Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס Published: July 24, 2013 doi: 10.3791/50412
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg, 2Institut de recherches cliniques de Montreal
* These authors contributed equally

Summary

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של ההיפותלמוס,

Abstract

שינוי גנטי של אזורים מסוימים במוח היונקים הפיתוח הוא גישה ניסויית חזקה מאוד. עם זאת, יצירת מוטציות עכבר רומן היא לעתים קרובות מתסכל איטית. הוכח כי הגישה למוח העכבר מתפתח ברחם בהישרדות לאחר ניתוח סביר אפשרית. ובכל זאת, עם תוצאות הליך זה כבר דיווח כמעט אך ורק לחלק השטחי ביותר ונגיש של המוח המתפתח, כלומר את קליפת המוח. התלמוס, אזור צר יותר ויותר המדיאלי, הוכיח קשה יותר ליעד. Transfection לגרעינים עמוקים יותר, במיוחד אלה של ההיפותלמוס, הוא אולי כבר דיווח על התוצאות המאתגרות ביותר, ולכן מעטים מאוד. כאן אנו מדגימים הליך למקד neuroepithelium ההיפותלמוס כולו או חלק ממנו (אזורי ההיפותלמוס) לtransfection באמצעות electroporation. המפתחות לגישה שלנו הם יותר הרדמת פעמים, הזרקה בtתוכי חדר, ואדיב ומיקום של האלקטרודות מתאימים. בנוסף, אנו מציגים תוצאות של מיקוד והניתוח היסטולוגית הבא של גרעין ההיפותלמוס השקוע ביותר, הגוף הפיטמתיים.

Introduction

מניפולציה גנטית של מוח העכבר העוברי היא גישה מועדפת כדי ללמוד על רגולציה התפתחותית. הדור של קווי עכבר מוטציה עם זאת הוא איטי ויקר. שיטה רב עוצמה אחד כדי להציג את השינויים גנטיים ספציפיים בפיתוח תאי עצב במוח היונקים היא electroporation ברחם. בעיקרו של דבר, הטכניקה מורכבת transfecting דנ"א לתוך neuroepithelium המוח העוברי באמצעות פולסים חשמליים, ולאחר מכן מאפשר לעובר לשרוד לתקופה מסוימת של זמן, לאסוף את המוח ולבחון אותם לרומן אפשרי, פנוטיפים אינפורמטיבי. בדרך זו, הנסיין יכול לבחון השערות באופן כמעט מיידי ללא תקופות המתנה הארוכות הנדרשות לייצור מוטציות עכבר.

Transfection של ה-DNA לעוברי מתפתחים התחיל עם ב electroporation אובו בעוברי 1 חומוס. הוכחה של הקונספט החיוני לעכבר בוצע בתרבות ברחם 3,4.

הבעיה העיקרית היא transfect המוח של עוברים מתפתחים ברחם בלי להרוג אותם או האם. למידה כדי לבצע את הניתוח הדרוש (laparotomy, זריקה, electroporation) דורשת תקופת הכשרה ארוכה. לאחר הניתוח כבר שולט לנקודה שבה יחס הישרדות העובר מקובל, שאלת המפתח הבאה היא: שהמבנים מוחיים נגישים? באופן לא מפתיע, את המסמכים הראשונים שפורסמו מראים תוצאות שהושגו עם electroporation ברחם מתמקדים בהתפתחות קליפת המוח 5-9. זה עדיין נכון עבור רוב הפרסומים באמצעות טכניקה זו, שכן האזור במוח העכבר מתפתח הנגיש ביותר לפרוצדורות כירורגיות הוא קליפת המוח (איור 1). ההליך לelectroporation ברחם לתוך קליפת המוח תוארבדפוס 10 ובוידאו 11-14. שינוי של הטכניקה יכול לשמש יעד חלק הגחון של telencephalon, גרעיני בסיס 15.

מעבר telencephalon, diencephalon (מחולק באופן קלאסי לתלמוס וההיפותלמוס) הוא אזור של המוח הקדמי יותר הקשה להגיע. מספר קטן של דיווחי ניירות מיקוד של חלק הגבי ונגיש ביותר שלו, התלמוס 16-19.

ההיפותלמוס הוא חלק הגחון ביותר של המוח הקדמי, ולכן אחד מקומי בצורה העמוקה ביותר מהמשטח הגבי (קליפת המוח) (איור 1). אזור זה עדיין מהווה אתגר קשה לחוקרים שביצעו כדי לתפעל את מוח העכבר ברחם מבחינה גנטית. למיטב ידיעתנו, רק מעט מאוד מאמרים מדווחים על התוצאות בtransfection הרחם אל ההיפותלמוס עכבר 20,21. עם זאת, חשיבותו התפקודית של canno ההיפותלמוסלא להיות מוגזם, שכן הוא מסדיר התנהגויות כמו אכילה ושתייה, חיזור, רבייה והורות 22. יתר על כן, שינויים בפיתוח ההיפותלמוס לתרום למקורן מאוחר יותר בתנאי חיים כמו השמנה, יתר לחץ דם, סוכרת ומפותחת לגיל התבגרות 23. היכולת לשנות גנטי ההיפותלמוס במהלך הפיתוח הייתי לספק כלי חזק מאוד כדי להבין את זה.

הפרוטוקול כירורגית הבסיסית לlaparotomy של עכברים הרה שאנו משתמשים כאן דומה לזה המשמש בפרוטוקולים אחרים 11,13,14,24. נתאר אותן כאן בקצרה לשלמות. מפתח להליך שלנו, לעומת זאת, הם הסוג של הרדמה, את מקומה של זריקה, הסוג של אלקטרודות והחדרה ומיקום של האלקטרודה החיובית ביחס לראשו של העובר. אנחנו מעדיפים לשמור על הרדמה ולגרום באמצעות שאיפת גז על פני הרדמה intraperitoneal פשוטה, שכן לשעבר מאפשריםתקופות ממושכות יותר של הרדמה נדרשות לניתוח קשה. תוצאות isoflurane משאיפת בהתאוששות מהירה יותר מהרדמה, שכן לרוב האם מדגים התנהגות נורמלית כבר דקות לאחר הניתוח. הנקודה הקלה ביותר של זריקה של פתרון ה-DNA עם micropipette הזכוכית היא החדר לרוחב, שעם זאת היא אינו מתאים לחלוטין ליפותלמוס electroporation. הזרקה ישירות בחדר השלישי היא אכן חיונית כדי למקד מבני diencephalic עמוקים. אפשר transfect ההיפותלמוס מE12.0 או E12.5 עם אלקטרודות סטנדרטיות, ה-off-מדף. מצאנו כמה אלקטרודות שיוצרו על ידי NEPA ג'ין (צ'יבה, יפן) המתאימים במיוחד למטרה זו.

עם ההליך שלנו אנו מקבלים transfection של neuroepithelium ההיפותלמוס השלם או החלקית transfection האזורית, בהתאם לאורינטציה של האלקטרודה. כאן אנו מדגימים את הטכניקה על ידי transfecting הגוף הפיטמתיים, ללא ספקהעמוק ביותר והשקוע ביותר של כל גרעיני ההיפותלמוס. בנוסף, אנו מציגים ניתוח היסטולוגית מפורט של תאי transfected עד לרמה התאית של רזולוציה.

ניתן למצוא השוואה של electroporation ברחם עם גישות אחרות לtransfecting המוח המתפתח העכבר ברחם בסעיף הדיון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה של ה-DNA וזכוכית Micropipettes להזרקה

  1. micropipettes זכוכית באיכות טובה הם חיוני כדי להפחית את שיעור הפלות גבוה ראשוני עקב אובדן של מי שפיר. ההליך למשוך micropipettes הזכוכית תועד 13,18,25 היטב. השתמשו בקוטר 1.2 מ"מ נימים משך בסאטר קונבנציונלי P-97 מכשיר עם ההגדרות P = 500; חום = 300; משוך = 40; מהירות = 50; זמן = 50. להתאים את חולץ עם 3 מ"מ חוטים "שוקת" (סאטר Instrument FT330B). את 2 חוטי מ"מ הגודל הניבו עבורנו תוצאות פחות משביעות רצון. מצד השני נראה, beveling של הטיפים micropipette לא כדי לשפר את התוצאות עבורנו.
  2. ממיסים מטוהר ה-DNA, ללא רעלן פנימי פלסמיד ב PBS (כיתה תרבית תאים) המכילה 0.1% מהיר גרין לריכוז סופי של 1 עד 2 מיקרוגרם / μl. גרין המהיר יהפוך את הפתרון המוזרק לעין בחדר המוח העוברי.
  3. טען 10 μl של פתרון ה-DNA לתוך micropipette הזכוכית. חבר את micropipette הזכוכית למערכת ההזרקה (פיקו משאבה) או פיפטה בפה.

2. הרדמה

הכן את השולחן כירורגית עם כרית חימום ואת מכשירי הניתוח. הפעל את מקורות האור קר כדי להקל על ההדמיה של העוברים. לחטא את הכלים כירורגיים באמצעות למשל מעקר חרוז זכוכית.

שלוש פרוצדורות הרדמה שונות אפשרית עבור פרוטוקול זה (ראה דיון). כאן אנו מתארים את אחד אנו רואים את הטוב ביותר, תוך שימוש בשאיפת isoflurane לזירוז הרדמה (קצב זרימה 0.5 ליטר / דקה), כמו גם התחזוקה (ליטר / דקה קצב זרימת 1).

  1. להציג את העכבר בהריון במכל קטן שקוף (כך העכבר נשאר גלוי) מחובר למכשיר ההרדמה Komesaroff מארק 5 באורך של צינורות קצרים.
  2. מלא את מכשיר האדים עם isoflurane, ואז לפתוח את בקבוק החמצן המצורף למכשיר. לפוצץ פולסים אחת או שניים של isoflurane / חמצן (0.5 ליטר / דקה) לתוך המכל מחזיק את העכבר ולצפות להרדמה להגדיר פנימה
  3. קח את העכבר, מכסה את עיניו עם משחה כדי למנוע מהם מהתייבשות ולהתאים את מסכת זרימת ההרדמה על ראשו באופן מיידי.

3. Laparotomy

  1. מניחים את עכבר בטן על כרית החימום (אחרת טמפרטורת הגוף שלו תרד מהר מאוד, ומקטין את סיכויי החלמה) ולאבטח את הגוף שלו למקומו על ידי תיקון ארבע רגליו לצדדים עם קלטת. להעריך את עומק ההרדמה על ידי בדיקה לאובדן של תגובה לגירוי רפלקס (למשל הבוהן או קמצוץ זנב עם לחץ חזק).
  2. לגלח את משטח הבטן ולחטא אותו עם iodophorpovidone יוד (Braunoderm).
  3. לעשות חתך אורכי (עוד 1 עד 1.5 ס"מ) בעור הבטן. ואז לחתוך את הצפק. הנח גזה כותנה סביב החתך. הפוך את קרן רחם אחת לעין ולמשוך אותו החוצה בזהירות עם מלקחיים בוטים על gauz PBS והשטףדואר. שטוף את הרחם עם PBS לעתים קרובות מאוד לשמור עליו תמיד הרטיב (איורים 2 א ו -2). במהלך ההליך כולו להימנע ממשייכת mesometrium או הרחם צר, שכן בתוך הרחם בלחץ גבוה ישדר לעובר להגדיל את הסיכויים של אובדן הנוזלים וכתוצאה מכך על זריקת הפלה.

4. הזרקת DNA לתוך חדר המוח

  1. להחזיק את הרחם בצורה כזו שהחדרים במוח יכולים להיות דמיינו. לא בהרחבה האם למקם את עובר שנמצאת בעמדה שלילית - זה מגדיל את הסיכוי של הפלה בלבד.
  2. כאשר מסתכל על ראשו של העובר מלמעלה, בתרגום חזותי פער או הסדק בין שני חצאים קליפת המוח השמאליים וימניים. האונות הן קלה להבחין וחדרים לרוחב בתוכם (שלא להיות ממוקד) יכולים בדרך כלל להיתפס כצורות מעט כהות יותר. אם עובר נמצא להיות מכוון בצורה מושלמת להזרקת ה-DNA (Figures 2C ו 2D), זה אפשרי כדי לחדור את דופן הרחם ולהיכנס לחדר השלישי ובעונה אחת. החזק את micropipette הכוס ב 45 מעלות לקיר ולנקב אותו בסוף מקורי של הפער בין ההמיספרות בקליפת המוח הרחם, לחדור לכ 1 מ"מ. בדרך זו קצה micropipette הזכוכית ייכנס לחדר השלישי של המוח (לא חדר לרוחב) (איורים 2 ג ו 2D). בעוברים פחות נוחה בכיוון זה שימושי הראשון פירס דופן הרחם (תמיד על 45 מעלות) בסביבתו של הראש העוברי, מקום קצה micropipette במיקום הנכון בין שני חצאים קליפת המוח, ורק לאחר מכן לנקב את המוח. הזרק על μl 1 של פתרון ה-DNA לתוך החדר השלישי (זריקה טובה ממלאת את החדר בנוזל ירוק). חזור על אותו התהליך עם כל העוברים של קרן רחם אחד. זה מאפשר קצת זמן לפתרון ה-DNA כדי לערבב באופן שווה עם נוזל חדרית ולהגיע entirneuroepithelium הדואר.

5. מיקוד היפותלמוס לElectroporation

  1. לעבור electroporator ובלהתאים את ההגדרות בהתאם לגיל העוברי (לE12.5 אנו משתמשים 5 פולסים מרובעים גל, 50 V, 50 אלפיות השני ON/950 אלפיות OFF). השתמש כקוטב חיובי האלקטרודה מחט הנירוסטה (CUY550-10) וכקוטב שלילי האלקטרודה עגולה ושטוחה (CUY700P4L). (חשוב שהאלקטרודות הם קטנות יותר מאשר את העובר, שכן אחרת הנוכחי פשוט זורמת סביב העובר, אבל לא דרכו.)
  2. בחר עבור electroporation אותם העוברים הגבי צד הוא למעלה (כלומר פנה הנסיין) (כמו רובם), ולמחוק את אלה שנטייה שלו היא לא חיובי. עכשיו זה בטוח לגעת ברחם עם אצבעות אתנול חיטוי או עם כפפות. מחזיק את הרחם עם מלקחיים, לעומת זאת, הייתי מפריע לזרימה של זרם במהלך electroporation.
  3. פירס דופן הרחם על ידי ראשו של העובר בין א.מ.נ.השק iotic ושליה על ידי דחיפה כלפי מטה דרכו עם הקצה של האלקטרודה המחט. השתמש באצבע המורה של היד השנייה כמקשה דחף. בערך 5 מ"מ של קצה האלקטרודה חייב להיות עכשיו בין השק מי השפיר ודופן הרחם, בערך ברמה של המוח התיכון (איורים 2E ו2F). זכור כי זה "מיקוד אלקטרודה", כך עמדתו תהיה לקבוע איזה חלק מההיפותלמוס neuroepithelium הוא הסיכוי טוב ביותר להשיג transfected. העובר צריך להיות בעדינות רבה "סחט" בין האלקטרודות.
  4. עם מצד השני, עמדת האלקטרודה העגולה והשטוחה מחוץ לקיר הרחם בצד השני של ראשו של העובר (2E ו 2G דמויות).
  5. השתמש במתג הדוושה כדי להחיל מתח (50 וולט, 50 אלפיות שנייה ON, 950 אלפיות השני OFF, 5 פולסים מרובעים גל).
  6. לאט לאט למשוך את האלקטרודה המחט מחוץ לרחם תוך מתאפק הרחם עם אצבע המורה של היד השנייה - אם בדיקה מי שפירנוזל הטיק הולך לאיבוד דרך הקיר המנוקב, בדרך כלל את העובר יעבור הפלה. לחזור על התהליך עם כל העוברים.
  7. להחזיר את קרן הרחם לתוך הבטן ולחזור על ההזרקה וelectroporation בצופר השריד.

6. גמר הניתוח

  1. לאחר ההזרקה וelectroporation של כל העוברים, הצב את הרחם בחזרה לתוך הבטן בזהירות רבה, ממוקם בדיוק כפי שהיו לפני ולח חלל הצפק עם מי מלח לפני שתסגרו אותו.
  2. תפר את הצפק עם מיתר כירורגית (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). לסגירתו של שימוש עור "קטע את התפר" methodwith תפר עמיד יותר (ניילון Supramid, 6-0, Serag Wiessner ל07171L).
  3. לחטא את משטח הבטן עם povidone-יוד (Braunoderm) ולהזריק ללא סטרואידים אנטי דלקתי תת עורי (לדוגמה: 100 μl של פתרון 1:10 Rimadyl ב0.9% NaCl) או, אפילו טוב יותר, כמו אופיואידים buprenorphine (Temgesic, 0.05-0.1 משקל גוף מ"ג / ק"ג ב0.9% NaCl) כדי להקל על כאב.
  4. הסר את האמא מהמכונה ההרדמה ולמקם אותו בכלוב אשר מחומם על ידי כרית חימום. לפקח על העכבר ללא הרף עד שהוא התאושש לגמרי מההרדמה. בשלב מאוחר יותר, לבדוק את החיות היומיות כדי להבטיח שהם מתאוששים מההליך ללא כל סימן לזיהום או כאב.

7. ניתוח התוצאות

  1. לקצור את העוברים (או postnatals) לפי היום הרצוי של ניתוח. עכברים לאחר לידה (יום 1 עד 2 ישן) הם נהרגו על ידי עריפת ראש.
  2. הפרד כל עובר על פי ביאור electroporation הקודם. מנתחים את המוח תחת stereomicroscope ולבדוק מתחת למיקרוסקופ לאות פלואורסצנטי ירוקה (GFP מהכתב) באזור המתאים.
  3. המוח שנבחר יכול להיות מנותח "טרי": לתקן הרקמות לזמן קצר בparaformaldehyde 4% ולהטביע ב% agarose 4 או בג'לטיןlbumin, ולאחר מכן חלק על מכשיר vibratome סוג (איור 3). לניתוח מפורט יותר immunohistochemical (איור 4), cryo-להגן על המוח בפתרון saccharose 30%, להטביע בהרכבה בינונית אוקטובר (רקמות Tek) לאחר מכן לחתוך את 20 סעיפי מיקרומטר בcryostat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רוב הנוירונים היפותלמוס נולדים בין E11.5 לE15.2, על פי ניתוח היכרויות לידה בעכברוש 26 מתורגמים לפיתוח עכבר 27,28 הקצר יותר במקצת. השיא של neurogenesis ההיפותלמוס הוא הגיע בE12.5 29-31. בהתאם לכך, בגיל transfection נבחר למחקר הנוכחי (E12.5), יכול להיות מתויג בחלק גדול של תאי עצב ההיפותלמוס בכל רמת rostro-הזנב נתון.

ניתוח בE18.5 על סעיפי vibratome מסוג עבים (איורים 3 א ו 3 ב) מראה כי הארכת rostro-הזנב השלם של neuroepithelium ההיפותלמוס היא נגישה לelectroporation (איור 3 א). בכל גיל נתון, יכולים להיות מתויגים נוירונים בכל רמות Medio-הרוחביים (איור 3), בהסכם עם מחקרי שושלת 32. הגוף הפיטמתיים (MBO) הוא גרעין עצבי מתפתח מneuroepithelium בתור הפסקה בventra ביותרL וחלק הזנב של המוח הקדמי. זה הופך את MBO בעיקרון קשה מאוד ליעד. מבחינה תפקודית, MBO הוא מבנה מרכזי לגיבוש זיכרון ותוצאותיה ניוון פתולוגיים באמנזיה אנטרוגרדית 33. אנחנו כבר מסוגלים transfect פלסמידים כתב מאוד ספציפית לגרעין זה (האיורים 3C ו3D). נוירונים MBO להאריך האקסונים יוצרים שני שטחים חשובים מאוד אופייניים ופונקציונליים שגם הם שכותרתו לאחר transfection (ראשי חץ באיור 3 ג). סעיפים רוחביים מראים כי תאי העצב שנולדו בE12.5 (גיל transfection) יוצרים "שכבה" מעוגלת סביב מסה הלא מסומנת של נוירונים שנוצרו קודם לכן (כלומר לפני ניסוי transfection התקיים) (איור 3D).

מעבר לדפוסי ההגירה הכלליים שמוצגים על ידי בדיקה בחלקים עבים עם העזרה של חלבוני כתב ניאון, ניתוח מדוקדק יותר של התוצאות הוא poss ible באמצעות נוגדנים ספציפיים על סעיפי cryostat (איור 4). כדי לנתח את הדוגמא שבחרה כאן, MBO, הכנו קטעים אופקיים מקבילים למישור של תהליכי גלייה רדיאלי הנובעים מההפסקה הפיטמתיים (איור 4 א). לאחר מכן, אנו זיהינו את הנוירונים MBO שנולדו מneuroepithelium הכותרת על E12.5 באמצעות נוגדנים כנגד ה-GFP (איור 4). כצפוי, הנוגדן שכותרתו קבוצה מצומצמת של תאי MBO (ראש החץ בדמויות 4B, 4C, ו4D). בקבוצה זו הייתה ממוקמת בין שני אזורים ללא תווית MBO לרוחב ו המדיאלי מתאימים בהתאמה לנוירונים MBO שנולדו לפני (לרוחב) ואחרי (מדיאלי) E12.5. כדוגמה, הנה אנחנו שיתוף מוכתם עם נוגדן נגד nestin (אדום בדמויות 4C ו 4D) כדי להציג את מצב ההגירה של תאי עצב שכותרתו בנפרד על תהליכי גליה רדיאלי של neuroepithelium.

לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 1
איור 1. מיקומים יחסיים של ההיפותלמוס וקליפת המוח בmidgestation. sagittal () ורוחביים (ב ') דיאגרמות של המוח של עובר עכבר midgestation מראה את מבנה המוח הקדמי הגבי ביותר והשטחי ביותר, קליפת המוח (CTX, כחול), כמו גם עמוק ביותר להציב מבנה מוח קדמי, ההיפותלמוס (ח.י., אדום).

איור 2
איור 2. תרשים של ההליך. () סכר ההריון הוא מורדם והרחם חשוף. (ב) בכל אחד מנפיחות רחם לזהות את הכניסה השליה (ראש החץ שחור),שליה (PL) ועובר. ME, mesometrium. (ג) זהה את נקודת ההזרקה באמצע של ההמיספרות הימנית והשמאלית בקליפת המוח (X האדום). (ד ') הזרק פתרון ה-DNA לחדר השלישי. (ה) אלקטרודת המחט (חיובי) מפלח את דופן הרחם בין העובר ושלית הכנסה. האלקטרודה שטוחה (שלילי) מוטלת בצד החופשי של הרחם. (F) תצוגה היפותטי מהצד השליה מראה מיקום של האלקטרודה החיובית לאורך ההיפותלמוס. (G) צפה מהצד ללא הרחם מראה את המיקום של האלקטרודה שלילית.

איור 3
איור 3. Transfecting כל ההיפותלמוס או חלק ממנה. סעיפים רוטטים-microtome עבים של ארבעה אחריםE18.5 מוח עכבר סוג בר מראה ההיפותלמוס לאחר בtransfection הרחם של ה-DNA פלסמיד שנשא ניאון כתב גנים GFP (A, C) או CFP (ב ', ד') בE12.5. () סעיף sagittal (מקורי משמאל) מראה ההיפותלמוס transfected מהמקורי לזנב. 500 מיקרומטר בר סולם. (ב) סעיף רוחבי. בצד transfected, ניתן למצוא תאים שכותרתו בכל רמות Medio-הרוחב. (ג) סעיף sagittal מראה גוף הפיטמתיים transfected במיוחד (קו מקווקו, כוכבית) וסימון של עץ axonal האופייני שלה (ראשי חץ). (ד) סעיף רוחבי דרך הגוף הפיטמתיים (קו מקווקו). ביום ניתן לראות את צד electroporated (כוכבית), להקה שכותרתו מקבילה לנוירונים שנולדו בE12.5. היי, ההיפותלמוס, ה ', התלמוס

איור 4 איור 4. ניתוח שלבים ספציפיים בהתפתחות ההיפותלמוס. () דיאגרמה של סעיף אופקי דרך המוח המתפתח מראה את הגוף הפיטמתיים (אדום). האזור מתואר ב( ב) ו (ג) הוא ממוסגר. (ב ') תיוג נוגדן ה-GFP בקטע אופקי דרך הגוף הפיטמתיים E18.5 לאחר transfection GFP בE12. תאים שנולדו בE12.5 להקים להקה ייחודית בגרעין (ראש החץ בB, C ו-D). בקנה מידה בר 100 מיקרומטר. (ג) תיוג נוגדן של neuroepithelial הסמן nestin (אדום) בקטע שמוצג ב( ב '). בקנה מידה בר 100 מיקרומטר. (ד ') ניתן לזהות תאים בודדים בE12.5 הלהקה הספציפית בגוף הפיטמתיים בהגדלה גבוהה. בר סולם 20 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לגבי ההרדמה: מאז electroporation ברחם ליפותלמוס יכול להיות מבחינה טכנית מפרך ודורש פעמים הרדמה ארוכות יותר, אנחנו מעדיפים לשמור על הרדמה ולגרום באמצעות ממשל מתערובת של חמצן וisoflurane. מניסיוננו, חיות יכולות להישאר כראוי מורדמות בדרך זו לתקופות של עד שעה אחת לפחות, ההתאוששות של האמא היא מאוד מהירה, והישרדות עובר השתפרה. גישות אחרות להרדמה הן גם זמינות. ההליך הפשוט ביותר מורכב מגרימה ושמירה על הרדמה על ידי זריקת intraperitoneal של 2.5 מ"ל / ק"ג ממשקל גוף של תערובת של קטמין (25 מ"ג / מ"ל), Xylazin (1.2 מ"ג / מ"ל) וAcepromazin (0.35 מ"ג / מ"ל) ב0.9 סטרילי% NaCl ("משולב משולש"). עם תערובת זו לבדה, במינונים המומלצים כאן, הרדמה של כ -30 דקות (עד 45 דקות בחלק מהמקרים) מושרה. זה בדרך כלל מספיק עבור electroporation ברחם לתוך קליפת המוח בE12.5 (באמצעות injection בחדר לרוחב). יתרונה של שיטה זו הוא שהיא מונעת את הצורך בהרדמה-מכשיר וציוד אחר לחלוטין. עם זאת, זה סוג של ההרדמה intraperitoneal זה לא מומלץ אם זמנים ארוכים יותר של ניתוח הם הכרחיים, שכן זריקות נוספות בבעלי החיים מורדמים על מנת להאריך את תקופת ההרדמה לעתים קרובות ואחרי מותו. כמו כן ניתן לשלב intraperitoneal והרדמת משאיפת באמצעות הזרקה של "משולב המשולש" (כאמור לעיל) הראשון כדי לגרום להרדמה, ואז לשמור אותו על ידי שאיפה של isoflurane / חמצן. למרות שעם שיטה מסוימת זה ההרדמה יכולה להישמר במשך זמן רב ככל שהוא נדרש, ההתאוששות של העכבר בהריון לאחר הניתוח היא לא טובה כמו עם שאיפה בלבד. חוץ מזה, בכל פעם שאנו משתמשים "משולב המשולש" זריקת intraperitoneal, הישרדות עובר יורדת.

המיקום של האלקטרודות על ראשו של העובר כמתואר ב

Laparotomy הוא פשוט למדי. עם זאת, הנסיין מגיע לרמת מיומנות המאפשרת יחס הישרדות גבוהה של עוברים (לאחר הזרקה תוך חדרי ואחריו הממשל של פולסים חשמליים) לאחר עקומה למידה שטוחה. מיומנות אישית היא גורם חשוב בכך שelectroporation ברחם באופן כללי ויישומה ליפותלמוס בפרט יכול להוכיח לחלוטין לא מעשי עבור חלק מהתלמידים . כדי לקצר את תקופת הלימוד, כמו גם להגדיל את שחזור וניתוח סטטיסטי שמצאנו את זה שימושי כדי למלא פרוטוקול מפורט הכוללים מידע על המספר והמיקום של העוברים, ואת המראה, איכות ההזרקה ומיקום משוער של אלקטרודות ל את העוברים הבודדים. ההשוואה בין נתונים אלה על הניסוי עם את התוצאות הסופיות, על בסיס עובר אחר עובר הוכיחה שימושית כדי להבין ולשפר את ההליך.

דיווחים אחרים 20,21 מיקדת ההיפותלמוס עם אלקטרודות פינצטה מסוג Nepagene. אנחנו באופן עקבי להשיג תוצאות טובות יותר עם היישום של אחד מחט האלקטרודה וכיסוי שטוחה אלקטרודה אחת מאותו היצרן. מניסיוננו, השימוש בשיטה זו הופכת את rostro-הזנב מיקוד קל יותר. נראות אלקטרודות Tweezer לדרוש גם יותר ניסיון / מיומנות או מספר גדול בהרבה של ניסויים על מנת להניב תוצאות שימושיות.

jove_content "> לפחות שתי גישות אחרות לtransfect בונה DNA ליפותלמוס עכבר פיתוח ניתן להשוות electroporation ברחם. הראשון מבוססת גם על laparotomy והזרקה לתוך חדר המוח העוברי, ההבדל הוא כי ה-DNA של עניין הוא נישאו על ידי חלקיקים נגיפיים הנגיף מדביק את תאי neuroepithelial ובדרך זו transfects המבנה הניסיוני שלנו - אין צורך בשום electroporation יתרונות:.. ההליך ימנע את פולסים החשמליים הנדרשים לelectroporation, ולכן הישרדות עובר כנראה משפרת את החסרונות העיקריים של שיטה זו. הם: 1) עבודה עם וירוסים דורשת אמצעי זהירות מיוחד ומתקני S2, 2) מיקוד הוא לא באו בחשבון, שכן חלקיקים נגיפיים יתפשטו על פני כל החדר שהופכים אותו באופן עקרוני באותה מידה סביר transfect כל אזור neuroepithelial (כמובן מידה מסוימת של transfection לאזור של עניין הוא סביר). כמובן, ברחם בelectroporation ברחם, כלומר את הליך הניתוח הקשה יחסית, עם עקומה למידה ארוכה תלוי במידה רבה בכישורים האישיים של הנסיין.

קבוצה האחרת של גישות ניתוח ימנע לחלוטין, שכן היא מבוססת על הזרקה של המבנים לtransfect לתוך הזרם של העכבר בהריון הדם. זנב וריד הזרקה (וריד הזנב) של shRNA 34,35 או פלסמידים 36 יש את פוטנציאל מניפולציות גנטי עוברים מוקדמים מאוד, אם כי מיקוד ספציפי לאזור אינו אפשרי בשיטה זו. גישה זו מבטיחה לא נראית מוכנה עדיין לשימוש כללי. חלקיקים נגיפיים (adeno הקשורים וירוס) המוזרקים בוריד הפנים של עכברי יילודים (אך לא עכברים מבוגרים) הוא מסוגלים transfect הנוירונים במוח 37. לבסוף, חלקיקים, שסופו של דבר יכול לשמש כנשאים DNA, יכולים להגיע למוח אחרי הזנב Vהזרקת עין בעכברים בוגרים 38. שתי שיטות אלה, הפותחים את האפשרות של transfecting עוברים מוקדם מאוד, יש למיטב ידיעתנו טרם השתמש בעכברים בהריון.

גיל transfection ואוסף: ללימוד ההליך, זה כנראה הכי טוב כדי לנסות transfect E14.5 עובר, ולאחר מכן להתקדם לגילים מוקדמים יותר, קשים יותר עובריים. מניסיוננו, הביטוי של GFP גלוי תחת אור UV כבר 24 שעות לאחר transfection. לאחר E12.5 transfection, הביטוי של GFP על E18.5 הוא חזק מאוד. יש לנו בelectroporated E12.5, E13.5, E14.5, וE15.5 ונותחו בE17.5, E18.5, P0 P1 ולהיות מסוגל למצוא את הביטוי חזק כתב בכל המקרים. כאשר עוברים שמוחה כבר transfected ברחם מותר להגיע לטווח (לאיסוף נתונים לאחר לידה), לפעמים הם נאכלים באופן סלקטיבי על ידי האם. הדבר מצביע על שינויים עדינים במראה גור או התנהגות הנגרמים על ידי מניפולציה המוח (טמפרהמכשור יכול להיות נמוך יותר, או שאולי הם אינם פולטים אותות הצליל הנכונים). באותם בעלי חיים ששורדים לאחר הלידה קולינג האימהי, ראו ביטוי עיתונאי עד P1 לפחות. דיווחים בביטוי תכנית הספרות של מבני transfected אפילו ארבעה חודשים לאחר לידת 10.

וקטורים לelectroporation: אנו משתמשים בפלסמידים כתב bicistronic מונעים על ידי אמרגן החטיבה 39, ואחריו cDNA של הגן של עניין, מופרד על ידי אתר הריבוזום כניסה פנימי (IRES) 40, מcDNA של כתב ניאון, למשל המשופר חלבון פלואורסצנטי ירוק 41. אמרגן החטיבה הוא כל כך חזק בתאי עצב, כי זה יכול לגרום לרמות גבוהה מדי של ה-DNA לתאי transfected, והרג אותם. למרות שמעולם לא נצפו אפופטוזיס המסיבי לאחר transfection, פתרון אפשרי, אמורה להופיע הבעיה, יהיה שימוש באמרגן פחות יעיל, כמו EF1 אלפא 42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר הגרמני (דויטשה Forschungsgemeinschaft).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  REAGENTS
Acepromazine Sanofi GmbH anesthetic
Isoflurane Baxter HDG9623 anesthetic
Ketamin Pharma GmbH anesthetic
Fast Green Fluka 44715  
Rimadyl Pfizer non-steroidal anti-inflammatory
Braunoderm Braun 3887138 povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBS Gibco 14190  
Temgesic (buprenorphine) Essex Pharma opioid analgesic
Eye Ointment Pan-Ophtal 7136926  
Xylazine Bayer  
  EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 Medical Developments Australia ACN 004 903 682  
Capillary puller P-97 Sutter Instrument Co. P-97  
Compresstome Precisionary Instr. VF-300 Vibratome-type device
Confocal Microscope Zeiss LSM700  
Cryostat Leica CM3050S  
Electroporator Nepa Gene Co. Ltd. CUY21EDIT  
Electrode 1 Nepa Gene Co. Ltd. CUY550-10 Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2 Nepa Gene Co. Ltd. CUY700P4L Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light source Leica KL2500 LCD  
Glass capillaries Harvard Apparatus GC120T-15 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizer Fine Science Tools FST250  
Heating pad Harvard Apparatus py872-5272  
Injection device World Precision Instruments Pneumatic Pico Pump PV820  
Suture Thread Coated Vicryl Ethicon V4914 Peritoneal Suture
Suture Thr. Supramid Serag Wiessner TO07171L Skin Suture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
  2. Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
  7. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
  8. Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
  9. Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  12. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  14. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  15. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
  16. Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
  17. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  19. Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  20. Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
  21. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
  22. Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
  23. Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
  24. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
  25. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
  26. Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
  27. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
  28. Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
  29. Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
  30. Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
  31. Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
  32. Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
  33. Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
  34. Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
  35. Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
  36. Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
  37. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  38. Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
  39. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  40. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
  41. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  42. Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).

Tags

Neuroscience גיליון 77 נוירוביולוגיה גנטיקה ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית הנדסה ביו רפואית ביולוגיה התפתחותית אנטומיה פיזיולוגיה העובר יונקים מוח diencephalon ההיפותלמוס טכניקות גנטיות Transfection הרדמה פיתוח אלקטרודות electroporation, גוף הפיטמתיים עכבר מודל חיה
מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, … More

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, N. E., Zhou, X., Alvarez-Bolado, G. Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (77), e50412, doi:10.3791/50412 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter