Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Genmanipulation av Mouse Utveckla Hypothalamus genom Published: July 24, 2013 doi: 10.3791/50412
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg, 2Institut de recherches cliniques de Montreal
* These authors contributed equally

Summary

Trots den funktionella och medicinsk betydelse av hypotalamus,

Abstract

Genetisk modifiering av specifika regioner i tredje däggdjurshjärnan är en mycket kraftfull experimentell metod. Men generera mutanter nya mus är ofta frustrerande långsamt. Det har visats att tillgången till mushjärnan utvecklas i livmodern med rimlig post-operationslampan överlevnad är möjlig. Ändå har resultat med detta förfarande har rapporterats nästan uteslutande i de mest ytliga och lättillgänglig del av den växande hjärnan, dvs cortex. Thalamus, ett smalare och mer medial region, har visat sig vara svårare att rikta. Transfektion in djupare kärnor, speciellt de av hypotalamus, är kanske den mest utmanande och därför mycket få resultat har rapporterats. Här visar vi ett förfarande för att rikta hela hypotalamus neuroepitelet eller en del av det (hypotalamus regioner) för transfektion genom elektroporation. Nycklarna till vårt tillvägagångssätt är längre narkos gånger, injektion i tREDJE ventrikeln, och lämplig typ och positionering av elektroderna. Dessutom visar vi resultaten av inriktning och efterföljande histologisk analys av de försänkta hypotalamus kärnan, mammillary kroppen.

Introduction

Genetisk manipulation av embryonala mus hjärnan är en föredragen metod för att lära sig om utvecklings-reglering. Alstring av mutanta mus linjer är emellertid långsam och dyr. En kraftfull metod för att introducera specifika genetiska förändringar i utvecklingen av nervceller i däggdjur hjärnan är i livmodern elektroporering. Sammanfattningsvis består tekniken av transfekterande DNA i den embryonala hjärnan neuroepitelet med hjälp av elektriska pulser, sedan låta embryot att överleva under en viss tid, samla hjärnan och undersöka dem för eventuell roman, informativa fenotyper. På detta sätt, kan försöksledaren testa hypoteser nästan omedelbart utan långa väntetider är nödvändiga för framställning av mus mutanter.

Transfektion av DNA in i utvecklande embryon började med i ovo elektroporering på kycklingembryon 1. Den väsentliga proof-of-concept för musen utfördes i kulturen i livmodern 3,4.

Det största problemet är att transfektera hjärnan av embryon utvecklas i livmodern utan att döda dem eller modern. Att lära sig att utföra nödvändig kirurgi (laparotomi, injektion, elektroporation) kräver en lång utbildningsperiod. När operationen har bemästrat till den punkt där embryoöverlevnad förhållandet är acceptabelt, är nästa viktiga fråga: vilka hjärnstrukturer är tillgängliga? Inte överraskande, den första publicerade artiklar visar resultat erhållna med i livmodern elektroporering fokuserat på kortikal utveckling 5-9. Detta är fortfarande sant för de flesta av de publikationer som använder denna teknik, eftersom området för det sig utvecklande mushjärnan mest tillgängliga för kirurgiska ingrepp är cortex (figur 1). Förfarandet för i livmodern elektroporering in i cortex har beskrivitsi tryck 10 och i videon 11-14. En modifiering av den teknik som kan användas för att rikta en ventral del av telencefalon, de basala ganglierna 15.

Bortom telencephalon är diencefalon (klassiskt uppdelad i thalamus och hypotalamus) en region av framhjärnan svårare att nå. Ett litet antal papper rapporter riktar sin rygg och mest tillgängliga delen, thalamus 16-19.

Hypotalamus är den mest ventrala delen av framhjärnan, varför en lokaliserad djupast från den dorsala ytan (cortex) (figur 1). Denna region är fortfarande en svår utmaning för forskarna åtagit sig att genetiskt manipulera mushjärnan i livmodern. Till vår kunskap, endast ett fåtal artiklar rapportera om resultaten av in utero transfektion i musen hypotalamus 20,21. Emellertid den funktionella betydelsen av hypothalamus cannot överskattas, eftersom det reglerar beteenden som att äta och dricka, parning, avel och föräldraskap 22. Dessutom förändringar i hypotalamus utveckling bidrar till att härröra senare i livet tillstånd som fetma, högt blodtryck, diabetes och för tidig pubertet 23. Att kunna ändra genetiskt hypotalamus under utveckling skulle ge ett mycket kraftfullt verktyg för att förstå det.

Den grundläggande kirurgiska protokoll för laparotomi av dräktiga möss som vi använder här är liknande den som används i andra protokoll 11,13,14,24. Vi kommer att beskriva dem här kort för fullständighet. Nyckeln till vårt förfarande, å andra sidan, är den typ av anestesi, platsen för injektionen, typen av elektroder och införande och placering av den positiva elektroden i förhållande till embryots huvud. Vi föredrar att inducera och underhålla anestesi genom gas inandning över enkel intraperitoneal anestesi, eftersom den förstnämnda möjliggörnågot längre narkos krävs för en svår operation. Isofluran inandning resulterar i snabbare återhämtning från anestesi, eftersom vanligtvis modern demonstrerar normalt beteende redan minuter efter operationen. Det enklaste punkten för injektion av DNA-lösningen med glasmikropipett är den laterala ventrikeln, som dock är helt olämpliga för hypotalamus elektroporering. Injektion direkt i den tredje ventrikeln är verkligen avgörande att rikta djupa diencephalic strukturer. Det är möjligt att transfektera hypotalamus från E12.0 eller E12.5 med standard, off-the-shelf elektroder. Vi har funnit en del av elektroderna som tillverkas av Nepa Gene (Chiba, Japan) särskilt lämpad för detta ändamål.

Med vårt förfarande erhåller vi transfektion av hela hypotalamus neuroepitelet eller delvis, regional transfektion beroende på elektrod orientering. Här kan vi demonstrera tekniken genom transfektion av mammillary kroppen, utan tvekanden djupaste och mest infälld allt hypotalamus kärnor. Dessutom visar vi detaljerad histologisk analys av de transfekterade cellerna ner till cellnivå av upplösning.

En jämförelse av i livmodern elektroporering med andra metoder för transfektion musen utvecklar hjärnan i livmodern kan hittas i diskussionen avsnittet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Framställning av DNA och glas Mikropipetter för injektion

  1. Bra kvalitet glas mikropipetter är viktigt att minska initial hög aborter på grund av förlust av fostervatten. Proceduren att dra glas mikropipetter har dokumenterats väl 13,18,25. Använd 1,2 mm diameter kapillärer drog i en konventionell Sutter P-97-enheten med inställningarna P = 500; Heat = 300; Pull = 40; Hastighet = 50; Tid = 50. Montera avdragaren med 3 mm "tråg" trådar (Sutter Instrument FT330B). De 2 mm storlek filament har gett för oss mindre tillfredsställande resultat. Å andra sidan, gör avfasning av mikropipett tips verkar inte att förbättra resultaten för oss.
  2. Lös renad, endotoxinfri plasmid-DNA i PBS (Cell Culture Grade) innehållande 0,1% Fast Green till en slutlig koncentration på 1 till 2 pg / pl. Fast grönt gör den injicerade lösningen syns i den embryonala hjärnan ventrikeln.
  3. Ladda 10 | il av DNA-lösningen i glaset mikropipett. Anslut glasmikropipett till insprutningssystemet (Pico Pump) eller mun pipett.

2. Anestesi

Förbered operationsbordet med en värmedyna och de kirurgiska instrumenten. Slå på kall-ljuskällor för att underlätta visualisering av embryona. Desinficera kirurgiska verktyg med exempelvis ett glas pärla autoklav.

Tre olika anestesi förfaranden är möjliga för detta protokoll (se diskussion). Här kommer vi att beskriva det vi anser bäst, med isofluran inandning för anestesi induktion (flödeshastighet 0,5 L / min) samt underhåll (flöde 1 L / min).

  1. Introducera den gravida mus i en liten transparent (så musen förblir synlig) behållare ansluten till Komesaroff Mark 5 Anestetisk-enhet av en kort rörlängd.
  2. Fyll förångaren med isofluran, öppna sedan syrgasflaskan ansluten till enheten. Blås en eller två pulser av isoflurane / syrgas (0,5 L / min) in i kärlet med musen och titta för narkos för att ställa in
  3. Ta musen ut, täcka sina ögon med salva för att förhindra dem från uttorkning och montera maskflöde anestesi på huvudet omedelbart.

Tre. Laparotomi

  1. Placera musen mage upp på värmedyna (annars dess kroppstemperatur kommer att gå mycket snabbt, vilket minskar chanserna för återhämtning) och säkra sin kropp på plats genom att fastställa sina fyra ben åt sidorna med tejp. Bedöma anestesidjupet genom att kontrollera för förlust av svar på reflex stimulering (t.ex. tå eller svans nypa med fast tryck).
  2. Raka buken ytan och desinficera det med iodophorpovidone-jod (Braunoderm).
  3. Gör ett längsgående snitt (1 till 1,5 cm långa) på bukhuden. Skär sedan bukhinnan. Placera gasväv runt snittet. Gör en livmoderhornet synligt och dra ut det försiktigt med trubbig pincett på PBS-sköljda gauze. Skölj livmodern med PBS mycket ofta för att hålla det alltid fuktad (figurerna 2A och 2B). Under hela proceduren Undvik att dra i mesometrium eller livmodern tight, eftersom högt tryck inne i livmodern kommer att anmäla till embryot ökar chanserna för förlust av vätska vid injektion resulterar i abort.

4. DNA Injektion i hjärnan Ventricle

  1. Håll livmodern på ett sådant sätt att de hjärnventriklarna kan visualiseras. Inte utsträckning flytta ett embryo som ligger i en ogynnsam ställning - detta bara ökar chanserna för abort.
  2. Man tittar på embryots huvud uppifrån, lokalisera visuellt gapet eller spricka mellan de vänstra och högra kortikala halvkloten. De halvklot är lätta att urskilja och de laterala ventriklarna inuti dem (inte att riktade) kan vanligtvis uppfattas som något mörkare former. Om ett embryo visar sig vara perfekt orienterad för DNA-injektion (Figures 2C och 2D), är det möjligt att genomtränga livmoderväggen och in i den tredje ventrikeln på en gång. Håll glasmikropipett vid 45 ° mot livmoderväggen och punktera den vid den rostrala änden av mellanrummet mellan kortikala halvklot, genomträngande i ungefär 1 mm. På detta sätt kan spetsen på glasmikropipett skall inleda den tredje ventrikeln i hjärnan (ej den laterala ventrikeln) (figurerna 2C och 2D). I embryon mindre förmånligt orienterade det är nyttigt att först genomtränga livmoderväggen (alltid vid 45 °) i närheten av den embryonala huvudet, placera mikropipett spets i rätt position mellan de kortikala halvkloten och först därefter perforera hjärnan. Injicera omkring 1 pl DNA-lösning i den tredje ventrikeln (en bra injektion fyller kammaren med grön vätska). Upprepa samma procedur med alla embryon av en livmoder horn. Detta tillåter viss tid för DNA-lösningen kan blandas jämnt med den ventrikulära vätskan och nå entire neuroepitel.

Fem. Inriktning hypotalamus för Elektroporering

  1. Slå elektroporator på och justera inställningarna enligt den embryonala ålder (för E12.5 vi använder 5 fyrkantsignaler pulser, 50 V, 50 ms ON/950 ms OFF). Använd som positiva polen på rostfri nål elektrod (CUY550-10) och som en negativ pol en rund platt elektrod (CUY700P4L). (Det är viktigt att elektroderna är mindre än embryot, eftersom annars den aktuella bara strömmar runt embryot men inte genom den.)
  2. Välj för elektroporering dessa embryon vars ryggsidan är upp (dvs. vände mot försöksledaren) (som de flesta av dem är), och kassera dem vars inriktning är inte gynnsam. Det är nu säkert att röra livmodern med etanol-desinficerade fingrar eller med handskar. Håll livmodern med pincett emellertid skulle störa flödet av ström under elektroporering.
  3. Pierce livmoderväggen av embryot huvud mellan amniotic säcken och moderkakan, vid tryck nedåt genom den med spetsen av nålen elektroden. Använd pekfingret på den andra handen som stödblock. Ca 5 mm av elektrodspetsen måste vara nu mellan fostersäcken och livmoderväggen, ungefär vid nivån av mitthjärnan (figurerna 2E och 2F). Kom ihåg att detta är den "targeting elektrod", så dess ställning kommer att avgöra vilken del av hypotalamus neuroepitelet är mest sannolikt att få transfekterades. Embryot måste vara mycket försiktigt "inklämd" mellan elektroderna.
  4. Med den andra handen, placera den runda platta elektroden utanför livmodern väggen på motsatt sida av embryot huvud (figur 2E och 2G).
  5. Använd pedalbrytaren att applicera spänning (50 V, 50 ms ON, 950 ms AV, 5 fyrkantsignaler pulser).
  6. Dra långsamt nålelektroden ur livmodern samtidigt som du håller tillbaka livmodern med pekfingret på den andra sidan - om amniotic vätska försvinner genom den punkterade väggen, oftast embryot kommer att genomgå abort. Upprepa proceduren med alla embryon.
  7. Återgå livmoderhornet i buken och upprepa injektion och elektroporering i kvarlevan horn.

6. Färdigställ Kirurgi

  1. Efter injektion och elektroporation av alla embryon, placera livmodern tillbaka in i buken mycket noga, placerad precis som de var innan och fuktiga bukhålan med koksaltlösning innan du stänger den.
  2. Sutur bukhinnan med katgut (Vicryl polyglaktin 910, 5-0, Ethicon V4914). För nedläggningen av huden användning "avbröt syr" methodwith en mer beständig sutur (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TILL 07171L).
  3. Desinficera buken yta med povidon-jod (Braunoderm) och injicera en icke-steroid antiinflammatorisk subkutant (t.ex. 100 | il av en 1:10 lösning av Rimadyl i 0,9% NaCl) eller, ännu bättre, en opioid som buprenorphine (Temgesic, 0,05 till 0,1 mg / kg kroppsvikt i 0,9% NaCl) för att lindra smärta.
  4. Avlägsna modern från anestesiapparaten och placera den i en bur som är uppvärmd av en värmedyna. Övervaka musen kontinuerligt tills det är helt återhämtat sig från anestesi. Senare, kolla djuren dagligen för att försäkra att de återhämtar sig från förfarandet utan några tecken på infektion eller smärta.

7. Analysera resultaten

  1. Skörda embryon (eller postnatals) enligt önskad dag av analys. Postnatal möss (1 till 2 dagar gamla) dödas genom dekapitering.
  2. Separera varje embryo enligt föregående elektroporation anteckningen. Dissekera hjärnan under ett stereomikroskop och kolla i mikroskop för grönt fluorescerande signal (från GFP reporter) i rätt region.
  3. Den valda hjärnan kan analyseras "färska": fix vävnaden under en kort tid i 4% paraformaldehyd och bädda in i agaros 4% eller i gelatin-albumin, därefter ett avsnitt på en vibratome-anordning (Figur 3). För mer detaljerad immunhistokemisk analys (Figur 4), Cryo-skydda hjärnan i 30% sackaroslösning, bädda in i oktober monteringsmedium (Tissue Tek) klipps sedan 20 um sektioner i en kryostat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De flesta hypotalamus nervceller föds mellan E11.5 till E15.2, enligt födelse-dejting analys hos råtta 26 översättas till något kortare musen utveckling 27,28. Toppen av hypotalamus neurogenesisen nås vid E12.5 29-31. Följaktligen, vid transfektion ålder valdes för denna studie (E12.5), kan en stor del av hypotalamus nervceller märkas vid varje given rostro-caudal nivå.

Analys på E18.5 på tjocka vibratom-typ sektioner (figurerna 3A och 3B) visar att hela rostro-kaudala förlängning av hypotalamus neuroepitelet är tillgänglig för elektroporation (figur 3A). Vid varje given ålder, kan neuroner märkas på alla medio-laterala nivåer (Figur 3B), i samförstånd med härstamning studier 32. Den mammillary kroppen (MBO) är en neuronal kärna utvecklar från neuroepitelet beklädnad av en urtagning i den mest Ventral och kaudala delen av framhjärnan. Detta gör MBO i princip mycket svårt att målet. Funktionsmässigt är MBO en viktig struktur för minne konsolidering och dess patologiska resultat degeneration i anterograd amnesi 33. Vi har kunnat transfektera reporterplasmider mycket specifikt i denna kärna (figur 3C och 3D). MBO nervceller förlänga axoner bildar två mycket karakteristiska och funktionellt viktiga områden som också är märkta efter transfektion (pilspetsar i figur 3C). Tvärgående sektioner visar att nervceller föds vid E12.5 (ålder av transfektion) bildar en krökt "skikt" runt en icke-märkt massa av nervceller genereras tidigare (dvs. före transfektionsexperiment skedde) (Figur 3D).

Utöver de allmänna migrationsmönster visas genom undersökning på tjocka sektioner med hjälp av fluorescerande proteiner, en närmare analys av resultaten är Possible användning av specifika antikroppar på kryostatsnitt (Figur 4). För att analysera valda exemplet här, MBO, framställde vi horisontella sektioner parallella med planet för de radiella glial processer som härrör från den mammillary urtagning (figur 4A). Vi identifierade därefter de MBO nervceller föds från neuroepithelium märkt på E12.5 med hjälp av antikroppar mot GFP (Figur 4B). Som förväntat märkt antikroppen en begränsad grupp av MBO celler (pilspets i figurerna 4b, 4c, och 4d). Denna grupp var beläget mellan två omärkt laterala och mediala MBO områden motsvarar respektive MBO nervceller födda före (lateral) och efter (medial) E12.5. Som ett exempel, här samarbetar vi färgades med en antikropp mot nestin (röd i figurerna 4C och 4D) i syfte att visa att migration läget av individuellt märkta nervceller på radiella gliaceller processer neuroepitelet.


Figur 1. Relativa lägen i hypotalamus och Cortex vid midgestation. Sagittal (A) och tvärgående (B) diagram i hjärnan av en midgestation musembryo visar den mest dorsala och mest ytliga framhjärnan struktur, cortex (CTX, blå) samt den djupast placerade forebrain struktur, hypotalamus (HY, röd).

Figur 2
Figur 2. Diagram av förfarandet. (A) Den gravida dammen är sövda och livmodern exponeras. (B) I varje livmoder svullnad identifiera moderkakan insättning (svart pil),placenta (PL) och embryo. ME, mesometrium. (C) Identifiera injektionspunkten i mitten av den vänstra och högra kortikala halvklotet (rött X). (D) Injicera DNA-lösning i den tredje ventrikeln. (E) nålelektroden (positiv) genomborrar livmoderväggen mellan embryot och moderkakan insättning. Den platta elektroden (negativ) vilar på den fria sidan av livmodern. (F) Hypotetisk utsikt från moderkakan sida visar positionen för den positiva elektroden längs hypothalamus. (G) Utsikt från den fria sidan av livmodern som visar läget för negativa elektroden.

Figur 3
Figur 3. Transfektera hela hypotalamus eller del av den. Tjocka vibrerande-mikrotomen sektioner av fyra olikavildtyp E18.5 mushjärnor visar hypotalamus efter in utero transfektion av plasmid-DNA som bär fluorescerande reporter gener GFP (A, C) eller GFP (B, D) vid E12.5. (A) sagittalsnitt (rostralt till vänster) visar en hypotalamus transfekterad från rostralt till stjärtfenan. Skala bar 500 um. (B) tvärsnitt. På den transfekterade sidan, kan märkta celler hittas på alla medio-laterala nivåer. (C) sagittalsnitt visar ett specifikt transfekterad mammillary kropp (streckad linje, asterisk) och märkning av dess karakteristiska axonal träd (pilspetsar). (D) tvärsnitt genom mammillary kroppen (streckad linje). På electroporated sidan (asterisk), en märkt band motsvarande neuroner födda E12.5 kan ses. Hy, hypotalamus, Th, thalamus

Figur 4 Figur 4. Analysera konkreta steg i hypotalamus utveckling. (A) Diagram av en horisontell sektion genom den växande hjärnan visar mammillary kroppen (röd). Regionen visas i (B) och (C) är inramade. (B) Antikropp märkning av GFP på ett horisontellt snitt genom E18.5 mammillary kroppen efter GFP transfektion på E12. Celler födda hos E12.5 bildar ett distinkt band i kärnan (pilspets i B, C och D). Skala bar 100 um. (C) Antikropp märkning av neuroepiteliala markören nestin (röd) på den del som visas i (B). Skala bar 100 um. (D) Enskilda celler kan identifieras i den specifika E12.5 bandet i mammillary kroppen under hög förstoring. Scale bar 20 | im.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Om anestesi: Eftersom i livmodern elektroporering i hypotalamus kan vara tekniskt krävande och kräver längre narkos gånger, vi föredrar att inducera och underhålla anestesi genom administrering av en blandning av syre och isofluran. I vår erfarenhet, kan djuren vara lämpligt nedsövd på detta sätt för perioder på upp till en timme åtminstone, är återvinning av mamman mycket snabbt, och embryo överlevnad förbättrats. Andra tillvägagångssätt för anestesi finns också. Den enklaste förfarande består av att inducera och upprätthålla narkos genom intraperitoneal injektion av 2,5 ml / kg kroppsvikt av en blandning av ketamin (25 mg / ml), Xylazin (1,2 mg / ml) och Acepromazin (0,35 mg / ml) i 0,9 % steril NaCl ("triple combo"). Med denna blandning ensam, vid de doser som rekommenderas här, är en narkos av ca 30 min (upp till 45 min i vissa fall) induceras. Detta brukar räcka för i livmodern elektroporering in i hjärnbarken vid E12.5 (genom injektion i den laterala ventrikeln). Fördelen med denna metod är att den helt undviker behovet av en narkos-enheten och annan utrustning. Dock är denna typ av intraperitoneal anestesi rekommenderas inte om längre tider av operation är nödvändig, eftersom ytterligare injektioner i sövda djur i syfte att förlänga anestesin period ofta följs av döden. Det är också möjligt att kombinera intraperitoneal och inhalationsanestesi genom att först använda en injektion av "triple combo" (som ovan) för att inducera narkos, sedan behålla det genom inhalation av isofluran / syre. Även med denna metod narkosen kan upprätthållas så länge som det behövs, är återhämtningen av den gravida musen efter operationen inte lika bra som vid inandning ensam. Dessutom, när vi använder "triple combo" intraperitoneal injektion, minskar embryoöverlevnad.

Placeringen av elektroderna på embryots huvud avbildat såsom i

Den laparotomi är enkel nog. Dock når försöksledaren graden av skicklighet som möjliggör hög överlevnad mellan embryon (efter intraventrikulär injektion följt av administration av elektriska pulser) efter en platt inlärningskurva. Individuell skicklighet är en viktig faktor för att i livmodern elektroporering i allmänhet och dess tillämpning till hypothalamus i synnerhet kan bevisa inte helt praktiskt för en del elever . För att förkorta läroperioden samt öka reproducerbarheten och statistisk analys har vi funnit det lämpligt att fylla ett detaljerat protokoll, inklusive uppgifter om antal och placering av embryona, och utseendet, kvaliteten på injektionsstället samt ungefärlig position av elektroderna för de individuella embryon. Jämföra dessa uppgifter om experimentet med de slutliga resultaten, på ett embryo-för-embryo basis har visat sig användbar för att förstå och förbättra förfarandet.

Andra rapporter 20,21 har riktat hypotalamus med Nepagene pincett-typ elektroder. Vi får genomgående bättre resultat med tillämpning av en nål-elektrod och en platt lock-elektrod av samma tillverkare. I vår erfarenhet, gör användningen av denna metod rostro-caudal inriktning lättare. Pincett elektroder verkar kräva antingen mer erfarenhet / kunskap eller ett mycket större antal experiment för att ge användbara resultat.

jove_content "> kan Åtminstone två andra metoder för att transfektera DNA-konstruktioner i utvecklingsländerna musen hypothalamus jämföras i livmodern elektroporering. Den första är också baserat på laparotomi och injektion i den embryonala hjärnan kammare, med den skillnaden att det intressanta DNA är bärs av en viral partikel Viruset infekterar neuroepitelceller och på så sätt transfects vår experimentella konstruktion - ingen elektroporation behövs Fördelar:.. förfarandet undviker de elektriska pulserna som krävs för elektroporering, därför embryoöverlevnad förmodligen förbättrar De huvudsakliga nackdelarna med denna metod. är: 1) arbete med virus kräver speciella försiktighetsåtgärder och S2 anläggningar, 2) inriktning är uteslutet, eftersom viruspartiklar kommer att spridas över hela kammaren gör det i princip lika sannolikt att transfektera någon neuroepiteliala region (naturligtvis en viss grad av transfektion in i regionen av intresse är troligt). Naturligtvis i utero i livmodern elektroporering, dvs relativt svåra kirurgi förfarande, med en lång inlärningskurva beroende starkt på de individuella färdigheter försöksledaren.

Den andra gruppen av metoder undviker kirurgi helt, eftersom den grundar sig på injektion av konstruktionerna att transfektera in i blodomloppet av den gravida musen. Svansven (kaudalven) injektion av shRNA 34,35 eller plasmider 36 har potential att manipulera genetiskt mycket tidiga embryon, även region-specifik inriktning är inte möjligt med den här metoden. Denna lovande metod verkar ännu inte redo för allmän tillämpning. Virala partiklar (adeno-associerat virus) injicerade i ansiktet åder av neonatala möss (men inte äldre möss) är i stånd att transfektera hjärnans nervceller 37. Slutligen kan nanopartiklar, som så småningom skulle kunna användas som DNA-bärare, når hjärnan efter svansen vein injektion i vuxna möss 38. Dessa två metoder, som öppnar möjligheten för transfektion mycket tidiga embryon, måste vår kunskap ännu inte använts på dräktiga möss.

Age of transfektion och insamling: För att lära sig förfarandet, är det förmodligen bäst att försöka transfektera E14.5 embryon, och sedan uppgradera till tidigare, svårare embryonala åldrar. Enligt vår erfarenhet är GFP uttryck synliga i UV ljus redan 24 timmar efter transfektion. Efter E12.5 transfektion, är GFP uttryck på E18.5 mycket stark. Vi har elektroporerades vid E12.5, E13.5, E14.5 och E15.5 och analyseras vid E17.5, E18.5, P0 och P1 att kunna hitta en stark reporter uttryck i alla fall. När embryon vars hjärnor har transfekterats in utero tillåts nå term (för postnatal datainsamling), ibland är de selektivt uppätna av mamman. Detta tyder på subtila förändringar i valp utseende eller beteende orsakas av hjärnans manipulation (deras temperaTure kan vara lägre, eller kanske de inte avger de rätta ljudsignaler). I de postnatala djur som överlever maternal avlivning, har vi observerat reporter uttryck fram till P1 åtminstone. Rapporter i litteraturen visar expression av transfekterade konstruktioner även fyra månader efter födseln 10.

Vektorer för elektroporering: vi använder bicistroniska reporterplasmider drivs av CAG-promotorn 39, följt av cDNA: t i genen av intresse, separerade av ett internt ribosominträdesställe (IRES) 40, från cDNA av en fluorescerande reporter, exempelvis den förbättrade grönt fluorescerande protein 41. Den CAG-promotorn är så stark i de nervceller som det kan producera DNA-nivåer för hög för de transfekterade cellerna, döda dem. Även om vi aldrig har sett massiv apoptos efter transfektion, en möjlig lösning, bör problemet förefaller, skulle vara att använda en mindre effektiv promotor, liksom EF1 alfa 42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats av det tyska Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  REAGENTS
Acepromazine Sanofi GmbH anesthetic
Isoflurane Baxter HDG9623 anesthetic
Ketamin Pharma GmbH anesthetic
Fast Green Fluka 44715  
Rimadyl Pfizer non-steroidal anti-inflammatory
Braunoderm Braun 3887138 povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBS Gibco 14190  
Temgesic (buprenorphine) Essex Pharma opioid analgesic
Eye Ointment Pan-Ophtal 7136926  
Xylazine Bayer  
  EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 Medical Developments Australia ACN 004 903 682  
Capillary puller P-97 Sutter Instrument Co. P-97  
Compresstome Precisionary Instr. VF-300 Vibratome-type device
Confocal Microscope Zeiss LSM700  
Cryostat Leica CM3050S  
Electroporator Nepa Gene Co. Ltd. CUY21EDIT  
Electrode 1 Nepa Gene Co. Ltd. CUY550-10 Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2 Nepa Gene Co. Ltd. CUY700P4L Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light source Leica KL2500 LCD  
Glass capillaries Harvard Apparatus GC120T-15 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizer Fine Science Tools FST250  
Heating pad Harvard Apparatus py872-5272  
Injection device World Precision Instruments Pneumatic Pico Pump PV820  
Suture Thread Coated Vicryl Ethicon V4914 Peritoneal Suture
Suture Thr. Supramid Serag Wiessner TO07171L Skin Suture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
  2. Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
  7. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
  8. Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
  9. Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  12. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  14. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  15. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
  16. Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
  17. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  19. Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  20. Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
  21. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
  22. Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
  23. Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
  24. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
  25. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
  26. Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
  27. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
  28. Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
  29. Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
  30. Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
  31. Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
  32. Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
  33. Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
  34. Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
  35. Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
  36. Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
  37. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  38. Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
  39. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  40. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
  41. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  42. Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).

Tags

Neurovetenskap neurobiologi genetik cellbiologi molekylärbiologi Medicinsk teknik utvecklingsbiologi anatomi fysiologi Embryo däggdjur Brain Diencephalon hypotalamus genteknik transfektion anestesi utveckling elektroder elektro, Mammillary kropp mus djurmodell
Genmanipulation av Mouse Utveckla Hypothalamus genom<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, … More

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, N. E., Zhou, X., Alvarez-Bolado, G. Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (77), e50412, doi:10.3791/50412 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter