonu sonuçları için önemli bir yapıdır. Bu çekirdek (Şekil 3C ve 3D) içine çok özel muhabiri plazmid transfect mümkün olmuştur. MBO nöronlar da transfeksiyon (Şekil 3C ok başları) sonra etiketli iki çok karakteristik ve fonksiyonel olarak önemli yolları oluşturan aksonlar uzatmak. Enine kesitler (Şekil 3D) (transfeksiyon deney gerçekleşti önce yani) E12.5 (transfeksiyon yaş) doğan nöronlar daha önce üretilen nöronların olmayan bir etiketli kitle etrafında bir eğri "tabaka" oluşturmak olduğunu göstermektedir.

Floresan muhabiri proteinleri, sonuçların daha yakından analiz yardımıyla kalın bölümlerinde muayene ile gösterilen genel göç yolları ötesinde poss olduğuible kriyostat bölümlerinde özel antikorlar kullanarak (Şekil 4). Burada seçilen örnekte analiz etmek için, MBO, böylece memelere girinti (Şekil 4A) çıkan radyal glial süreçlerin düzlemine paralel yatay kesitler hazırlandı. Daha sonra GFP (Şekil 4B) karşı antikorlar vasıtasıyla E12.5 etiketli epitele doğan MBO nöronlar tespit edilmiştir. Beklendiği gibi, antikor MBO hücrelerin sınırlı bir grup (Şekil 4B, 4C ve 4D ok başı) etiketlenmiştir. İki önce (yan) ve (medial) E12.5 sonra doğan MBO nöronlar sırasıyla karşılık gelen lateral ve medial MBO alanlar etiketsiz arasındaki bu grup yer oldu. Örnek olarak, burada neuroepithelium radyal glial süreçleri tek tek etiketli nöronların göç modu göstermek için nestin (Şekil 4C ve 4D kırmızı) karşı bir antikor ile birlikte boyandı.


Şekil 1. Midgestation de Hipotalamus ve Cortex göreli konumları. Sagital (A) ve enine (B) en dorsal ve en yüzeysel ön beyin yapısı, korteks (CTX, mavi) ve en derin olarak gösteren bir midgestation fare embriyo beyin şemaları yerleştirilen ön beyin yapısı, hipotalamus (HY, kırmızı).

Şekil 2,
Şekil 2. Prosedürün diyagramı. (A) hamile baraj anestezi ve rahim maruz. (B) her bir uterin şişlik olarak, plasentaya (siyah ok ucu) tanımlamakplasenta (PL) ve embriyo. ME, mesometrium. (C) sol ve sağ hemisfer kortikal (kırmızı X) ortasında enjeksiyon noktası tanımlayın. (D) üçüncü ventrikül içine DNA çözümü enjekte edilir. (E) iğne elektrot (pozitif) rahim duvarı deler embriyo ve plasental girmesi arasında. Düz elektrot (negatif) rahim serbest tarafında dayanmaktadır. Hipotalamus boyunca pozitif elektrot konumunu gösteren plasental taraftan (F) Kuramsal görünümü. (G) yerini gösteren rahim serbest taraftan göster negatif elektrot.

Şekil 3,
Şekil 3,. Tüm hipotalamus veya bir kısmını transfecting. Dört farklı Kalın titreşimli-mikrotom bölümleriE12.5 floresan muhabiri genleri GFP (A, C) veya CFP (B, D) taşıyan plazmid DNA utero transfeksiyon sonra hipotalamus gösteren vahşi tip E18.5 fare beyinleri. (A) Sagital bölüm (sol rostral) rostral gelen kaudal için transfekte bir hipotalamus gösteren. Ölçek bar 500 mikron. (B) enine kesit. Transfekte tarafında, etiketli hücreleri tüm medio taraflı düzeylerde bulunabilir. (C) Sagital bölümde özellikle transfekte göğüs vücut (kesikli çizgi, yıldız) gösteren ve karakteristik aksonal ağacı (ok başları) etiketlenmesi. (D) enine kesit göğüs vücuda (kesikli çizgi). On Electroporated tarafı (yıldız), E12.5 doğdu nöronlara gelen bir etiketli bant görülebilir. Hy, hipotalamus, Th, talamus

Şekil 4, Şekil 4. Hipotalamik gelişiminde belirli adımlar analiz. Memelere ait gövde (kırmızı) arası gelişmekte olan beyin geçen yatay bir bölümün (A) 'diyagramı. Bölgede gösterilen (B) ve (C) bir çerçeve bulunur. E12 GFP transfeksiyondan sonra E18.5 memelere vücuda bir yatay bölümü üzerindeki GFP (B) antikor etiketlemesi sayılabilir. E12.5 doğan Hücreler çekirdeği ayrı bir bant (ok B, C ve D) oluşturur. Ölçek bar 100 mikron. Bölümünde nöroepitelyal işaretleyici nestin (kırmızı) (C) Antikor etiketleme (B) 'de gösterildiği. Ölçek bar 100 mikron. (D) Bireysel hücreleri yüksek büyütme altında göğüs vücutta belirli E12.5 bandında tespit edilebilir. 20 mikron ölçek çubuğu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anestezi hakkında: Hipotalamus içine utero elektroporasyon teknik olarak zorlu olması ve daha uzun narkoz kez gerektirebilir yana, oksijen ve izofluran karışımı verilmesi ile anestezi neden ve korumak için tercih. Bizim tecrübelerimize göre, hayvanlar en az, annenin iyileşme çok hızlı, ve embriyo hayatta kalma geliştirilmiş bir saat kadar süre bu şekilde uygun anestezi kalabilir. Anestezi için diğer yaklaşımlar da mevcuttur. En basit bir prosedür intraperitoneal enjeksiyon ile narkoz neden olan ve muhafaza oluşur 2,5 0,9 / ml ketamin (25 mg / ml), ksilazin (1.2 mg / ml) ve Acepromazin (0.35 mg / ml) bir karışımı, vücut ağırlığının her kilogramı % steril NaCl ("üçlü açılan"). Tek başına bu karışımı ile, burada tavsiye edilen dozlarda, yaklaşık 30 dakika (bazı durumlarda en fazla 45 dakika) bir narkoz indüklenir. Bu genellikle yeterli E12.5 korteks içine utero elektroporasyon için (inj geçerlateral ventrikülde ection). Bu yöntemin avantajı, tamamen narkoz cihazı ve diğer ekipmanlar için zorunluluğunu ortadan kaldırmasıdır. Cerrahi daha uzun süreler gerekli olan, ancak, periton Bu tür anestezi, anestezi verilen hayvanın de enjeksiyon anestezi süresinin uzatılması amacıyla genellikle ölüm takip edilmektedir, çünkü tavsiye edilmez. İlk narkoz ikna etmek amacıyla "üçlü açılan" (yukarıdaki gibi) bir enjeksiyon kullanarak intraperitoneal ve inhalasyon anestezi birleştirmek mümkündür, daha sonra izofluran / oksijen inhalasyon ile onu korumak. Bu gerekli olduğu gibi, bu özel yöntem ile narkoz uzun süre için muhafaza edilebilir olsa da, operasyon sonrası hamile fare başına geri inhalasyon ile olduğu kadar iyi değildir. Ayrıca, biz "üçlü açılan" intraperitoneal her kullandığınızda, embriyo hayatta kalma azalır.

Embriyo kafasına elektrotların konumlandırılması olarak tasvir

Laparotomi yeterince basittir. Ancak, deneyci düz öğrenme eğrisi sonra embriyoların yüksek hayatta kalma oranı (elektrik darbeleri idaresi takip intraventriküler enjeksiyon sonrası) için izin beceri düzeyini ulaşır. Bireysel beceri genel ve özellikle hipotalamus uygulanmasıdır utero elektroporasyon bazı öğrenciler için tamamen pratik değildir kanıtlamak böylece önemli bir faktördür . Öğrenme süresini kısaltmak için hem de biz yararlı için embriyo sayısı ve konumu hakkında bilgi de dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol ve görünümünü, enjeksiyon kalite ve elektrotların yaklaşık pozisyonu doldurmak için bulduk tekrarlanabilirlik ve istatistiksel analiz artırmak için bireysel embriyolar. Bir embriyo-by-embriyo olarak, kesin sonuçları ile deney hakkında bu verilerin karşılaştırılması anlamak ve prosedür geliştirmek için yararlı olmuştur.

Diğer raporlar 20,21 Nepagene cımbız tipi elektrotlar ile hipotalamus hedef var. Biz sürekli bir iğne-elektrot uygulama ve aynı üreticisi düz kapak-elektrot ile daha iyi sonuçlar elde. Bizim tecrübelerimize göre, bu yöntemin kullanımı kolay hedef postero-kaudal yapar. Cımbız elektrotlar yararlı sonuçlar için ya daha deneyim / beceri ya da deneylerin çok daha fazla sayıda ihtiyaç gibi görünüyor.

jove_content "> gelişmekte olan fare hipotalamus içine DNA yapıları transfekte etmek için en az iki başka yaklaşımlar utero elektroporasyon ile karşılaştırılabilir. ilk bir de embriyonik beyin ventrikül, ilgi konusu DNA olduğu fark olduğu içine laparotomi ve enjeksiyon esas alınmaktadır viral bir parçacık tarafından taşınan virüs nöroepitelyal hücreleri bozar ve bu şekilde bizim deneysel yapı transfects - hiçbir elektroporasyon gereklidir Avantajları:.. prosedürü elektroporasyon için gerekli olan elektrik darbeleri önler, bu nedenle embriyo hayatta kalma muhtemelen artırır Bu yöntemin ana dezavantajı. şunlardır: 1) virüs ile iş özel önlemler ve S2 tesisleri gerektirir; viral parçacıkların (tabii transfeksiyon bir dereceye herhangi nöroepitelyal bölge transfect eşit olasılıkla prensipte yapma tüm ventrikül yayılmış çünkü, hedefleme söz konusu değildir 2) içine ilgi bölge) muhtemeldir. Tabii ki, in utero utero elektroporasyon gibi, deneyci bireysel becerilerine güçlü olarak uzun bir öğrenme eğrisi ile, nispeten zor cerrahi işlem yani temelde aynı sorun teşkil etmektedir.

Bu hamile fare kan akışı içine transfekte etmek için yapıları enjekte dayalı olduğu yaklaşımlar diğer grup, tamamen cerrahi önler. Bölgeye özgü hedefleme bu yöntem ile mümkün olmasa da shRNA 34,35 veya plazmid 36 kuyruk ven (kaudal ven) enjeksiyon, genetik olarak çok erken embriyo işlemek için bir potansiyele sahiptir. Bu umut verici bir yaklaşım henüz genel uygulama için hazır görünmüyor. Yenidoğan farenin (ama daha yaşlı farelerin) arasında yüz damar içine enjekte viral partiküller (adeno-ilişkili virüs) beyin nöronları 37 transfekte edebilmektedir. Son olarak, en sonunda DNA taşıyıcılar olarak kullanılabilir nano-tanecikleri, kuyruk v sonrası beyin ulaşabilirerişkin farelerde 38 ein enjeksiyon. Çok erken embriyo transfecting olasılığını açmak Bu iki yöntem, henüz hamile fareler üzerinde kullanılmış değil, bizim bilgi sahibi olur.

Transfeksiyon ve toplama Yaş: prosedürü öğrenmek için, E14.5 embriyolar transfect çalışın, ve sonra daha önce, daha zor embriyonik çağlara mezun muhtemelen en iyisidir. Bizim tecrübelerimize göre, GFP ifade transfeksiyon sonra zaten UV ışık altında 24 saat görünür. E12.5 transfeksiyon sonra, E18.5 üzerinde GFP ifade çok güçlü. Biz E12.5, E13.5, E14.5 ve E15.5 electroporated ve E17.5, E18.5, P0 ve her durumda güçlü muhabir ifade bulmak mümkün P1 analiz ettik. Beyinleri utero transfekte edilmiştir embriyolar (doğum sonrası veri toplama için) vadeli ulaşmak için izin verildiğinde, bazen seçici anne tarafından yenir. Bu beyin manipülasyon neden olduğu yavru görünüm veya davranış ince değişiklikler (kendi sıcaklığı göstermektedirTure düşük olabilir, ya da belki de) doğru ses sinyalleri yaymaz. Anne itlaf hayatta bu doğum sonrası Hayvanlarda, en az P1 kadar muhabir ifade kadar gözlemledik. Hatta dört ay doğumdan sonra 10 Transfekte yapıları literatürde gösterisi ifade Raporlar.

Elektroporasyon için Vektörler: Bu, örneğin, bir flüoresan raportör cDNA, bir iç ribozom giriş bölgesi (IRES) 40 ile ayrılmış, ilgi geninin cDNA takip CAG promotör 39, tahrik bicistronic muhabir plazmit kullanmak gelişmiş yeşil flüoresan protein 41. CAG organizatörü onları öldürme, transfekte hücreler için çok yüksek DNA seviyeleri üretebilir nöronlarda kadar güçlüdür. Biz transfeksiyon, olası bir çözüm sonrasında büyük apoptoz gözlenen hiçbir zaman olmasına rağmen, sorun görünmelidir, EF1 alfa 42 gibi, daha az verimli organizatörü kullanımı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (Deutsche Forschungsgemeinschaft) tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  REAGENTS
Acepromazine Sanofi GmbH anesthetic
Isoflurane Baxter HDG9623 anesthetic
Ketamin Pharma GmbH anesthetic
Fast Green Fluka 44715  
Rimadyl Pfizer non-steroidal anti-inflammatory
Braunoderm Braun 3887138 povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBS Gibco 14190  
Temgesic (buprenorphine) Essex Pharma opioid analgesic
Eye Ointment Pan-Ophtal 7136926  
Xylazine Bayer  
  EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 Medical Developments Australia ACN 004 903 682  
Capillary puller P-97 Sutter Instrument Co. P-97  
Compresstome Precisionary Instr. VF-300 Vibratome-type device
Confocal Microscope Zeiss LSM700  
Cryostat Leica CM3050S  
Electroporator Nepa Gene Co. Ltd. CUY21EDIT  
Electrode 1 Nepa Gene Co. Ltd. CUY550-10 Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2 Nepa Gene Co. Ltd. CUY700P4L Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light source Leica KL2500 LCD  
Glass capillaries Harvard Apparatus GC120T-15 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizer Fine Science Tools FST250  
Heating pad Harvard Apparatus py872-5272  
Injection device World Precision Instruments Pneumatic Pico Pump PV820  
Suture Thread Coated Vicryl Ethicon V4914 Peritoneal Suture
Suture Thr. Supramid Serag Wiessner TO07171L Skin Suture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
  2. Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
  7. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
  8. Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
  9. Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  12. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  14. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  15. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
  16. Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
  17. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  19. Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  20. Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
  21. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
  22. Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
  23. Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
  24. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
  25. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
  26. Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
  27. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
  28. Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
  29. Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
  30. Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
  31. Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
  32. Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
  33. Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
  34. Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
  35. Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
  36. Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
  37. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  38. Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
  39. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  40. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
  41. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  42. Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).

Tags

Nörobilim Sayı 77 Nörobiyoloji Genetik Hücresel Biyoloji Moleküler Biyoloji Biyomedikal Mühendisliği Gelişim Biyolojisi Anatomi Fizyoloji Embriyo Memeli Beyin Diencephalon Hipotalamus Genetik Teknikleri Transfeksiyon anestezi geliştirme elektrotlar elektroporasyon, Memelere ait gövde fare hayvan modeli
Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, … More

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, N. E., Zhou, X., Alvarez-Bolado, G. Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (77), e50412, doi:10.3791/50412 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter