Summary
Nonostante l'importanza funzionale e mediche dell'ipotalamo,
Abstract
Modificazione genetica di specifiche regioni del cervello dei mammiferi è sviluppare un approccio sperimentale molto potente. Tuttavia, generando nuovi mutanti di topo è spesso frustrante lentezza. È stato dimostrato che l'accesso al cervello di sviluppo del mouse in utero con ragionevole sopravvivenza post-operatoria è possibile. Ancora, risultati con questa procedura sono stati riportati quasi esclusivamente per la parte più superficiale e facilmente accessibile del cervello di sviluppo, cioè la corteccia. Il talamo, una regione stretto e più mediale, è dimostrato più difficile da bersaglio. Trasfezione in nuclei più profondo, specialmente quelli dell'ipotalamo, è forse il risultato più impegnative e, pertanto, molto pochi sono stati segnalati. Qui mostriamo una procedura per individuare l'intera neuroepitelio ipotalamica o parte di essa (regioni ipotalamiche) per trasfezione mediante elettroporazione. Le chiavi del nostro approccio sono più volte narcosi, l'iniezione in tHird ventricolo, e tipo e posizionamento degli elettrodi appropriata. Inoltre, vi mostriamo i risultati di targeting e la successiva analisi istologica del nucleo ipotalamico più incassata, il corpo mammillary.
Introduction
Manipolazione genetica del cervello di topo embrionale è un approccio preferito per conoscere regolazione dello sviluppo. La generazione di linee mutanti topo però è lento e costoso. Un metodo efficace per introdurre specifici cambiamenti genetici nello sviluppo di neuroni del cervello dei mammiferi è elettroporazione in utero. In sostanza, la tecnica consiste transfecting DNA nel cervello embrionale neuroepithelium mediante impulsi elettrici, consentendo quindi l'embrione di sopravvivere per un certo periodo di tempo, raccogliere il cervello e li esamini per possibili romanzo, fenotipi informativi. In questo modo, l'sperimentatore può verificare ipotesi quasi immediatamente senza i lunghi periodi di attesa necessari per la produzione di mutanti di topo.
Trasfezione di DNA in via di sviluppo è iniziato con embrioni in elettroporazione ovo su embrioni di pollo 1. L'essenziale proof-of-concept per il mouse è stata eseguita in cultura
Il problema principale è quello di transfettare il cervello di embrioni in via di sviluppo in utero senza ucciderli o della madre. Apprendimento per eseguire l'intervento necessario (laparotomia, iniezione, elettroporazione) richiede un lungo periodo di formazione. Una volta che l'intervento chirurgico è stato masterizzato al punto in cui il rapporto di sopravvivenza degli embrioni è accettabile, la prossima domanda chiave è: quali strutture cerebrali sono accessibili? Non a caso, i primi documenti pubblicati mostrano risultati ottenuti con elettroporazione in utero focalizzati su sviluppo corticale 5-9. Questo è ancora vero per la maggior parte delle pubblicazioni utilizzando questa tecnica, poiché la regione del cervello di sviluppo del mouse più accessibile per procedure chirurgiche è la corteccia (Figura 1). La procedura per elettroporazione in utero nella corteccia è stata descrittain stampa 10 e in video 11-14. Una modifica della tecnica può essere utilizzata per indirizzare una parte ventrale del telencefalo, i gangli della base 15.
Al di là del telencefalo, il diencefalo (classicamente suddiviso in talamo e ipotalamo) è una regione del prosencefalo più difficile da raggiungere. Un piccolo numero di documenti di report di targeting della sua parte dorsale e più accessibile, il talamo 16-19.
L'ipotalamo è la parte più ventrale del prosencefalo, quindi quello localizzato più profondamente dalla superficie dorsale (corteccia) (Figura 1). Questa regione rimane una sfida difficile per i ricercatori impegnati a manipolare geneticamente il cervello di topo in utero. A nostra conoscenza, solo pochissimi articoli riferire sui risultati di in utero trasfezione nell'ipotalamo del mouse 20,21. Tuttavia, l'importanza funzionale dell'ipotalamo cannot essere sottovalutata, in quanto regola i comportamenti come il mangiare e il bere, l'accoppiamento, l'allevamento e la genitorialità 22. Inoltre, alterazioni dello sviluppo dell'ipotalamo contribuiscono ad originare in seguito a condizioni di vita come l'obesità, l'ipertensione, il diabete e la pubertà precoce 23. Essere in grado di modificare geneticamente l'ipotalamo durante lo sviluppo potrebbe fornire uno strumento molto potente per capirlo.
Il protocollo chirurgico di base per la laparotomia di topo gravide che utilizziamo qui è simile a quella utilizzata in altri protocolli 11,13,14,24. Noi li descrivono brevemente qui per completezza. Chiave del nostro procedimento, invece, sono il tipo di anestesia, il luogo di iniezione, del tipo di elettrodi e l'inserimento e la posizione dell'elettrodo positivo rispetto alla testa del embrione. Preferiamo indurre e mantenere l'anestesia per inalazione gas su semplice anestesia intraperitoneale, poiché il primo consente l'un po 'più lunghi periodi di narcosi necessari per un intervento chirurgico difficile. Risultati inalazione isoflurano in veloce recupero dall'anestesia, dal momento che di solito la madre dimostra un comportamento normale già minuti dopo l'intervento chirurgico. Il più facile punto di iniezione della soluzione di DNA con la micropipetta di vetro è il ventricolo laterale, che però è completamente inadatto per ipotalamo elettroporazione. Iniezione diretta del terzo ventricolo è infatti cruciale per indirizzare le strutture diencefaliche profonde. È possibile trasfettare all'ipotalamo da E12.0 E12.5 o con elettrodi standard, off-the-shelf. Abbiamo trovato alcuni degli elettrodi fabbricati da Nepa Gene (Chiba, Giappone) particolarmente adatta a questo scopo.
Con la nostra procedura otteniamo trasfezione di tutta neuroepitelio ipotalamica o parziale, trasfezione regionale a seconda dell'orientamento elettrodo. Qui mostriamo la tecnica transfettando corpo mammillary, discutibilmenteil più profondo e incasso di tutti i nuclei ipotalamici. Inoltre, mostriamo analisi istologica dettagliata delle cellule trasfettate giù al livello cellulare di risoluzione.
Un confronto di elettroporazione in utero ad altri procedimenti di trasfezione sviluppo cerebrale topo in utero può essere trovata nella sezione di discussione.
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Protocol
1. Preparazione del DNA e vetro Micropipette per Iniezione
- Buone micropipette di vetro di qualità sono essenziali per ridurre il tasso iniziale aborto elevato a causa della perdita di liquido amniotico. La procedura di tirare micropipette di vetro è stato ben documentato 13,18,25. Uso 1.2 mm di diametro capillari tirato in un convenzionale Sutter P-97 dispositivo con le impostazioni P = 500; calore = 300; Pull = 40; Velocità = 50; Tempo = 50. Montare l'estrattore con 3 millimetri filamenti "di valle" (Sutter Instrument FT330B). Le due millimetri filamenti dimensioni hanno prodotto per noi i risultati meno soddisfacenti. D'altra parte, smussatura della micropipetta punte non sembra migliorare i risultati per noi.
- Sciogliere purificato, DNA plasmidico privo di endotossine in PBS (Cell Culture Grade) contenente 0,1% Verde fast ad una concentrazione finale di 1 a 2 mg / mL. Il oVerde renderà la soluzione iniettata visibile nel ventricolo cerebrale embrionale.
- Carico 10 microlitri della soluzione di DNA nel micropipetta di vetro. Collegare la micropipetta di vetro al sistema di iniezione (pompa Pico) o bocca pipetta.
2. Anestesia
Preparare il tavolo chirurgico con una piastra elettrica e gli strumenti chirurgici. Accendere le sorgenti di luce fredda per facilitare la visualizzazione degli embrioni. Disinfettare gli strumenti chirurgici utilizzando per esempio una perlina di vetro sterilizzatore.
Sono possibili tre diverse procedure di anestesia per questo protocollo (vedi discussione). Qui descriveremo quello che consideriamo il meglio, utilizzando inalazione isoflurano per l'induzione dell'anestesia (portata 0,5 l / min) e di manutenzione (portata 1 l / min).
- Introdurre il mouse incinta in un piccolo trasparente (così il mouse rimane visibile) contenitore collegato al Komesaroff Mark 5 anestetico dispositivo da un breve tratto di tubo.
- Riempire il vaporizzatore con isoflurano, quindi aprire la bombola di ossigeno collegato al dispositivo. Saltare uno o due impulsi di isoflUrane / ossigeno (0,5 l / min) nel contenitore tenendo premuto il mouse e guardare per narcosi a prendere piede
- Prendete il mouse fuori, coprire gli occhi con unguento per evitare che si secchi e si adattano la maschera anestesia flusso sulla sua testa immediatamente.
3. Laparotomia
- Posizionare il mouse a pancia in su sul pad riscaldamento (altrimenti la sua temperatura corporea scende molto velocemente, diminuendo le possibilità di recupero) e fissare il suo corpo in posizione fissando le sue quattro gambe ai lati con del nastro adesivo. Valutare la profondità dell'anestesia controllando per la perdita di risposta alla stimolazione riflessa (es. punta o la coda pizzico con una forte pressione).
- Radersi la superficie addominale e disinfettarlo con il iodophorpovidone-iodio (Braunoderm).
- Effettuare una incisione longitudinale (lungo da 1 a 1,5 cm) sulla cute addominale. Poi tagliare il peritoneo. Posizionare garza di cotone intorno alla incisione. Fai un corno uterino visibile ed estrarlo con cautela con una pinza smussato sulla PBS-risciacquato gauze. Risciacquare dell'utero con PBS molto spesso per mantenerlo sempre inumidito (Figure 2A e 2B). Durante l'intera procedura di evitare di tirare il mesometrio o dell'utero stretto, poiché l'alta pressione all'interno dell'utero trasmetterà all'embrione aumentando le probabilità di perdita di fluido in fase di iniezione con conseguente aborto.
4. Iniezione DNA nel ventricolo cerebrale
- Tenere l'utero in modo tale che i ventricoli cerebrali possono essere visualizzati. Non estesamente riposizionare un embrione che si trova in una posizione sfavorevole - questo aumenta solo le probabilità di aborto.
- Guardando la testa dell'embrione dall'alto, localizzare visivamente il gap o fessura tra gli emisferi corticali destro e sinistro. Gli emisferi sono facili da distinguere e ventricoli laterali al loro interno (per non essere presi di mira) di solito possono essere percepite come forme un po 'più scuri. Se un embrione è risultato essere perfettamente orientato per l'iniezione del DNA (Figures 2C e 2D), è possibile perforare la parete uterina e entrano nel terzo ventricolo in una volta. Tenere la micropipetta di vetro a 45 ° rispetto alla parete uterina e puntura alla fine rostrale del divario tra emisferi corticali, penetrando per circa 1 mm. In questo modo la punta della micropipetta di vetro entrerà nel terzo ventricolo del cervello (non il ventricolo laterale) (Figure 2C e 2D). In embrioni meno favorevolmente orientati è utile prima perforare la parete uterina (sempre a 45 °) in prossimità della testa embrionale, posizionare la punta micropipetta nella giusta posizione tra gli emisferi corticali e solo allora perforare il cervello. Iniettare circa 1 ml di soluzione di DNA nel terzo ventricolo (una buona iniezione riempie il ventricolo con liquido verde). Ripetere la stessa procedura con tutti gli embrioni di un corno dell'utero. Questo permette un certo tempo per la soluzione di DNA per mescolare uniformemente con il fluido ventricolare e raggiungere il entire neuroepitelio.
5. Targeting l'ipotalamo per elettroporazione
- Accendere il elettroporatore e regolare le impostazioni in base all'età embrionale (per E12.5 usiamo 5 impulsi a onda quadra, 50 V, 50 msec ON/950 msec OFF). Utilizzare come polo positivo all'elettrodo ago in acciaio inossidabile (CUY550-10) e come polo negativo di un elettrodo piatto rotondo (CUY700P4L). (È importante che gli elettrodi sono più piccoli l'embrione, poiché altrimenti la corrente scorre dietro l'embrione ma non attraverso esso.)
- Selezionare per elettroporazione quegli embrioni la cui parte dorsale è alto (cioè rivolta verso lo sperimentatore) (come la maggior parte di loro sono), e scartare quelle il cui orientamento non è favorevole. Ora è possibile toccare l'utero con le dita etanolo-disinfettate o con i guanti. Tenendo dell'utero con una pinza, tuttavia, potrebbe interferire con il flusso di corrente durante elettroporazione.
- Perforare la parete uterina per la testa dell'embrione tra il amnsac iotico e la placenta dalla spinta verso il basso attraverso di essa con la punta dell'elettrodo dell'ago. Utilizzare il dito indice dell'altra mano come blocco di spinta. Circa 5 mm della punta dell'elettrodo deve essere ora tra il sacco amniotico e la parete uterina, circa al livello del mesencefalo (figure 2E e 2F). Ricordate che questo è il "mira elettrodo", quindi la sua posizione determinerà quale è più probabile ottenere trasfettate parte del neuroepitelio ipotalamico. L'embrione deve essere molto gentilmente "spremuto" tra gli elettrodi.
- Con l'altra mano, posizionare l'elettrodo piatto tondo esterna della parete dell'utero sul lato opposto della testa dell'embrione (figure 2E e 2G).
- Utilizzare l'interruttore a pedale per applicare tensione (50 V, 50 ms ON, 950 ms OFF, 5 impulsi a onda quadra).
- Tirare lentamente l'elettrodo ad ago fuori dell'utero, mentre trattenendo l'utero con il dito indice dell'altra mano - se amniotic liquido viene perso attraverso la parete forata, di solito l'embrione subirà aborto. Ripetere la procedura con tutti gli embrioni.
- Ritorna il corno dell'utero nell'addome e ripetere l'iniezione ed elettroporazione nel corno residuo.
6. Completamento della Chirurgia
- Dopo l'iniezione ed elettroporazione di tutti gli embrioni, posizionare l'utero torna in addome con molta attenzione, posizionato esattamente come erano prima e umide cavità peritoneale con soluzione fisiologica prima di chiuderlo.
- Sutura del peritoneo con catgut (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Per la chiusura della pelle uso "interruppe stitch" methodwith una sutura più resistente (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L).
- Disinfettare la superficie dell'addome con povidone-iodio (Braunoderm) e iniettare un non-steroidei anti-infiammatori per via sottocutanea (ad esempio 100 ml di una soluzione 1:10 di Rimadyl in 0.9% NaCl) o, meglio ancora, un oppioide come buprenorphine (Temgesic, da 0.05 a 0.1 mg / kg di peso corporeo in 0.9% NaCl) per alleviare il dolore.
- Rimuovere la madre dalla macchina anestetica e metterlo in una gabbia che è riscaldata da una piastra elettrica. Monitorare il mouse continuamente fino a quando non è completamente recuperato dal anestesia. Successivamente, controllare gli animali ogni giorno per assicurare che si stanno riprendendo dalla procedura senza alcun segno di infezione o dolore.
7. Analisi dei risultati
- Raccogliere gli embrioni (o postnatals) secondo il giorno desiderato di analisi. Topi postnatale (1-2 giorni di età) vengono uccisi per decapitazione.
- Separare ogni embrione secondo il precedente elettroporazione annotazione. Sezionare il cervello allo stereomicroscopio e controllare al microscopio per segnale fluorescente verde (GFP dal reporter) nella regione appropriata.
- Il cervello selezionato può essere analizzato "fresco": fissare il tessuto per un breve periodo in paraformaldeide al 4% e incorporare nel agarosio 4% o in gelatina-albumin, poi sezione su un dispositivo vibratomo-type (Figura 3). Per l'analisi immunoistochimica dettagliata (Figura 4), crio-proteggere il cervello in soluzione di saccarosio al 30%, incorporare nel montaggio Ottobre medio (Tissue Tek) poi tagliare 20 sezioni micron in un criostato.
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Representative Results
La maggior parte dei neuroni dell'ipotalamo sono nati tra E11.5 a E15.2, secondo l'analisi nascita-dating nel ratto 26 tradotto nella po 'più breve di sviluppo del mouse 27,28. Il picco della neurogenesi ipotalamica è raggiunta a E12.5 29-31. Conseguentemente, all'età trasfezione scelto per questo studio (E12.5), una grande proporzione di neuroni ipotalamici può essere etichettata ad ogni dato livello rostro-caudale.
Analisi alla E18.5 su sezioni vibratome-tipo spesso (Figure 3A e 3B) mostra che l'intera estensione rostro-caudale della neuroepithelium ipotalamico è accessibile a elettroporazione (Figura 3A). Ad ogni data età, i neuroni possono essere etichettati a tutti i livelli medio-laterale (Figura 3B), in accordo con gli studi lignaggio 32. Il corpo mammillary (MBO) è un nucleo di sviluppo neuronale dal neuroepitelio fodera una nicchia nel più VentraL e porzione caudale del prosencefalo. Questo rende il MBO in principio molto difficile da bersaglio. Funzionalmente, l'MBO è una struttura fondamentale per il consolidamento della memoria e dei suoi risultati degenerazione patologica in amnesia anterograda 33. Siamo stati in grado di transfettare plasmidi reporter in modo molto specifico in questo nucleo (figure 3C e 3D). Neuroni MBO estendere assoni che formano due molto caratteristici e funzionalmente tratti importanti che sono anche etichettati dopo trasfezione (punte di freccia in Figura 3C). Sezioni trasversali dimostrano che i neuroni nati a E12.5 (all'età di trasfezione) formano una curva "strato" intorno ad una massa non-marcato di neuroni generati in precedenza (cioè prima che l'esperimento ha avuto luogo trasfezione) (Figura 3D).
Al di là dei modelli di migrazione generali mostrate con l'esame di sezioni spesse, con l'aiuto di proteine reporter fluorescenti, una più stretta analisi dei risultati è possible utilizzando anticorpi specifici su sezioni al criostato (Figura 4). Per analizzare l'esempio qui prescelta, il MBO, abbiamo preparato sezioni orizzontali paralleli al piano dei processi gliali radiali provenienti dal recesso mammillary (Figura 4A). Abbiamo quindi identificato i neuroni MBO nati dal neuroepitelio etichettate su E12.5 per mezzo di anticorpi contro GFP (Figura 4B). Come previsto, l'anticorpo marcato un gruppo ristretto di cellule MBO (punta di freccia in figura 4B, 4C e 4D). Questo gruppo è stato situato tra due zone senza etichetta MBO laterale e mediale corrispondenti rispettivamente ai neuroni MBO nati prima (laterale) e dopo (mediale) E12.5. Come esempio, qui co-colorato con un anticorpo contro nestin (rosso nelle figure 4C e 4D), al fine di mostrare la modalità di migrazione dei neuroni marcati individualmente sulla radiale processi gliali del neuroepitelio.
Figura 1. Posizioni relative di ipotalamo e corteccia a midgestation. Sagittale (A) e trasversale (B) diagrammi del cervello di un topo embrione midgestation che mostra la struttura proencefalo più dorsale e più superficiale, la corteccia (CTX, blu), così come il più profondamente Struttura proencefalo posizionato, l'ipotalamo (HY, rosso).
Figura 2. Schema della procedura. (A) La diga incinta è anestetizzato e l'utero esposto. (B) In ogni gonfiore uterina identificare l'inserzione placentare (nero punta di freccia),placenta (PL) ed embrione. ME, mesometrio. (C) Identificare il punto di iniezione a metà degli emisferi corticali destro e sinistro (X rossa). (D) Iniettare la soluzione di DNA nel terzo ventricolo. (E) L'elettrodo ad ago (positivo) perfora la parete uterina tra embrione e l'inserimento placentare. L'elettrodo piatto (negativo) poggia sul lato libero dell'utero. (F) Hypothetical vista dal lato placentare mostrando posizione dell'elettrodo positivo lungo l'ipotalamo. (G) vista dal lato libero dell'utero che mostra la posizione del elettrodo negativo.
Figura 3. Transfecting ipotalamo tutta o parte di esso. Sezioni spesse vibranti-microtomo di quattro diversewild type E18.5 mouse cervello che mostrano l'ipotalamo dopo in utero trasfezione di DNA plasmidico trasportano geni reporter fluorescente GFP (A, C) o CFP (B, D) a E12.5. (A) Sezione sagittale (rostrale a sinistra) mostrando un ipotalamo trasfettate da rostrale caudale. Barra di scala 500 (B) della sezione trasversale. Micron. Sul lato transfettate, cellule marcate si trovano a tutti i livelli medio-laterale. (C) Sezione sagittale che mostra un corpo mammillary specificamente trasfettate (linea tratteggiata, asterisco) e l'etichettatura del suo caratteristico albero assonale (punte di freccia). (D) Sezione trasversale attraverso il corpo mammillary (linea tratteggiata). Sul lato elettroporate (asterisco), una band etichettata corrispondente a neuroni nati il E12.5 può essere visto. Hy, ipotalamo, Th, talamo
Figura 4. Analisi dei passi specifici in sviluppo ipotalamico. (A) Schema di una sezione orizzontale attraverso il cervello di sviluppo che mostra il corpo mammillary (rosso). La regione raffigurato in (B) e (C) è incorniciato. (B) Anticorpo etichettatura di GFP su una sezione orizzontale attraverso il corpo mammillary E18.5 GFP dopo trasfezione a E12. Cellule nasce a E12.5 formano una banda distinta nel nucleo (punta di freccia in B, C e D). Scala grafica di 100 micron. (C) Anticorpo etichettatura dei neuroepiteliale marcatore nestin (rosso) sulla sezione mostrati in (B). Scala grafica di 100 micron. (D), le cellule individuali possono essere identificati nel E12.5 banda specifica nel corpo mammillary in alto ingrandimento. Bar Scala 20 micron.
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Discussion
Circa l'anestesia: Poiché elettroporazione in utero nell'ipotalamo può essere tecnicamente ardua e richiedono tempi più lunghi narcosi, preferiamo indurre e mantenere l'anestesia mediante somministrazione di una miscela di ossigeno e isoflurano. Nella nostra esperienza, gli animali possono rimanere adeguatamente anestetizzato in questo modo, per periodi fino a un'ora almeno, la ripresa della madre è molto veloce, e la sopravvivenza dell'embrione migliorata. Altri approcci per l'anestesia sono inoltre disponibili. Il più semplice procedura consiste di indurre e mantenere narcosi mediante iniezione intraperitoneale di 2,5 ml / kg di peso corporeo di una miscela di ketamina (25 mg / ml), Xylazin (1,2 mg / ml) e Acepromazin (0,35 mg / ml) in 0,9 % sterile di NaCl ("tripla combo"). Con questa sola miscela, alle dosi raccomandate qui, una narcosi di circa 30 min (fino a 45 min in alcuni casi) è indotta. Questo di solito è sufficiente per elettroporazione in utero nella corteccia a E12.5 (attraverso injezione nel ventricolo laterale). Il vantaggio di questo metodo è che evita completamente la necessità di una narcosi-dispositivo e altre attrezzature. Tuttavia, questo tipo di anestesia intraperitoneale non è consigliato se sono necessari tempi più lunghi di un intervento chirurgico, dal momento che ulteriori iniezioni in animali anestetizzati, al fine di prolungare il periodo di anestesia sono spesso seguiti da morte. È anche possibile combinare intraperitoneale e anestesia inalatoria prima mediante una iniezione del "combo triplo" (come sopra) per indurre narcosi, poi mantenerla per inalazione di isoflurano / ossigeno. Anche se con questo metodo particolare la narcosi può essere mantenuta per tutto il tempo in quanto è necessario, il recupero del topo incinta dopo l'operazione non è buono come con sola inalazione. Inoltre, ogni volta che usiamo la "combo tripla" iniezione intraperitoneale, la sopravvivenza degli embrioni diminuisce.
Il posizionamento degli elettrodi sulla testa del embrione come illustrato nella La laparotomia è abbastanza semplice. Tuttavia, lo sperimentatore raggiunge il livello di abilità che consente un'altissima percentuale di sopravvivenza degli embrioni (dopo l'iniezione intraventricolare seguita dalla somministrazione di impulsi elettrici) dopo una curva di apprendimento piatta. Abilità individuale è un fattore importante in modo che in utero elettroporazione in generale e la sua applicazione al ipotalamo in particolare, possono non risultare del tutto pratico per alcuni studenti . Di abbreviare il periodo di apprendimento così come per aumentare la riproducibilità e l'analisi statistica abbiamo trovato utile per riempire un protocollo dettagliato contenente informazioni riguardanti il numero e la posizione degli embrioni, e l'aspetto, la qualità dell'iniezione e la posizione approssimativa degli elettrodi per i singoli embrioni. Confrontando questi dati circa l'esperimento con i risultati finali, su base embrione-by-embrione è dimostrato utile per capire e migliorare la procedura. Altri rapporti 20,21 hanno preso di mira l'ipotalamo con Nepagene pinzetta tipo elettrodi. Abbiamo costantemente ottenere risultati migliori con l'applicazione di un ago-elettrodo e una copertura piana-elettrodo dello stesso produttore. Nella nostra esperienza, l'uso di questo metodo rende rostro-caudale di targeting più facile. Elettrodi pinzette sembrano richiedere uno più esperienza / abilità o di un numero molto più grande di esperimenti al fine di produrre risultati utili.
L'altro gruppo di approcci chirurgia evita completamente, in quanto si basa sulla iniezione dei costrutti trasfezione nel flusso sanguigno del topo incinta. Coda vena (vena caudale) iniezione di shRNA 34,35 o plasmidi 36 ha il potenziale per manipolare geneticamente molto embrioni precoci, anche se il targeting regione-specifico non è possibile con questo metodo. Questo approccio promettente non sembra ancora pronto per l'applicazione generale. Particelle virali (virus adeno-associato) iniettato nella vena facciale di topi neonati (ma non i topi più anziani) è in grado di transfettare neuroni del cervello 37. Infine, le nanoparticelle, che potrebbero eventualmente essere utilizzati come vettori di DNA, possono raggiungere il cervello dopo la coda viniezione ein in topi adulti 38. Questi due metodi, che aprono la possibilità di trasfezione molto embrioni precoci, sono a nostra conoscenza non ancora utilizzato in topi in gravidanza.
Età di trasfezione e di raccolta: per imparare la procedura, probabilmente è meglio cercare di transfettare E14.5 embrioni, per poi laurearsi in precedenza, età embrionali più difficili. Nella nostra esperienza, l'espressione della GFP è visibile sotto la luce UV già 24 ore dopo la trasfezione. E12.5 dopo trasfezione, espressione GFP su E18.5 è molto forte. Abbiamo elettroporate a E12.5, E13.5, E14.5 e E15.5 e analizzati a E17.5, E18.5, P0 e P1 di essere in grado di trovare una forte espressione giornalista in tutti i casi. Quando gli embrioni i cui cervelli sono stati trasfettati in utero sono autorizzati a raggiungere il termine (per la raccolta di dati post-natale), a volte sono selettivamente mangiati dalla madre. Ciò suggerisce sottili cambiamenti di aspetto cucciolo o comportamenti indotti dalla manipolazione del cervello (la loro tempetura potrebbe essere inferiore, o forse non emettono dei segnali sonori a destra). In quegli animali postnatali che sopravvivono abbattimento materno, abbiamo osservato l'espressione giornalista fino P1 almeno. Rapporti in mostra espressione letteratura di costrutti transfettate anche quattro mesi dopo la nascita 10.
Vettori per elettroporazione: usiamo bicistronici plasmidi reporter guidato dal promotore CAG 39, seguito dal cDNA del gene di interesse, separati da un sito di entrata del ribosoma interno (IRES) 40, dal cDNA di un reporter fluorescente, per esempio la maggiore proteina fluorescente verde 41. Il promotore CAG è così forte in neuroni che può produrre livelli di DNA troppo elevata per le cellule transfettate, ucciderli. Anche se abbiamo mai osservato massiccia apoptosi dopo la trasfezione, una possibile soluzione, dovrebbe apparire il problema, sarebbe l'uso di un promotore meno efficiente, come il EF1 alfa 42.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla German Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
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