Summary
視床下部の機能や医療の重要性にもかかわらず、
Abstract
開発哺乳類の脳の特定の領域の遺伝子組み換えは非常に強力な実験的なアプローチです。しかし、小説のマウス変異体を生成することはしばしばいらいら遅いです。これは、合理的なポスト手術用生存率と子宮内現像マウスの脳へのアクセスが可能であることが示されている。それでも、この手順と結果は脳の発達の最も表面的かつ簡単にアクセスできる部分はほぼ全面的に報告されており、皮質、すなわち 。視床、狭く、より内側の領域は、ターゲットへのより困難であることが判明しました。特に深い核、視床下部のものへのトランスフェクションは、最も困難なので、非常にいくつかの結果が報告されているかもしれないです。ここでは、全体の視床下部の神経上皮またはエレクトロを通じてトランスフェクションのためにその一部を（視床下部の領域）が対象とする手順を示しています。我々のアプローチの鍵は、長い昏睡回、T中の注射ですhird心室、適切な種類と電極の位置。さらに、我々はターゲティング最も凹ん視床核、乳頭体のその後の組織学的分析の結果を示す。
Introduction
マウス胎児の脳の遺伝子操作が発達規制について学ぶために好ましいアプローチである。変異マウス線の生成は、しかし遅く、高価である。哺乳類の脳の神経細胞の開発に特定の遺伝的変化を導入する一つの有力な方法は、 子宮内エレクトロポレーションである。本質的に、この技術は、胚は、一定時間生き残る脳を収集し、可能な新規な、有益な表現型のためにそれらを調べることができ、その後、電気的パルスによって胚脳の神経上皮へのDNAのトランスフェクションから構成される。この方法では、実験者は、マウス変異体の生産に必要な長い待機期間なしでほとんど即座仮説をテストすることができます。
発展途上胚へのDNAのトランスフェクションは、ニワトリ胚1上のOVOエレクトロポレーションで始まりました。マウスに不可欠な概念実証は、文化の中で行われた
主な問題は、それらまたは母を殺すことなく、 子宮内での開発の胚の脳をトランスフェクトすることです。必要な手術（開腹、インジェクション、エレクトロポレーション）を実行するために学ぶことは、長い訓練期間を必要とします。手術が胚の生存率が許容できるポイントに習得された後、次の重要な問題は、次のとおりです。脳構造がアクセス可能である？驚くことではないが、 子宮内エレクトロポレーションで得られた結果を示した最初の論文は、皮質開発5-9に焦点を当てた。外科的処置に最もアクセス現像マウス脳の領域が皮質（ 図1）であるので、これは、この技術を用いて出版物のほとんどは依然として当てはまる。皮質に子宮内エレクトロポレーションでの手順が記載されているプリント10とビデオ11〜14インチ技術の変更が終脳の腹側部分、大脳基底核15を標的するために使用することができる。
終脳を超えて、間脳は（古典的視床と視床下部に分けて）に到達することがより困難脳の領域である。その背と最もアクセス部分、視床16-19の標的論文·レポートの数が少ない。
視床下部は、脳の中で最も腹側部分であるので、1背面（皮質）（ 図1）から最も深くローカライズ。この領域は、遺伝的に子宮内でマウスの脳を操作することを約束し研究者のための困難な課題である。我々の知る限りでは、ごく少数の記事では、マウスの視床下部20,21に子宮内トランスフェクションの結果を報告する。しかし、視床下部cannoの機能的重要性それは食べたり飲んだり、交配、繁殖と子育て22のような行動を規制するため、T、誇張すること。また、視床下部の開発の変化は、肥満、高血圧、糖尿病、思春期早発症23のような生活条件の後半発信に貢献しています。開発中に遺伝的に視床下部を変更することができることは、それを理解するための非常に強力なツールを提供するでしょう。
我々はここで使用している妊娠マウスの開腹するための基本的な外科的プロトコルは、他のプロトコル11,13,14,24で使用されているものと似ています。私たちは、完全を期すためにここで簡単にそれらを記述します。我々の手順の鍵と、他方では、麻酔のタイプ、注入の代わりに、電極の種類や挿入および胚の頭部に対する正電極の位置である。前者は可能にするため、我々は、単純な腹腔内麻酔上ガス吸入による麻酔を誘導し、維持することを好む難しい手術に必要な麻酔のやや長い期間。麻酔からの迅速な復旧にイソフルラン吸入結果、通常、母親は既に手術後の分を通常の動作を示しているので。ガラスマイクロピペットでDNA溶液を注入するための最も簡単な点は、しかし、視床下部のエレクトロポレーションのために完全には不向きである側脳室、です。直接第三脳室に注入は確かに深い間脳構造を標的とすることが重要です。標準の、既製の電極にE12.0またはE12.5から視床下部をトランスフェクトすることができる。私たちは、特にこの目的に適してNEPAジーン（千葉県、日本）によって製造された電極の一部を発見した。
私たちの手順では、我々は全体の視床下部神経上皮や電極の向きに応じて部分的な、地域のトランスフェクションのトランスフェクションを得る。ここで我々は間違いなく、乳頭体をトランスフェクトすることによって技術を実証深いとすべての視床核の最も凹んだ。さらに、我々は、解像度の細胞レベルにトランスフェクションされた細胞の詳細な組織学的分析を下に示す。
子宮内でマウスの脳の発達をトランスに他のアプローチと子宮内エレクトロポレーションでの比較は考察の項に記載されています。
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Protocol
1。注射用DNAとガラスマイクロピペットの作製
- 良質のガラスマイクロピペットは、羊水の損失のために初期高い流産率を減少させるために不可欠です。ガラスマイクロピペットを引っ張るための手順は、よく13,18,25を文書化されています。ヒート= 300;; 1.2ミリメートル径の毛細管を使用し、設定P = 500と従来のサターでP-97のデバイスを引っ張っ= 40を引いて、速度= 50;時間= 50。 3ミリメートル "トラフ"フィラメント（サッタートゥルFT330B）でプーラーを取り付けます。 2ミリメートル径フィラメントは私たちのために少なく満足のいく結果が得られている。一方、マイクロピペットの先端を面取りすると、私たちのために結果を改善していないようです。
- 1から2μgの/μlに最終濃度0.1％ファストグリーンを含むPBSで精製し、エンドトキシンフリーのプラスミドDNA（細胞培養グレード）に溶解する。ファストグリーンは、胚の脳室に注入された目に見える解決策を作ります。
- ガラスマイクロピペットへのDNA溶液10μlをロードします。 噴射システム（ピコポンプ）や口のピペットにガラスマイクロピペットを接続します。
2。麻酔
加熱パッドや手術器具で手術台を準備します。胚の可視化を容易にするために、冷光源をオンにします。例えばガラスビーズ滅菌器を使用した手術器具を消毒する。
三つの異なる麻酔手順は、（説明を参照）は、このプロトコルのために可能です。ここで我々は麻酔導入（流量0.5 L /分）と同様のメンテナンス（流量1リットル/分）のためにイソフルラン吸入を使用して、最善を考えるものを説明します。
- チューブの短い長さによってKomesaroffマーク5麻酔デバイスに接続されている（そのため、マウスが表示されたまま）、透明の小さな容器に妊娠しているマウスをご紹介します。
- イソフルランを気化器を満たし、その後、デバイスに接続されている酸素ボンベを開きます。 isoflの1つまたは2つのパルスを吹くurane /麻酔が入って設定するためのマウスと時計を保持する容器への酸素（0.5L /分）
- マウスを取り出し、乾燥からそれらを防ぐために、すぐに頭に流れ麻酔マスクに適合するように軟膏との目をカバーしています。
3。開腹
- 加熱パッド（そうでなければ、その体温が回復の可能性を減少させる、非常に高速に下がるだろう）上に腹マウスを置き、テープで側面に4つの足を固定することにより、所定の場所に、その本体を固定します。反射刺激（しっかり圧例えばつま先またはテールピンチ）への応答の損失のためにチェックすることによって、麻酔の深さを評価する。
- 腹部の表面を剃るとiodophorpovidone-ヨウ素（Braunoderm）でそれを消毒。
- 腹部皮膚上の縦切開（1〜1.5センチメートル長い）を作る。その後、腹膜を切った。切開の周り綿ガーゼを置きます。 1子宮角が見えるようにし、PBS-すすぎgauzに鈍ピンセットで慎重にそれを引き出し電子。非常に多くの場合、それは常に（ 図2Aおよび2B）湿ら保つためにPBSで子宮を洗浄します。全体の手順の間に子宮内部の高い圧力が中絶になり注射により流体の損失の可能性を増加胚に送信しますので、タイトな子宮間膜や子宮を引っ張って避けてください。
4。脳室へのDNAインジェクション
- 脳室を可視化することができるような方法で子宮を保持する。広範囲に不利な立場にある胚の位置を変えてはいけない - これが唯一の中絶の可能性が高くなります。
- 上部から胚の頭を見て、視覚的に左右の皮質半球間のギャップや亀裂をローカライズ。半球は区別することが容易であり、それらの内側側脳室は（対象としないように）通常はやや暗めの形状として認識することができます。胚（FIGUR DNA注射のために完全に配向させることが判明した場合ES 2C及び2D）、それが貫通する子宮壁可能であり、一度に第三脳室に入る。約1mmのために貫通、皮質半球間のギャップの吻側終わりに子宮壁と穿刺それに45°のガラスマイクロピペットを保持します。このようにして、ガラスマイクロピペットの先端は、脳（ではない側脳室）（ 図2Cおよび2D）の第三脳室に入ります。それは胚の頭部の近傍で最初貫く子宮壁（常に45°）に便利です不利指向の胚では、皮質半球の間に正しい位置にマイクロピペットの先端を配置し、だけにして脳を穿孔。第三脳室（良い注射が緑流体で心室を埋める）にDNA溶液を約1μLを注入します。 1子宮ホーンのすべての胚と同じ手順を繰り返します。これは、DNA溶液を、心室流体で均等に混ぜるとentirに到達するためのいくつかの時間を可能にします電子神経上皮。
5。エレクトロポレーションのための視床下部を標的
- にエレクトロを切り替えて胚年齢（E12.5のために我々は5方形波パルスを使用し、50 V、50ミリ秒ON/950ミリ秒OFF）に応じて設定を調整します。正極として、ステンレス製の針電極（CUY550-10）を使用し、負極ラウンドフラット電極（CUY700P4L）として。 （電流だけでなく、それを介して胚の周りを流れそうでないので、それは、電極胚よりも小さいことが重要である。）
- エレクトロポレーションのために、その背側（それらのほとんどがあるように）（ つまり、実験者の方を向いて）アップしているそれらの胚を選択して、その方向性に有利で はないものを捨てる。これは、エタノール消毒指で、または手袋を子宮に触れても安全です。鉗子で子宮を持って、しかし、エレクトロポレーション時の電流の流れを妨げる。
- ピアースAMNの間に胚の頭で子宮壁針電極の先端とそれを介して下方へ突き出すことによりiotic嚢と胎盤。スラストブロックとしてもう一方の手の人差し指を使用してください。電極先端の5mm程度は中脳（ 数字は2Eと2F）の程度のレベルで、羊膜嚢と子宮壁との間で今でなければなりません。これは "ターゲット電極"であることを忘れないので、その位置は、トランスフェクトされ得る可能性が最も高い視床下部の神経上皮のどの部分を決定します。胚は非常に優しく、電極間に "圧迫"されなければならない。
- 一方、位置と胚の頭（ 図2Eと2G）の反対側の子宮壁の外側ラウンドフラット電極。
- 電圧（50 V、50ミリ秒ON、950ミリ秒OFF、5方形波パルス）を適用するためにペダルスイッチを使用します。
- もう一方の手の人差し指で子宮をバック保持しながらゆっくりと子宮の針電極を引き出します - もしamnioチック液がパンクした壁を通して失われ、通常胚は妊娠中絶を受けることになる。すべての胚との手順を繰り返します。
- 腹部に子宮ホーンを返し、残りの角の注射およびエレクトロポレーションを繰り返します。
6。手術を終えて
- すべての胚の注入とエレクトロポレーションした後、彼らはそれを閉じる前に生理食塩水で腹腔前と湿っていたとおりに正確に配置され、非常に慎重に腹部に子宮を後ろに置きます。
- 手術腸線（VICRYLポリグラクチン910、5-0、エチコンV4914）で腹膜を縫合。肌用の閉鎖methodwithより耐性縫合（Supramidナイロン、6-0、Serag Wiessner 07171L TO） "ステッチが中断"。
- ポビドンヨード（Braunoderm）と腹部の表面を消毒し、非ステロイド皮下抗炎症（ 例えば 、0.9％NaCl中Rimadyl 1:10の溶液100μl）、または、より良い、BUのようなオピオイドを注入prenorphine（Temgesic、0.9％NaCl中0.05〜mg / kg体重）痛みを緩和する。
- 麻酔マシンから母親を外し、加熱パッドにより加熱されるケージに入れてください。それは完全に麻酔から回復されるまで、継続的にマウスを監視します。その後、感染症や痛みの兆候なしで、彼らはプロシージャから回復して保証するために、毎日動物を確認してください。
7。結果の分析
- 分析の希望日に応じて胚（またはpostnatals）収穫。出生後のマウス（1から2日齢）を断頭により殺される。
- 以前エレクトロ注釈によると、すべての胚を分離。実体顕微鏡下で脳を解剖して、適切な地域の緑色蛍光シグナル（GFPレポーターから）のために顕微鏡下で確認してください。
- 選択された脳は、 "新鮮"を分析することができます：4％パラホルムアルデヒド中で短い時間のために組織を固定し、アガロース4％またはゼラチンで埋め込むlbumin、その後ビブラトーム型デバイス上のセクション（ 図3）。より詳細な免疫組織化学的分析のために（ 図4）、10月マウンティング培地（ティッシュテック）に埋め込 む30％ショ糖溶液を、脳を凍結保護はその後クライオスタットで20μmのセクションをカット。
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Representative Results
ほとんどの視床下部のニューロンはやや短いマウス開発27,28に翻訳ラット26で出生デートの分析によると、E11.5 E15.2の間に生まれています。視床下部の神経発生のピークはE12.5 29-31に到達する。そこで、本研究（E12.5）のために選択されたトランスフェクションの年齢で、視床下部ニューロンの大部分は、任意の与えられた吻側 - 尾レベルでラベルを付けることができます。
厚いビブラトームタイプのセクションにE18.5で分析（ 図3Aおよび3B）は視床下部の神経上皮の全体の吻側-尾拡張はエレクトロポレーション（ 図3A）にアクセス可能であることを示しています。任意の年齢で、ニューロンは系統学32と一致して、すべてのメディオ·横のレベル（ 図3B）で標識することができます。乳頭体（MBO）が最もventraに凹部を並べる神経上皮から開発する神経核であるlおよび前脳の尾部。これは、ターゲットに原則としてMBOが非常に困難になります。機能的には、MBOは、前向性健忘症33のメモリの統合とその病理学的変性の結果を得るために重要な構造です。私たちは、この核（ 図3Cおよび3D）に非常に特異的にレポータープラスミドをトランスフェクションすることができました。 MBOニューロンはまた、トランスフェクション（ 図3Cにおいて矢印）の後にラベル付けされている2つの非常に特徴的かつ機能的に重要な器官を形成する軸索を伸ばす。横断面は、E12.5（トランスフェクションの年齢）に生まれたニューロンは、以前に生成さニューロンの非標識質量（ すなわち 、トランスフェクション実験の前に行われた）（ 図3D）の周りに湾曲した"層"を形成することを示している。
蛍光レポータータンパク質の助けを借りて、厚いセクションで検査によって示される一般的な移動パターンを超え、結果を詳しく分析はPOSSです撓クリオスタット切片に特異的な抗体を用いた（ 図4）。ここで選択された例を分析するために、MBO、我々は、乳頭凹部（ 図4A）から発せられる放射状グリアプロセスの平面に平行な水平切片を作成した。我々はその後、GFP（ 図4B）に対する抗体を用いて、E12.5にラベル神経上皮から生まれMBOニューロンを同定した。予想されるように、抗体はMBO細胞の制限されたグループを（ 図4B、4Cと4Dで矢じり）ラベル。二人の前に（横）とE12.5（内側）の後に生まれたMBOニューロンのそれぞれに対応する側面と内側MBO領域をラベルなしの間でこのグループは位置していた。例として、ここでは神経上皮の放射状グリア過程で個別にラベルニューロンの移行モードを示すためにネスチン（ 図4Cおよび4Dで赤）に対する抗体との共染色した。
図1。妊娠中期。サジタル（）と横に視床と皮質の相対位置が最も深く（B）最も背側と最も表面的な脳構造、皮質（CTX、青）を示す妊娠中期のマウス胚の脳の図と同様に、配置前脳構造、視床下部（HY、赤）。
図2。手順の図。 （A）妊娠ダムは麻酔で、子宮が露呈した。（B）それぞれの子宮の腫れで、胎盤挿入（黒矢印）を識別胎盤（PL）と胚。 ME、子宮間膜。（C）左右皮質半球（赤いX）の途中で注入ポイントを識別します（D）第三脳室にDNA溶液を注入します（E）針電極（正）子宮壁を貫通胚と胎盤の間に挿入。フラット電極（負）子宮の自由側にかかっている。視床下部に沿って正極の位置を示す胎盤側から（F）仮定ビューが。（G）の位置を示す子宮の自由側からの眺め負極。
図3。全体視床下部またはその一部をトランスフェクトする。異なる4の太い振動ミクロトームのセクションでは、野生型E12.5で蛍光レポーター遺伝子GFP（A、C）またはCFP（B、D）を有するプラスミドDNAの子宮内でのトランスフェクションの後に視床下部を示すE18.5マウス脳。（）矢状断面（左に吻側）吻側から尾側にトランスフェ視床下部を示す。スケールバーは500μm。（B）横断面。トランスフェクションされた側では、標識された細胞は、すべてのメディオ·横のレベルで見つけることができます（C）矢状断面は、具体的にトランスフェクト乳頭体（破線、アスタリスク）を示すと、その特徴的な軸索 木（矢じり）のラベル。（D）横断面乳頭体（破線）を介して。にエレクトロ側（アスタリスク）、E12.5に生まれたニューロンに対応するラベルのバンドを見ることができます。 HY、視床下部、Thは、視床
図4。視床下部の開発における具体的な手順を分析する。乳頭体（赤色）を示す脳の発達を通る水平断面の（）図。領域E12におけるGFPトランスフェクション後のE18.5乳頭体を通る水平部にGFPの（B）及び（C）が組み立てられます。（B）抗体標識に示される。 E12.5で生まれた細胞は核内の異なるバンド（Bで矢じり、CおよびD）を形成する。スケールバーは100μmである。（C）部に神経上皮マーカーネスチン（赤）の抗体標識は、（B）に示す。スケールバーは100μm。（D）個々の細胞を高倍率で乳頭体の特定のE12.5バンドで識別することができます。スケールバーは20μm。
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Discussion
麻酔について：視床下部に子宮内エレクトロポレーションでは技術的に困難であると長い麻酔時間を必要とすることができるので、我々は、酸素とイソフルランの混合物を投与することにより麻酔を誘導し、維持することを好む。我々の経験では、動物は少なくとも1時間までの期間について、このように適切に麻酔残ることができ、母親の回復は非常に高速であり、胚の生存率が向上しました。麻酔への他のアプローチもご用意しています。最も簡単な手順は、0.9でケタミン（25 mg / ml）で、キシラジン（1.2 mg / mlの）とAcepromazin（0.35 mg / ml）での混合物の体重の2.5ミリリットル/ kgを腹腔内注射により麻酔を誘導し、維持することから成り％無菌のNaCl（ "トリプルコンボ"）。一人でこの混合物を用いて、ここで推奨用量で、約30分（場合によっては最大45分）の麻酔が誘導される。これは、E12.5（INJを通してで子宮内エレクトロポレーションで皮質に通常十分です側脳室でECTION）。この方法の利点は、それが完全に麻酔·デバイスや他の機器の必要性を回避することである。手術の長い時間が必要な場合は、腹腔内麻酔のこのタイプは、麻酔動物のさらなる注射麻酔期間を延長するためには、多くの場合、死が続いているので、お勧めしません。これは、最初に麻酔を誘導するために、 "トリプルコンボ"（同上）の注入を使用して、腹腔内および吸入麻酔を組み合わせることも可能であるし、イソフルラン/酸素の吸入によってそれを維持する。この特定の方法で麻酔がある限り、それが必要とされるように維持することができますが、操作後の妊娠マウスの回復だけでは吸入とほど良くはありません。加えて、我々は "トリプルコンボ"腹腔内注射を使用するたびに、胚の生存率が低下してしまう。
に示すように胚の頭の上の電極のポジショニング 開腹は十分に簡単です。しかし、実験者は平らな学習曲線の後の胚の高い生存率（電気パルスを投与続いて脳室内注入後）が可能になりスキルのレベルに達する。個々のスキルは一般的な、特に視床下部への応用における子宮内エレクトロポレーションのいくつかの学生のための完全に実用的ではないことを証明できるように、重要な要因である 。学習期間を短縮するだけでなく、我々はそれが有用のために胚の数と位置に関する情報を含む詳細なプロトコル、および外観は、注射の質と電極のおおよその位置を埋めるために発見した再現性と統計分析を高めるために個々の胚。胚バイ胚ごとに最終的な結果と実験について、これらのデータを比較すると、手順を理解し、改善するために有用であることが証明されています。 その他のレポートは20,21 Nepageneピンセット型電極で視床下部を標的にしている。我々は一貫して1針電極のアプリケーションと同じメーカーの一つフラットカバー電極とのより良い結果を得る。我々の経験では、このメソッドを使用すると、容易にターゲティング吻側 - 尾側になります。ピンセット電極は、有用な結果をもたらすために、どちらかのより多くの経験/スキルや実験のはるかに大きい数を必要とするように見える。
それは妊娠したマウスの血流にトランスフェクトするための構造物の注入に基づいているので、アプローチの他のグループは、完全に手術を回避することができます。地域固有のターゲティングは、この方法では不可能であるが、shRNAを34,35またはプラスミド36の尾静脈（尾静脈）注射は、遺伝的に非常に初期胚を操作する可能性を秘めている。この有望なアプローチは、まだ一般的なアプリケーションのための準備ができていないようです。新生児マウスの顔面静脈に注射ウイルス粒子（アデノ随伴ウイルス）（ただし、年齢以上のマウス）は、脳のニューロン37をトランスフェクトすることができる。最後に、最終的にはDNAの担体として使用することができるナノ粒子は、尾V後に脳に到達することができ成体マウス38 EIN注射。非常に初期胚をトランスの可能性を開いてこれらの2つの方法は、まだ妊娠したマウスに使用されていない我々の知識を持っている。
トランスフェクションおよびコレクションの年齢：手順を学習するための、それはE14.5胚をトランスフェクトしてみた後、以前の、より困難な胚の年齢に卒業するおそらく最高です。我々の経験では、GFPの発現は、トランスフェクション後、既にUV光の下で24時間表示されている。 E12.5トランスフェクション後、E18.5でGFPの発現が非常に強いです。私たちは、E12.5、E13.5、E14.5、及びE15.5でエレクトロとE17.5、E18.5、P0とすべての場合に強いレポーター発現を見つけることができることP1で分析した。その脳子宮内でトランスフェクトされた胚（生後データ収集のための）言葉に到達させている場合、時には彼らが選択的に母親に食べられています。これは脳の操作（彼らの温度によって誘発される子犬外観や行動の微妙な変化を示唆しているトゥーレは低くなる可能性があり、または多分彼らは）右の音声信号を発していない。母性カリングを生き残るもの生後動物では、我々は少なくともP1までレポーター発現を観察した。でも、4ヶ月出産後10トランスフェコンストラクトの文学ショー式のレポート。
エレクトロポレーションのためのベクター：我々は、例えば、蛍光レポーターのcDNAから、内部リボソーム侵入部位（IRES）40で区切られた、目的の遺伝子のcDNA続いCAGプロモーター39によって駆動バイシストロンレポータープラスミドを使用する強化された緑色蛍光タンパク質41。 CAGプロモーターは彼らを殺し、それがトランスフェクションされた細胞は高すぎるDNAのレベルを生成することができますことをニューロンにとても強いです。我々は、トランスフェクション後に大規模なアポトーシスを観察したことがありませんが、可能な解決策は、問題が表示されるはずです、EF1アルファ42のように、あまり効率的プロモーターの使用となります。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、ドイツ研究協会（ドイツ学術振興）によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
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