Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Genetisk manipulering av musen Utvikling Hypothalamus gjennom Published: July 24, 2013 doi: 10.3791/50412
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg, 2Institut de recherches cliniques de Montreal
* These authors contributed equally

Summary

Til tross for den funksjonelle og medisinsk viktighet av hypothalamus,

Abstract

Genmodifisering av spesifikke regioner av utviklingsland hjernen hos pattedyr er en svært kraftig eksperimentell tilnærming. Men, genererer nye mus mutanter er ofte frustrerende trege. Det har blitt vist at tilgang til musen hjernen utvikler seg i livmoren med rimelig post-operatory overlevelse er mulig. Likevel har resultatene med denne prosedyren blitt rapportert nesten utelukkende for den mest overfladiske og lett tilgjengelig del av utviklingen av hjernen, dvs. cortex. Thalamus, en smalere og mer medial regionen, har vist seg vanskeligere å målrette. Transfection inn dypere kjerner, spesielt de av hypothalamus, er kanskje de mest utfordrende og derfor svært få resultater har blitt rapportert. Her viser vi en prosedyre for å målrette hele hypothalamus neuroepithelium eller deler av det (hypothalamus regioner) for transfeksjon gjennom elektroporering. Nøklene til vår tilnærming er lengre narkose ganger, injeksjon i tHird ventrikkel, og hensiktsmessig form og plassering av elektrodene. I tillegg har vi viser resultatene av målretting og påfølgende histologisk analyse av de forsenkede hypothalamus kjernen, den mammillary legeme.

Introduction

Genetisk manipulasjon av den embryoniske mus hjernen er en foretrukket metode for å lære om utviklingsmessige regulering. Generering av muterte mus linjer er imidlertid tregt og dyrt. En kraftig metode for å introdusere spesifikke genetiske endringer i utviklingen av nerveceller i hjernen hos pattedyr er i utero electroporation. I hovedsak består av teknikken for å transfektere DNA i den embryoniske hjerne neuroepithelium ved hjelp av elektriske pulser, så tillater embryoet for å overleve i en viss tid, samler hjernen og undersøker dem for mulig roman, informative fenotyper. På denne måten kan experimenter teste hypoteser nesten umiddelbart uten lange ventetider er nødvendige for produksjon av muse mutanter.

Transfeksjon av DNA i utviklingsland embryo startet med i ovo electroporation på kyllingembryo en. Den viktige proof-of-concept for musen ble utført i kultur i fosterlivet 3,4.

Hovedproblemet er å transfektere hjernen av embryoer utvikler seg i livmoren uten å drepe dem eller moren. Lære å utføre den nødvendige operasjonen (laparotomi, injeksjon, elektroporering) krever en lang treningsperiode. Når operasjonen har blitt mastret til det punktet hvor embryo overlevelse forholdet er akseptabelt, er den neste viktige spørsmålet: Hvilken strukturer i hjernen er tilgjengelige? Ikke overraskende, de første publiserte artikler viser resultatene som oppnås med i utero electroporation fokusert på hjernebarken 5-9. Dette er fortsatt til stede for de fleste av publikasjonene ved hjelp av denne teknikken, ettersom den region av mus utvikler hjerne mest tilgjengelige for kirurgiske prosedyrer er cortex (figur 1). Fremgangsmåten for in utero elektroporering inn i korteks er blitt beskreveti 10 print og video 11-14. En modifikasjon av den teknikk som kan brukes for å målrette et ventrale del av telencephalon, basal ganglia 15..

Utover telencephalon, er diencephalon (klassisk delt i thalamus og hypotalamus) en region av forhjernen mer vanskelig å nå. Et lite antall papirer rapporter målretting av sin dorsal og mest tilgjengelige delen, thalamus 16-19.

Hypotalamus er den mest ventrale del av forhjernen, derfor den ene lokaliserte dypest fra framsiden (cortex) (figur 1). Denne regionen er fortsatt en vanskelig utfordring for forskerne forpliktet til genetisk manipulere mus hjernen i fosterlivet. Så vidt vi vet, bare svært få artikler rapportere om resultater av i fosterlivet transfeksjon i musen hypothalamus 20,21. Men den funksjonelle betydning av hypothalamus cannot overvurderes, siden det regulerer atferd som spiser og drikker, parring, avl og oppdragelse 22. Videre endringer i hypothalamus utvikling bidrar til å stamme senere i livet tilstander som fedme, høyt blodtrykk, diabetes og veslevoksne puberteten 23. Å kunne endre genetisk hypothalamus under utvikling vil gi et svært kraftig verktøy for å forstå det.

Den grunnleggende kirurgisk protokoll for laparotomi av drektige mus som vi bruker her er lik den som brukes i andre protokoller 11,13,14,24. Vi vil beskrive dem her kort for fullstendighet. Nøkkelen til vår fremgangsmåte, på den annen side er typen av anestesi, stedet for injeksjonen, den type av elektroder, og innsetting og plassering av den positive elektroden i forhold til embryoet hode. Vi foretrekker å indusere og opprettholde anestesi gjennom gass inhalering over enkel intraperitoneal anestesi, ettersom den førstnevnte tillaternoe lengre perioder av narkose som kreves for en vanskelig operasjon. Isofluran innånding resulterer i raskere utvinning fra anestesi, siden vanligvis mor demonstrerer normal oppførsel allerede minutter etter operasjonen. Den enkleste punkt av injeksjon av den DNA-løsning med glasset mikropipette er den laterale ventrikkel, som imidlertid er helt uegnet for hypothalamus elektroporering. Injeksjon direkte i den tredje ventrikkel er faktisk avgjørende å målrette dype diencephalic strukturer. Det er mulig å transfektere hypothalamus fra E12.0 eller E12.5 med standard, off-the-sokkel elektroder. Vi har funnet noen av elektrodene fremstilt av Nepa Gene (Chiba, Japan) som er særlig egnet til dette formål.

Med prosedyre vår får vi transfeksjon av hele hypothalamus neuroepithelium eller delvis, regional transfeksjon avhengig av elektroden orientering. Her kan vi demonstrere teknikken ved transfektere den mammillary kroppen, uten tvilden dypeste og mest innfelt av alt hypothalamus kjerner. I tillegg, viser vi detaljert Histologisk analyse av de transfekterte cellene ned til det cellulære nivået av oppløsning.

En sammenligning av i utero electroporation med andre tilnærminger til transfeksjon musen utviklingen av hjernen i fosterlivet kan bli funnet i diskusjonen delen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Utarbeidelse av DNA og Glass Mikropipetter for Injection

  1. God kvalitet glass mikropipetter er avgjørende for å redusere innledende høy aborttall grunn av tap av fostervann. Prosedyren for å trekke glass mikropipetter har blitt godt dokumentert 13,18,25. Bruk 1,2 mm diameter kapillærer trekkes i en konvensjonell Sutter P-97 enhet med innstillingene P = 500; Heat = 300; Trekk = 40; Velocity = 50; tid = 50. Monter avtrekker med 3 mm "trough" filamenter (Sutter Instrument FT330B). De 2 mm størrelse filamenter har gitt for oss mindre tilfredsstillende resultater. På den annen side, ikke fasing av mikropipette tips ikke ser ut til å forbedre resultat for oss.
  2. Oppløs renset, endotoksin-fritt plasmid DNA i PBS (Cell Culture Grade) inneholdende 0,1% Fast Grønn til en endelig konsentrasjon på 1 til 2 mg / mL. Fast grønne vil gjøre det injiserte løsning synlig i embryonale hjerne ventrikkel.
  3. Load 10 ul av DNA-løsningen inn i glasset mikropipette. Koble glass mikropipette til innsprøytningssystemet (Pico Pump) eller munn pipette.

2. Anestesi

Klargjør den kirurgiske bordet med en varmepute og kirurgiske instrumenter. Slå på kald-lyskilder for å legge til rette for visualisering av embryoene. Desinfisere kirurgiske verktøy å bruke for eksempel et glass perle sterilisator.

Tre forskjellige anestesi prosedyrer er mulig for denne protokollen (se diskusjon). Her vil vi beskrive det vi mener er den beste, ved hjelp av isofluran innånding for anestesi induksjon (flow rate 0,5 L / min) samt vedlikehold (flow rate 1 L / min).

  1. Introdusere den gravide mus i en liten gjennomsiktig (slik at mus er synlig) container koblet til Komesaroff Mark 5 Bedøvelse enhet med en kort lengde på slangen.
  2. Fyll fordamper med isofluran, åpne deretter oksygenflaske kobles til enheten. Blås en eller to pulser av isoflUrane / oksygen (0,5 l / min) i beholderen holder musen og se etter narkose å stille i.
  3. Ta musen ut, dekker øynene med salve for å hindre dem fra å tørke og monter flyt anestesi maske på hodet umiddelbart.

3. Laparotomi

  1. Plasser musen magen opp på oppvarming pad (ellers dens kroppstemperatur vil gå ned veldig fort, minkende sjansene for utvinning) og sikre sin kropp på plass ved å feste sine fire ben til sidene med tape. Vurdere dybden av anestesi ved å sjekke for tap av respons på refleks stimulering (f.eks tå eller hale klype med fast trykk).
  2. Barbere bukhinnen og desinfisere den med iodophorpovidone-jod (Braunoderm).
  3. Lag et langsgående snitt (1 til 1,5 cm lange) på den abdominale hud. Deretter kuttet bukhule. Plasser bomull gasbind rundt snittet. Gjør en livmor horn synlig og trekk den forsiktig ut med sløv tang på PBS-skylles gauze. Skyll livmoren med PBS meget ofte for å holde det alltid fuktet (figurene 2A og 2B). Under hele prosedyren ikke å trekke i mesometrium eller livmoren tett, ettersom høyt trykk inne i livmoren, sender til embryoet øker sjansene for at tap av væske ved injeksjon resulterer i abort.

4. DNA Injeksjon i Brain ventrikkel

  1. Hold livmoren på en slik måte at hjernen ventriklene kan visualiseres. Ikke mye omplassere et embryo som ligger i en ugunstig posisjon - dette bare øker sjansene for abort.
  2. Ser på embryo hode fra toppen, lokalisere visuelt gapet eller sprekken mellom venstre og høyre kortikale halvkule. Halvkuler er lett å skille og den laterale ventriklene inni dem (for ikke å være målrettet) kan vanligvis bli oppfattet som noe mørkere figurer. Hvis et embryo er funnet å være helt orientert for DNA injeksjon (Figures 2C og 2D), er det mulig å stikke hull på livmorveggen, og angir den tredje ventrikkel på en gang. Holde glasset mikropipette ved 45 ° til livmorveggen og punktering det ved rostral enden av mellomrommet mellom cortical halvkuler, gjennomtrengende i ca 1 mm. På denne måten kan tuppen av glass mikropipette vil gå inn i tredje ventrikkel av hjernen (ikke den laterale ventrikkel) (figur 2C og 2D). I embryo mindre gunstig orientert er det nyttig å først pierce livmorveggen (alltid ved 45 °) i nærheten av embryonale hodet, plasserer mikropipette tips i riktig posisjon mellom hjernebark halvkuler og bare da perforere hjernen. Injiser omtrent 1 pl DNA-oppløsning inn i den tredje ventrikkel (en god injeksjon fyller ventrikkel med grønn væske). Gjenta samme prosedyre med alle embryoer fra en livmor horn. Dette gir litt tid for DNA løsning å blande jevnt med ventrikkel væske og nå entire neuroepithelium.

5. Målretting Hypotalamus for Electroporation

  1. Slå electroporator på og justere innstillingene i henhold til embryonale alder (for E12.5 vi bruker fem kvadrat-bølge pulser, 50 V, 50 ms ON/950 msek OFF). Bruk som positiv pol i rustfritt stål nålelektrode (CUY550-10) og som negativ pol en rund flat elektrode (CUY700P4L). (Det er viktig at elektrodene er mindre enn embryo, siden ellers strøm bare flyter rundt embryoet, men ikke gjennom den.)
  2. Velg for elektroporering disse embryoer som dorsal side er opp (dvs. vendt mot experimenter) (som de fleste av dem er), og kast dem som orientering er ikke gunstig. Det er nå trygt å ta livmoren med etanol-desinfisert fingrene eller med hansker. Holding livmoren med pinsett, vil imidlertid forstyrre flyten av strøm i løpet av elektroporering.
  3. Pierce livmorveggen av embryo hode mellom amniotic sac og placenta ved skyvning nedover gjennom den med spissen av nålen elektroden. Bruk pekefingeren på den andre hånden som forankringsblokk. Omtrent 5 mm fra elektrodespissen skal nå mellom det fostervann sac og livmorveggen, til omtrent nivået av midthjernen (fig. 2E og 2F). Husk at dette er "rettet mot elektroden", så sin posisjon vil bestemme hvilken del av hypothalamus neuroepithelium er mest sannsynlig å få tilført. Embryoet må være svært forsiktig "klemt" mellom elektrodene.
  4. Med den andre hånden til å plassere det runde flate elektroden utenfor livmoren veggen på motsatt side av embryoet hode (figurene 2E og 2G).
  5. Bruk pedal bryteren til å søke spenning (50 V, 50 ms PÅ, 950 ms OFF, 5 kvadrat-bølge pulser).
  6. Trekk nålelektrode ut av livmoren, mens holde tilbake i livmoren med pekefingeren på den annen side - hvis amniotic væske tapt gjennom punktert veggen, vanligvis embryoet vil gjennomgå abort. Gjenta fremgangsmåten med alle embryoer.
  7. Returnere livmor horn i buken og gjenta injeksjon og electroporation blant de overlevende horn.

6. Avslutte kirurgi

  1. Etter injeksjon og electroporation av alle embryoer, plasserer livmoren tilbake i buken veldig nøye, plassert nøyaktig slik de var før og fuktig bukhulen med saltvann før du lukker den.
  2. Sy peritoneum med kirurgisk katgut (Vicryl polyglaktin 910, 5-0, Ethicon V4914). For nedleggelsen av huden bruk "avbrutt sting" methodwith en mer motstandsdyktig sutur (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L).
  3. Desinfisere buken overflate med povidon-jod (Braunoderm) og injisere et ikke-steroid anti-inflammatorisk subkutant (for eksempel 100 ul av en 01:10 oppløsning av Rimadyl i 0,9% NaCl) eller, enda bedre, en opioid som buprenorphine (Temgesic, 0,05 til 0,1 mg / kg kroppsvekt i 0,9% NaCl) for å lindre smerte.
  4. Fjern mor fra Anestesiapparat og legg den i et bur som er oppvarmet av en varmepute. Overvåke musen kontinuerlig til det er helt restituert fra anestesi. Senere, sjekk dyrene daglig for å forsikre de er utvinne fra prosedyren uten noen tegn på infeksjon eller smerter.

7. Analysere resultatene

  1. Høste embryoer (eller postnatals) i henhold til ønsket dag i analysen. Postnatale mus (1 til 2 dager gammel) blir drept ved halshugging.
  2. Separer hver embryo i henhold til forrige electroporation merknader. Dissekere hjernen under et stereomikroskop og sjekke under mikroskop for grønne fluorescerende signal (fra GFP reporter) i den aktuelle regionen.
  3. Den valgte hjernen kan analyseres "friske": fikse vev for en kort tid i 4% paraformaldehyde og bygge inn i agarose 4% eller gelatin-enlbumin, deretter delen på en vibratome-type enhet (figur 3). For mer detaljert immunhistokjemisk analyse (figur 4), Cryo-beskytter hjernen i 30% saccharose løsning, bygge inn i oktober montering medium (Tissue Tek) og deretter klippe 20 mikrometer seksjoner i en cryostat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De fleste hypothalamus nevroner er født mellom E11.5 til E15.2, ifølge fødsel-dating analyse hos rotte 26 oversettes til noe kortere mus utvikling 27,28. Toppen av hypothalamus neurogenesis nås ved E12.5 29-31. Følgelig, ved transfeksjon alder valgt for dette studiet (E12.5), kan en stor andel av hypotalamiske neuroner merkes til enhver rostro-kaudal nivå.

Analyse ved E18.5 på tykke vibratome-type seksjoner (figurene 3A og 3B) viser at hele rostro-kaudal forlengelse av hypothalamus neuroepithelium er tilgjengelig for elektroporering (figur 3A). Til enhver tid, kan nevroner merkes på alle medio-laterale nivåer (Figur 3B), i samråd med avstamning studier 32. Den mammillary kroppen (MBO) er en neuronal kjerne utvikler fra neuroepithelium fôr en fordypning i de mest Ventral og kaudale del av forhjernen. Dette gjør MBO i prinsippet svært vanskelig å målrette. Funksjonelt, er det MBO en sentral struktur for hukommelse konsolidering og dets patologiske degenerasjon resultater i anterograd amnesi 33. Vi har vært i stand til å transfektere reporter plasmider veldig spesielt inn i denne kjernen (Tall 3C og 3D). MBO nevroner forlenge axoner danner to svært karakteristiske og funksjonelt viktige traktater som også er merket etter transfeksjon (pilspisser i Figur 3C). Tverrgående deler viser at nervecellene født ved E12.5 (alder av transfeksjon) danner en buet "lag" rundt en ikke-merket masse av nerveceller som genereres tidligere (dvs. før transfeksjon eksperimentet fant sted) (Figur 3D).

Utover det generelle vandringsmønster vist ved undersøkelse på tykke seksjoner med hjelp av fluorescerende reporter proteiner, en nærmere analyse av resultatene er possvertible bruke spesifikke antistoffer på kryostaten seksjoner (figur 4). For å analysere eksempel valgt her, MBO, utarbeidet vi horisontale seksjoner parallelt med planet for de radiale glial prosesser som kommer fra mammillary utsparing (figur 4A). Vi identifiserte MBO nevroner født fra neuroepithelium merket på E12.5 ved hjelp av antistoffer mot GFP (Figur 4B). Som forventet, merket antistoff en begrenset gruppe av celler MBO (pilhode i figur 4B, 4C og 4D). Denne gruppen ble plassert mellom to umerkede lateral og medial MBO områder som tilsvarer henholdsvis MBO nevroner født før (lateral) og etter (medial) E12.5. Som et eksempel, her vi co-farget med et antistoff mot nestin (rød i figurene 4C og 4D) for å vise den migrering modusen for individuelt merkede nevroner i radial glial prosesser i neuroepithelium.


Figur 1. De relative posisjoner av hypothalamus og Cortex ved midgestation. Sagittal (A) og tverrgående (B) diagrammer av hjernen til en midgestation museembryo viser den mest dorsale og mest overfladiske struktur forhjerne, cortex (CTX, blå) så vel som den dypest plassert forebrain struktur, hypothalamus (HY, rød).

Figur 2
Figur 2. Diagram av prosedyren. (A) Den gravide demningen er bedøvet og livmor utsatt. (B) I hver livmor hevelse identifisere placenta innsetting (svart pilspiss),placenta (PL) og embryo. ME, mesometrium. (C) Identifiser injeksjon punkt i midten av venstre og høyre kortikale halvkule (rød X). (D) Injiser DNA-løsning i den tredje ventrikkel. (E) Den nålelektrode (positiv) skjærer livmorveggen mellom embryo og placenta innsetting. Den flate elektrode (negativ) hviler på den fri side av livmoren. (F) Hypotetisk utsikten fra placenta side viser posisjonen av den positive elektroden langs hypothalamus. (G) Se fra den frie side av livmoren som viser plasseringen av den negativ elektrode.

Figur 3
Figur 3. Transfektere hele hypothalamus eller deler av det. Tykke vibrerende-mikrotom deler av fire ulikevill-type E18.5 mus hjerner viser hypothalamus etter in utero transfeksjon av plasmid DNA bærer fluorescerende reporter gener GFP (A, C) eller CFP (B, D) på E12.5. (A) Sagittal seksjon (rostral til venstre) viser en hypothalamus tilført fra rostral til kaudal. Skalalinje 500 mikrometer. (B) Tverrgående delen. På den transfekterte side, kan merket celler bli funnet på alle medio-laterale nivåer. (C) Sagittal delen viser en spesielt tilført mammillary kroppen (stiplet linje, stjerne) og merking av sin karakteristiske aksonal treet (pilspisser). (D) Tverrgående seksjon gjennom mammillary legeme (stiplet linje). På den side elektroporert (stjerne), et merket bånd svarer til nevroner født på E12.5 kan sees. Hy, hypothalamus, Th, thalamus

Figur 4 Figur 4. Analysere bestemte trinn i hypothalamus utvikling. (A) Diagram av et horisontalt snitt gjennom utviklingen av hjernen som viser mammillary legeme (rød). Regionen avbildet i (B) og (C) er innrammet. (B) Antistoff merking av GFP på en horisontal seksjon gjennom E18.5 mammillary kroppen etter GFP transfeksjon på E12. Celler født ved E12.5 danne et distinkt bånd i kjernen (pilspiss i B, C og D). Skalalinje 100 mikrometer. (C) Antistoff merking av neuroepithelial markør nestin (rød) på strekningen vist i (B). Skalalinje 100 mikrometer. (D) Individuelle celler kan identifiseres i den spesifikke E12.5 bandet i mammillary organ under høy forstørrelse. Skalalinje 20 mikrometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Om anestesi: Siden i utero electroporation inn i hypothalamus kan være teknisk krevende og krever lengre narkose ganger, foretrekker vi å indusere og vedlikeholde anestesi ved administrasjon av en blanding av oksygen og isofluran. I vår erfaring, kan dyr være hensiktsmessig bedøvet på denne måten i perioder på inntil én time minst, er utvinning av moren veldig fort, og embryo overlevelse forbedret. Andre tilnærminger til anestesi er også tilgjengelig. Den enkleste fremgangsmåte består i å indusere og opprettholde narkose ved intraperitoneal injeksjon av 2,5 ml / kg kroppsvekt av en blanding av ketamin (25 mg / ml), Xylazin (1,2 mg / ml) og Acepromazin (0.35 mg / ml) i 0,9 % sterilt NaCl ("triple combo"). Med denne blanding alene ved doser som anbefales her, er en narkose av omtrent 30 minutter (opp til 45 min i noen tilfeller) indusert. Dette er vanligvis nok for i utero electroporation inn i cortex på E12.5 (via injection i den laterale ventrikkel). Fordelen med denne metoden er at den helt unngår behovet for et narkose-enhet og annet utstyr. Imidlertid er denne type intraperitoneal anestesi ikke anbefalt dersom lengre tider av kirurgi er nødvendig, siden ytterligere injeksjoner i bedøvet dyret for å forlenge anestesi periode er ofte etterfulgt av døden. Det er også mulig å kombinere intraperitoneal og innånding anestesi ved først å bruke en injeksjon av "triple kombinasjon" (som ovenfor) for å indusere anestesi, og deretter opprettholde den ved inhalering av isofluran / oksygen. Selv med denne spesielle metode for narkose kan opprettholdes så lenge som det er nødvendig, er utvinning av den gravide mus etter operasjonen ikke så god som med inhalasjon alene. I tillegg, når vi bruker "triple combo" intraperitoneal injeksjon, minsker embryo overlevelse.

Posisjoneringen av elektroden på embryoet hode som avbildet i

Den laparotomy er grei nok. Imidlertid, når experimenter nivået av dyktighet som gir høy overlevelse forhold på embryoer (etter intraventrikulær injeksjon etterfulgt av administrering av elektriske pulser) etter en flat kurve læring. Individuelle ferdigheter er en viktig faktor, slik at i utero electroporation generelt og sin søknad til hypothalamus spesielt kan vise seg ikke helt praktisk for enkelte elever . Å forkorte læring periode samt å øke reproduserbarheten og statistisk analyse vi har funnet det nyttig å fylle en detaljert protokoll med opplysninger om antall og plassering av embryoene, og utseendet, kvaliteten på injeksjon og omtrentlig plassering av elektroder for de enkelte embryoer. Sammenligning av disse data om forsøket med de endelige resultater, på et embryo-for-embryo basis har vist seg nyttig for å forstå og forbedre fremgangsmåten.

Andre rapporter 20,21 har målrettet hypothalamus med Nepagene pinsett-type elektroder. Vi konsekvent oppnå bedre resultater med bruk av en nål-elektrode og en flat cover-elektrode av samme produsent. I vår erfaring, gjør bruk av denne metoden rostro-kaudal målretting enklere. Pinsetten elektroder synes å kreve enten mer erfaring / dyktighet eller et mye større antall eksperimenter for å gi brukbare resultater.

jove_content "> Minst to andre tilnærminger til transfektere DNA-konstruksjoner i utviklingsland musen hypothalamus kan sammenlignes med i utero electroporation. Den første er også basert på laparotomi og injeksjon i embryonale hjernen hjertekammer, forskjellen er at DNA av interesse er båret av en viral partikkel Det infiserer neuroepithelial celler og på denne måten transfects vårt eksperimentelle konstruksjon - ingen elektroporering er nødvendig Fordeler:.. prosedyren unngår de elektriske pulser som er nødvendige for elektroporering, derfor embryo overlevelse sannsynligvis forbedrer De viktigste ulempene med denne metode. er: 1) arbeid med virus krever spesielle forholdsregler og S2 fasiliteter, 2) målretting er uaktuelt, siden viruspartikler vil spre seg over hele ventrikkel slik at det i prinsippet like sannsynlig å transfektere noen neuroepithelial regionen (selvfølgelig en viss grad av transfeksjon inn i regionen av interesse er sannsynlig). Of course, i fosterlivet i fosterlivet elektroporering, dvs. relativt vanskelig kirurgi prosedyre, med en lang læringskurve avhengig sterkt på de individuelle ferdighetene til eksperimentator.

Den andre gruppen av tilnærminger unngår kirurgi fullstendig, ettersom det er basert på injeksjon av konstrukter til å transfektere i blodet av den gravide mus. Halevenen (kaudal vene) injeksjon av shRNA 34,35 eller plasmider 36 har potensial til å manipulere genetisk svært tidlige embryoer, selv om regionen målretting er ikke mulig med denne metoden. Denne lovende tilnærming synes ennå ikke klar for allmenngjøring. Viruspartikler (adeno-assosiert virus) injisert i ansikts vein av neonatal mus (men ikke eldre mus) er i stand til å transfektere hjernens nerveceller 37. Endelig kan nanopartikler, som til slutt kan brukes som DNA-bærere, nå hjernen etter halen vein injeksjon hos voksne mus 38. Disse to metodene, som åpner muligheten for transfektere svært tidlige embryoer, må vår kunnskap ennå ikke blitt brukt på gravide mus.

Age of transfeksjon og innsamling: For å lære prosedyren, er det sannsynligvis best å prøve å transfektere E14.5 embryoer, og deretter oppgradere til tidligere, vanskeligere embryonale aldre. Vår erfaring er GFP uttrykk synlig under UV-lys allerede 24 timer etter transfeksjon. Etter E12.5 transfeksjon, er GFP uttrykk på E18.5 veldig sterk. Vi har electroporated på E12.5, E13.5, E14.5, og E15.5 og analysert ved E17.5, E18.5, P0 og P1 er i stand til å finne sterke reporter uttrykk i alle tilfeller. Når embryo hvis hjerner har blitt tilført i fosterlivet er tillatt for å nå sikt (for postnatal datainnsamling), noen ganger er de selektivt spist av moren. Dette tyder subtile endringer i valp utseende eller atferd forårsaket av hjernen manipulasjon (deres temperature kunne være lavere, eller kanskje de ikke avgir de riktige lydsignaler). I de postnatale dyr som overlever mors avhorning, har vi observert reporter uttrykk inntil P1 minst. Rapporter i litteraturen viser uttrykk for transfekterte konstruerer selv fire måneder etter fødselen 10.

Vektorer for elektroporering: vi bruker bicistronic reporter plasmider er drevet av den CAG promoter 39, etterfulgt av cDNA av genet av interesse, separert av en intern ribosom inngang stedet (IRES) 40, fra cDNA av et fluorescerende reporter, for eksempel den forbedrede grønt fluorescerende protein 41. Den CAG promoter er så sterk i nevroner at den kan produsere nivåer av DNA for høyt for transfekterte celler, drepe dem. Selv om vi har aldri observert massiv apoptose etter transfeksjon, er en mulig løsning, bør problemet ser, vil være bruk av en mindre effektiv promoter, som EF1 alfa 42..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av den tyske Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  REAGENTS
Acepromazine Sanofi GmbH anesthetic
Isoflurane Baxter HDG9623 anesthetic
Ketamin Pharma GmbH anesthetic
Fast Green Fluka 44715  
Rimadyl Pfizer non-steroidal anti-inflammatory
Braunoderm Braun 3887138 povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBS Gibco 14190  
Temgesic (buprenorphine) Essex Pharma opioid analgesic
Eye Ointment Pan-Ophtal 7136926  
Xylazine Bayer  
  EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 Medical Developments Australia ACN 004 903 682  
Capillary puller P-97 Sutter Instrument Co. P-97  
Compresstome Precisionary Instr. VF-300 Vibratome-type device
Confocal Microscope Zeiss LSM700  
Cryostat Leica CM3050S  
Electroporator Nepa Gene Co. Ltd. CUY21EDIT  
Electrode 1 Nepa Gene Co. Ltd. CUY550-10 Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2 Nepa Gene Co. Ltd. CUY700P4L Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light source Leica KL2500 LCD  
Glass capillaries Harvard Apparatus GC120T-15 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizer Fine Science Tools FST250  
Heating pad Harvard Apparatus py872-5272  
Injection device World Precision Instruments Pneumatic Pico Pump PV820  
Suture Thread Coated Vicryl Ethicon V4914 Peritoneal Suture
Suture Thr. Supramid Serag Wiessner TO07171L Skin Suture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
  2. Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
  7. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
  8. Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
  9. Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  12. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  14. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  15. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
  16. Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
  17. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  19. Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  20. Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
  21. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
  22. Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
  23. Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
  24. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
  25. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
  26. Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
  27. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
  28. Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
  29. Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
  30. Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
  31. Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
  32. Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
  33. Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
  34. Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
  35. Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
  36. Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
  37. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  38. Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
  39. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  40. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
  41. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  42. Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).

Tags

Nevrovitenskap nevrobiologi genetikk cellebiologi molekylær biologi Biomedical Engineering utviklingsbiologi anatomi fysiologi Embryo Pattedyr Brain diencephalon Hypothalamus genetiske teknikker Transfection anestesi utvikling elektroder elektroporering, Mammillary kroppen mus dyremodell
Genetisk manipulering av musen Utvikling Hypothalamus gjennom<em&gt; I utero</em&gt; Electroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, … More

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, N. E., Zhou, X., Alvarez-Bolado, G. Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (77), e50412, doi:10.3791/50412 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter