Summary
Trods den funktionelle og medicinske betydning af hypothalamus,
Abstract
Genetisk modifikation af specifikke regioner i udviklingslandene pattedyrs hjerne er en meget kraftfuld eksperimenterende tilgang. Imidlertid genererer nye mus mutanter er ofte frustrerende langsomme. Det har vist sig, at adgangen til musehjernen udvikler i livmoderen med rimelig post-operatory overlevelse er mulig. Alligevel har resultater med denne procedure blevet rapporteret næsten udelukkende til det mest overfladiske og let tilgængelige del af hjernens udvikling, dvs cortex. Thalamus, en smallere og mere mediale region, har vist sig sværere at målet. Transfektion i dybere kerner, især dem i hypothalamus, er måske den mest udfordrende, og derfor meget få resultater er blevet rapporteret. Her viser vi en procedure for at målrette hele hypothalamus neuroepithelium eller en del af det (hypothalamus regioner) til transfektion via elektroporation. Nøglerne til vores tilgang er længere narkose tider, injektion i tHird ventrikel, og passende form og placering af elektroderne. Derudover viser vi resultaterne af målretning og efterfølgende histologisk analyse af de mest forsænket hypothalamus kerne, det mammillary kroppen.
Introduction
Genetisk manipulation af embryonale muse hjerne er en foretrukken metode til at lære om udviklingsmæssige regulering. Generering af mutante muselinjer dog er langsomt og dyrt. En kraftfuld metode til at indføre særlige genetiske ændringer i udviklingen neuroner i pattedyrs hjerne er i livmoderen elektroporation. Dybest set Teknikken består i at transficere DNA i embryonale hjerne neuroepithelium ved hjælp af elektriske impulser, derefter lade embryonet til at overleve en vis periode, indsamle hjernen og undersøge dem for mulig roman, informative fænotyper. På denne måde, kan forsøgslederen teste hypoteser næsten øjeblikkeligt uden lange ventetider er nødvendige for produktionen af muse-mutanter.
Transfektion af DNA i fostre startede med in ovo elektroporation på kyllingefostre 1.. Den væsentlige proof-of-concept for musen blev udført i kultur
Det vigtigste problem er at transficere hjernen af embryoner udvikler i livmoderen uden at dræbe dem eller moderen. At lære at udføre den nødvendige kirurgi (laparotomi, injektion, elektroporation) kræver en lang uddannelsesperiode. Når operationen er blevet mestret til det punkt, hvor embryo overlevelse forholdet er acceptabel, er det næste centrale spørgsmål er: hvilke hjernens strukturer er tilgængelige? Ikke overraskende, de første offentliggjorte papirer viser resultater opnået med in utero elektroporation fokus på kortikal udvikling 5-9. Dette er stadig sandt for de fleste af de publikationer ved hjælp af denne teknik, da regionen udviklingslandene musehjerne mest tilgængelige for kirurgiske procedurer er cortex (figur 1). Proceduren for in utero elektroporation i cortex er blevet beskrevetpå tryk 10 og i video 11-14. En modifikation af teknikken kan anvendes til at målrette en ventral del af telencephalon, basalganglierne 15..
Ud telencephalon, er diencephalon (klassisk opdelt i thalamus og hypothalamus) en region i forhjernen mere vanskeligt at nå. Et lille antal papirer rapporter målrettet sin ryg og mest tilgængelige del, thalamus 16-19.
Hypothalamus er den mest ventrale del af forhjernen, derfor den ene lokaliserede mest dybt fra den dorsale overflade (cortex) (figur 1). Denne region er fortsat en vanskelig udfordring for forskerne forpligtet til genetisk manipulere musehjernen i livmoderen. Til vores viden, melder kun meget få artikler om resultaterne af i livmoderen transfektion i musen hypothalamus 20,21. Men den funktionelle betydning af hypothalamus cannot overvurderes, da det regulerer adfærd som at spise og drikke, parring, avl og forældreskab 22.. Desuden ændringer i hypothalamus udvikling bidrager til at stamme senere i livsbetingelser som fedme, forhøjet blodtryk, diabetes og tidlig pubertet 23.. At være i stand til at ændre genetisk hypothalamus under udvikling vil give et meget kraftfuldt værktøj til at forstå det.
Den grundlæggende kirurgiske protokol for laparotomi af gravide mus, som vi bruger her, er magen til den, der anvendes i de andre protokoller 11,13,14,24. Vi vil beskrive dem her kort for fuldstændighedens. Nøglen til vores procedure på den anden side er typen af anæstesi, stedet for indsprøjtning, typen af elektroder og indsættelse og placering af den positive elektrode med hensyn til fosterets hoved. Vi foretrækker at inducere og vedligeholde anæstesi gennem gas indånding løbet enkel intraperitoneal anæstesi, idet førstnævnte giver mulighed forlidt længere narkose kræves for en vanskelig operation. Isofluran inhalation medfører hurtigere helbredelse fra anæstesi, da regel moderen demonstrerer normal adfærd allerede få minutter efter operationen. Den nemmeste punktet af indsprøjtning af DNA opløsningen med glasmikropipette er den laterale ventrikel, som dog er helt uegnet til hypothalamus elektroporation. Injektion direkte i den tredje ventrikel er helt afgørende at målrette dybe diencephalic strukturer. Det er muligt at transfektere hypothalamus fra E12.0 eller E12.5 med standard, off-the-shelf elektroder. Vi har fundet nogle af elektroderne fremstillet af Nepa Gene (Chiba, Japan) særligt velegnet til dette formål.
Med vores procedure opnår vi transfektion af hele hypothalamisk neuroepithelium eller delvis, regional transfektion afhængigt elektrode orientering. Her har vi demonstrere teknikken ved transfektion af mammillary kroppen, velsagtensden dybeste og mest forsænket fremmest hypothalamus kerner. Derudover viser vi detaljeret histologisk analyse af de transficerede celler ned til celleniveau af opløsning.
En sammenligning af in utero elektroporation med andre tilgange til transfektion af mus hjernens udvikling i livmoderen kan findes i Discussion afsnit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse af DNA og glas Mikropipetter Injection
- God kvalitet glas mikropipetter er afgørende for at reducere indledende høje aborter skyldes tab af fostervand. Proceduren til at trække glas mikropipetter har været veldokumenteret 13,18,25. Brug 1,2 mm diameter kapillærer trukket i en konventionel Sutter P-97-enhed med indstillingerne P = 500, Heat = 300; Pull = 40, Velocity = 50, Time = 50. Monter aftrækker med 3 mm "trough" filamenter (Sutter Instrument FT330B). De 2 mm størrelse filamenter har givet for os mindre tilfredsstillende resultater. På den anden side fører beveling af mikropipette tips ikke ud til at forbedre resultaterne for os.
- Opløs renset, endotoxinfrit plasmid-DNA i PBS (Cell Culture Grade) indeholdende 0,1% Fast Green til en endelig koncentration på 1 til 2 ug / ul. Fast Green vil gøre det injicerede opløsning synlig i embryonale hjerne ventrikel.
- Load 10 ul af DNA-opløsningen i glasmikropipette. Slut glasmikropipette til indsprøjtningssystemet (Pico pumpe) eller mund pipette.
2.. Anæstesi
Forbered kirurgiske bord med en varmepude og kirurgiske instrumenter. Tænd kold-lyskilder for at lette visualiseringen af embryonerne. Desinficere kirurgiske værktøjer ved hjælp for eksempel en glasperle sterilisator.
Tre forskellige anæstesi procedurer er en mulighed for denne protokol (se diskussion). Her vil vi beskrive den, vi overveje den bedste, ved hjælp af isofluran inhalation anæstesi induktion (flow rate 0.5 L / min) samt vedligeholdelse (flow 1 L / min).
- Indføre den gravide mus i et lille gennemsigtigt (så musen forbliver synligt) beholder tilsluttet Komesaroff Mark 5. Bedøvelse enhed af en kort længde af slangen.
- Fyld fordamperen med isofluran, derefter åbne iltflaske knyttet til enheden. Blæs en eller to pulser af isoflurane / oxygen (0,5 L / min) i beholderen holde musen og se for narkose at indstille i.
- Tag musen ud dække sine øjne med salve for at forhindre dem i at tørre og monter flow anæstesi masken på hovedet med det samme.
3.. Laparotomi
- Placer musen mave op på varmepude (ellers dens kropstemperatur vil gå ned meget hurtigt, faldende chancerne for helbredelse) og sikre sin krop på plads ved fastsættelse af sine fire ben til siderne med tape. Vurdere anæstesidybden ved at kontrollere for tab af respons på refleks stimulation (f.eks tå eller hale knivspids med et fast tryk).
- Shave mavens overflade og desinficere det med iodophorpovidone-jod (Braunoderm).
- Foretag en langsgående indsnit (1 til 1,5 cm lang) på den abdominale hud. Derefter skæres bughinden. Placer bomuldsgaze omkring snittet. Lav en livmoderhorn synlig og træk det forsigtigt ud med stumpe pincet på PBS-skyllede gauze. Skyl livmoderen med PBS meget ofte at holde det altid fugtig (figur 2A og 2B). Under hele proceduren undgå at trække mesometrium eller livmoderen stram, da højt tryk inde i livmoderen vil sende til embryo øge chancerne for tab af væske ved injektion resulterer i abort.
4.. DNA injektion i hjerneventriklen
- Hold livmoderen på en sådan måde, at hjerneventriklerne kan visualiseres. Må ikke udstrakt flytte et foster, der ligger i en ugunstig position - dette kun øger chancerne for abort.
- Ser man på fosterets hoved fra oven, lokalisere visuelt kløften eller revne mellem venstre og højre kortikale halvkugle. De halvkugler er nemme at skelne og de laterale ventrikler inde i dem (ikke til at være rettet) kan som regel opfattes som noget mørkere former. Hvis et foster er fundet at være perfekt orienteret for DNA-injektion (Figures 2C og 2D), er det muligt at gennembore livmodervæggen og ind i den tredje ventrikel på én gang. Hold glasmikropipette ved 45 ° til livmodervæggen og punktere det ved rostralt ende af kløften mellem kortikale halvkugle, gennemtrængende for omkring 1 mm. På denne måde spidsen af glasmikropipette træder den tredje ventrikel i hjernen (ikke den laterale ventrikel) (figur 2C og 2D). I embryoner ringere orienterede er det nyttigt først at gennembore livmodervæggen (altid ved 45 °) i nærheden af den embryonale hoved, placere mikropipettespids i den rigtige position mellem de cortikale halvkugle og først derefter perforere hjernen. Injicer omkring 1 pi DNA-opløsning ind i den tredje ventrikel (en god indsprøjtning fylder ventriklen med grøn væske). Gentag den samme procedure med alle embryoner af én livmoderhorn. Dette giver lidt tid for DNA-opløsningen for at blande jævnt med den ventrikulære væske og nå entire neuroepithelium.
5.. Målretning af Hypothalamus for Elektroporation
- Tænd elektroporator på og justere indstillinger i henhold til den embryonale alder (for E12.5 vi bruger 5 firkantpulser, 50 V, 50 msek ON/950 msek OFF). Anvendelse som positive pol af rustfrit stål nål elektrode (CUY550-10) og som negativ pol en rund flad elektrode (CUY700P4L). (Det er vigtigt at elektroderne er mindre end embryonet, da ellers den aktuelle bare flyder rundt embryonet, men ikke gennem det.)
- Vælg for elektroporation embryoner, hvis dorsalsiden er op (dvs. vendt mod forsøgslederen) (som de fleste af dem er), og kassér dem, hvis orientering er ikke gunstige. Det er nu sikkert at røre ved livmoderen med ethanol-desinficerede fingre eller med handsker. Holding livmoderen med en pincet, ville imidlertid forstyrre strømmen under elektroporation.
- Pierce livmodervæggen ved embryo hoved mellem amniotic sac og placenta ved at støde nedad gennem det med spidsen af nålen elektrode. Brug pegefingeren på den anden hånd som skubbeklodsen. Omkring 5 mm i elektrode spids skal være nu mellem fosterhinden og livmodervæggen, omtrent på niveau midthjernen (figur 2E og 2F). Husk, at dette er "rettet mod elektroden", så dens position vil afgøre, hvilken del af hypothalamus neuroepithelium er mest sandsynligt at blive transfekteret. Embryoet skal være meget forsigtigt "klemt" mellem elektroderne.
- Med den anden hånd, placere rund flad elektrode uden for livmoderen væg på den modsatte side af fosterets hoved (figur 2E og 2G).
- Brug pedalen skifte til at anvende spænding (50 V, 50 msek ON, 950 msek OFF, 5 firkantpulser).
- Træk langsomt nåleelektrode ud af livmoderen, mens du holder tilbage i livmoderen med pegefingeren på den anden side - hvis amniotic væske går tabt gennem det punkterede væg, sædvanligvis fosteret vil undergå abort. Gentag proceduren med alle embryoner.
- Retur livmoderhornet i maven og gentag injektion og elektroporation i rest horn.
6.. Efterbehandling Surgery
- Efter injektion og elektroporation af alle embryoner, placere livmoderen tilbage i maven meget omhyggeligt, placeret nøjagtigt som de var før, og fugtig bughulen med saltvand, før du lukker det.
- Sy bughinden med catgut (Vicryl polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). For lukningen af huden brug "afbrød søm" methodwith en mere modstandsdygtig sutur (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L).
- Desinficere maven overflade med povidon-iod (Braunoderm) og injicere en ikke-steroid antiinflammatorisk subkutant (fx 100 pi af en 1:10 opløsning af Rimadyl i 0,9% NaCl) eller, endnu bedre, en opioid ligesom BUprenorphine (Temgesic, fra 0,05 til 0,1 mg / kg legemsvægt i 0,9% NaCl) til at lindre smerter.
- Tag moderen fra anæstesiapparatet og placere den i et bur, der er opvarmet af en varmepude. Overvåg musen kontinuerligt indtil den er helt tilbagebetalt fra anæstesi. Senere tjek dyrene dagligt for at forsikre de er ved at komme fra proceduren uden nogen tegn på infektion eller smerte.
7.. Analysere resultaterne
- Høste embryoner (eller postnatals) ifølge den ønskede dag for analyse. Postnatal mus (1 til 2 dage gamle) aflives ved halshugning.
- Adskil hver foster ifølge den tidligere elektroporation annotation. Dissekere hjernen under et stereomikroskop og tjek under mikroskop for grønt fluorescerende signal (fra GFP reporter) i det relevante område.
- Den valgte hjerne kan analyseres "friske": fastsætte vævet for en kort tid i 4% paraformaldehyd og indkapsle i agarose 4% eller i gelatine-enlbumin, så afsnittet om en vibratome-typen enhed (figur 3). For mere detaljeret immunhistokemisk analyse (figur 4), cryo-beskytte hjernen i 30% saccharose opløsning, indkapsle i OCT montering medium (Tissue Tek) derefter skæres 20 um snit i en kryostat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fleste hypothalamus neuroner er født mellem E11.5 til E15.2 ifølge fødsel-dating analyse rotte 26 oversat til noget kortere musen udvikling 27,28. Toppen af hypothalamus neurogenese nås ved E12.5 29-31. Følgelig, ved transfektion alder valgt til denne undersøgelse (E12.5), kan en stor del af hypothalamus neuroner mærkes på et givent Rostro-caudale niveau.
Analyse ved E18.5 på tykke vibratome-typen sektioner (fig. 3A og 3B) viser, at hele Rostro-caudale forlængelse af hypothalamus neuroepithelium er tilgængelig for elektroporation (figur 3A). På ethvert givet alder, kan neuroner mærkes på alle medio-laterale niveauer (figur 3B) efter aftale med slægt undersøgelser 32.. Det mammillary kroppen (MBO) er en neuronal kerne udvikler fra neuroepithelium foring en fordybning i den mest Ventral og caudale del af forhjernen. Dette gør MBO i princippet meget vanskeligt at målet. Funktionelt, MBO er en central struktur for hukommelse konsolidering og dens patologiske degeneration resulterer i anterograd amnesi 33.. Vi har været i stand til at transficere reporterplasmider meget specifikt i denne kerne (figur 3C og 3D). MBO neuroner strækker axoner danner to meget karakteristiske og funktionelt vigtige skrifter som også mærket efter transfektion (pilespidser i figur 3C). Tværsnit viser, at neuroner født på E12.5 (alder af transfektion) udgør en buet "lag" omkring en ikke-mærket masse af neuroner genererede tidligere (dvs. før transfektion forsøget fandt sted) (figur 3D).
Ud over de generelle trækmønstre vist ved undersøgelse på tykke sektioner ved hjælp af fluorescerende reporter proteiner, en nærmere analyse af de resultater, der lavesIBLE anvendelse af specifikke antistoffer på cryostatsnit (figur 4). At analysere eksempel valgt her, MBO, vi forberedt vandrette sektioner parallel med planet af de radiale glial processer udspringer fra mammillary reces (figur 4A). Vi derefter identificeret de MBO neuroner født fra neuroepithelium mærket på E12.5 ved hjælp af antistoffer mod GFP (figur 4B). Som forventet, antistoffet mærket en begrænset gruppe MBO celler (pilespids i figur 4B, 4C og 4D). Denne gruppe blev placeret mellem to umærket laterale og mediale MBO områder svarende til henholdsvis MBO neuroner født før (lateral) og efter (mediale) E12.5. Som et eksempel, vi her co-farvet med et antistof mod nestin (rød i figur 4C og 4D) for at vise migration tilstanden af individuelt mærkede neuroner på radial glia processer neuroepithelium.
Figur 1. Relative positioner for Hypothalamus og cortex midgestation. Sagittal (A) og tværgående (B) diagrammer af hjernen af en midgestation museembryo viser mest dorsale og mest overfladiske forhjerne struktur, cortex (CTX, blå) samt den mest dybt placeret forhjerne struktur, hypothalamus (HY, rød).
Figur 2. Diagram af proceduren. (A) Den gravide mor er bedøvet, og livmoderen udsat for. (B) I hvert livmoderens hævelse identificere den placentale indsættelse (black pilespids)placenta (PL) og embryo. ME, mesometrium. (C) Identificere injektionen punkt i midten af venstre og højre kortikale halvkugle (rød X). (D) indsprøjtes DNA-opløsning ind i den tredje ventrikel. (E) Nålen elektrode (positive) gennemborer livmodervæggen mellem foster og placenta indsættelse. Den flade elektrode (negativ) hviler på fri side af livmoderen. (F) Hypotetisk set fra placenta side viser positionen af den positive elektrode langs hypothalamus. (G) View fra den frie side af livmoderen viser placeringen af den negative elektrode.
Figur 3. Transfektion hele hypothalamus eller en del af det. Tyk vibrerende-mikrotomknive sektioner af fire forskelligevildtype E18.5 musehjerner viser hypothalamus efter in utero transfektion af plasmid DNA, der bærer fluorescerende reporter gener GFP (A, C) eller CFP (B, D) ved E12.5. (A) sagittal sektion (rostralt til venstre) viser en hypothalamus transficeret fra rostralt caudal. Målestokken 500 um. (B) tværsnit. På den transficerede side, kan mærkede celler findes på alle medio-laterale niveauer. (C) Sagittal afsnit, der viser en specifik transfekteret mammillary kroppen (stiplet linje, asterisk) og mærkning af dets karakteristiske axonal træet (pilespidser). (D) tværsnit gennem mammillary legeme (stiplet linie). På elektroporerede side (stjerne), et mærket bånd svarende til neuroner født E12.5 kan ses. Hy, hypothalamus, Th, thalamus
Figur 4.. Analyserer specifikke skridt i hypothalamus udvikling. (A) Diagram over et vandret snit gennem hjernens udvikling viser mammillary legeme (rød). Regionen afbildet i (B) og (C) er indrammet. (B) Antistof mærkning af GFP på en vandret snit gennem E18.5 mammillary kroppen efter GFP transfektion på E12. Celler født på E12.5 udgør et særskilt bånd i kernen (pilespids i B, C og D). Scale bar 100 pm. (C) Antistof mærkning af neuroepitel markør nestin (rød) på sektionen vist i (B). Målestokken 100 pm. (D) Individuelle celler kan identificeres i specifikke E12.5 band i mammillary kroppen under stor forstørrelse. Målestok 20 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om anæstesi: Da i livmoderen elektroporation i hypothalamus kan være teknisk vanskelig og kræve længere bedøvelsestilstand gange, vi foretrækker at inducere og vedligeholde anæstesi gennem administration af en blanding af oxygen og isofluran. Det er vores erfaring, kan dyrene forbliver passende bedøvet på denne måde i perioder på op til en time i det mindste, inddrivelse af moderen er meget hurtigt, og embryo overlevelse forbedres. Andre tilgange til anæstesi er også tilgængelige. Den mest enkle fremgangsmåde består i at inducere og opretholde narkose ved intraperitoneal injektion af 2,5 ml / kg legemsvægt af en blanding af ketamin (25 mg / ml), xylazin (1,2 mg / ml) og Acepromazin (0,35 mg / ml) i 0,9 % steril NaCl ("triple combo"). Med denne blanding alene ved de anbefalede doser her er en narkose på omkring 30 min (op til 45 min i nogle tilfælde) induceret. Dette er normalt nok til i livmoderen elektroporation i cortex ved E12.5 (gennem injfdeling i den laterale ventrikel). Fordelen ved denne metode er, at det er helt undgår behovet for en narkose-enhed og andet udstyr. Imidlertid er denne type af intraperitoneal anæstesi ikke anbefales, hvis længere tider for kirurgi er nødvendig, da yderligere injektioner i bedøvede dyr med henblik på at forlænge anæstesi periode ofte følges med døden. Det er også muligt at kombinere intraperitoneal og indånding anæstesi ved først at bruge en injektion af "triple combo" (som ovenfor) for at inducere narkose, og derefter holde den ved inhalation af isofluran / ilt. Selv med denne særlige metode narkose kan opretholdes, så længe det er nødvendigt, inddrivelse af den gravide mus efter operationen er ikke så god som med inhalation alene. Desuden når vi bruger "triple combo" intraperitoneal injektion, embryo overlevelse falder.
Placeringen af elektroderne på fosterets hoved som afbildet i Den laparotomi er enkle nok. Imidlertid forsøgslederen når niveau af dygtighed, der giver mulighed for høj overlevelse forholdet embryoner (efter intraventrikulær injektion efterfulgt af indgivelse af elektriske pulser) efter en flad indlæringskurve. Individuel dygtighed er en vigtig faktor, så i livmoderen elektroporation i almindelighed og dens anvendelse til hypothalamus i særdeleshed kan bevise ikke helt praktisk for nogle elever . For at afkorte den lærende periode samt at øge reproducerbarhed og statistisk analyse har vi fundet det nyttigt at fylde en detaljeret protokol, herunder oplysninger om antallet og placeringen af embryoner og udseende, kvaliteten af injektion og omtrentlige placering af elektroder til de individuelle embryoer. Sammenligning af disse data om forsøget med de endelige resultater på et embryo-by-embryo basis har vist sig nyttig til at forstå og forbedre proceduren. Andre rapporter 20,21 har målrettet hypothalamus med Nepagene pincet-type elektroder. Vi konsekvent opnår bedre resultater med anvendelsen af en kanyle-elektrode og en flad cover-elektrode af samme fabrikant. Det er vores erfaring, gør brug af denne metode Rostro-caudale målretning lettere. Pincet elektroder synes at kræve enten mere erfaring / dygtighed eller et langt større antal af forsøg med henblik på at give brugbare resultater.
Den anden gruppe af fremgangsmåder undgår kirurgi fuldstændigt, da den er baseret på indsprøjtning af konstruktionerne til transfektion ind i blodet af gravide mus. Halevenen (halevenen) injektion af shRNA 34,35 eller plasmiderne 36 har potentialet til at manipulere genetisk meget tidlige embryoner, selvom region målretning ikke er muligt med denne metode. Denne lovende tilgang synes ikke endnu ikke klar til generel anvendelse. Viruspartikler (adeno-associeret virus) indsprøjtet i ansigtet vene af neonatale mus (men ikke ældre mus) er i stand til at transficere hjerneneuroner 37. Endelig kan nanopartikler, hvilket i sidste ende kan bruges som DNA luftfartsselskaber, når hjernen efter halen vein injektion til voksne mus 38. Disse to metoder, der åbner mulighed for at transficere meget tidlige embryoner, er nødt til at vores viden ikke er blevet brugt på gravide mus.
Age of transfektion og indsamling: For at lære den procedure, er det nok bedst at forsøge at transfektere E14.5 embryoner og derefter opgradere til tidligere, mere vanskelige embryonale aldre. Det er vores erfaring, er GFP udtryk synlige i UV lys allerede 24 timer efter transfektion. Efter E12.5 transfektion er GFP udtryk E18.5 meget stærk. Vi har elektroporeres ved E12.5, E13.5, E14.5 og E15.5 og analyseres ved E17.5, E18.5, P0 og P1 være i stand til at finde en stærk reporter udtryk i alle tilfælde. Når embryoer hvis hjerner er blevet transficeret i livmoderen får lov til at nå sigt (for postnatal dataindsamling), nogle gange er de selektivt spist af moderen. Dette tyder subtile ændringer i ungernes udseende eller adfærd fremkaldt af hjernen manipulation (deres temperaturen kan være lavere, eller måske de ikke udsender de rigtige lydsignaler). I de postnatal dyr, der overlever mødres nedslagtning, har vi observeret reporter udtryk indtil P1 i det mindste. Rapporter i litteraturen viser ekspressionen af transfekterede konstruktioner endda fire måneder efter fødslen 10..
Vektorer til elektroporation: vi bruger bicistronisk reporterplasmider drevet af CAG promotor 39, efterfulgt af cDNA'et af genet af interesse, adskilt af et internt ribosomindgangssted (IRES) 40, fra cDNA'et af et fluorescerende reporter, for eksempel forbedrede grønt fluorescerende protein 41. CAG promotor er så stærk i neuroner at det kan producere DNA-niveauer for høj for de transficerede celler, dræbe dem. Selvom vi aldrig har observeret massiv apoptose efter transfektion en mulig løsning, burde problemet forekommer, ville være anvendelsen af en mindre effektiv promotor, ligesom EF1 alpha 42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af den tyske Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
- Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
- Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
- Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
- Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
- Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
- Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
- Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
- Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
- Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
- Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
- Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
- Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
- Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).
