Summary
A pesar de la importancia clínica y funcional del hipotálamo,
Abstract
La modificación genética de regiones específicas del cerebro de los mamíferos es el desarrollo de un enfoque experimental muy potente. Sin embargo, la generación de nuevos mutantes de ratón suele ser lento y frustrante. Se ha demostrado que el acceso al cerebro de ratón en desarrollo en el útero con la supervivencia post-operatoria razonable es posible. Sin embargo, los resultados de este procedimiento se han reportado casi exclusivamente para la parte más superficial y de fácil acceso del cerebro en desarrollo, es decir, la corteza. El tálamo, una región más estrecha y más medial, ha resultado más difícil objetivo. Transfección en los núcleos más profunda, especialmente aquellos del hipotálamo, es quizás los resultados más difíciles y por lo tanto, muy pocos han sido reportados. Aquí se demuestra un procedimiento para orientar todo el neuroepitelio hipotalámica o parte de él (regiones hipotalámicas) para la transfección por medio de electroporación. Las claves de nuestro enfoque ya narcosis tiempos, inyección en el third ventrículo, y amable y la colocación de los electrodos apropiados. Además, mostramos los resultados de la focalización y el posterior análisis histológico del núcleo hipotalámico más rebajada, el cuerpo mamilares.
Introduction
La manipulación genética del cerebro de ratón embrionario es un enfoque preferido para aprender acerca de la regulación del desarrollo. La generación de líneas de ratones mutantes sin embargo, es lento y caro. Un método poderoso para introducir cambios genéticos específicos en el desarrollo de las neuronas del cerebro de mamífero es la electroporación en el útero. Esencialmente, la técnica consiste en transfectar ADN en el neuroepitelio embrionario del cerebro por medio de impulsos eléctricos, a continuación, permitiendo que el embrión para sobrevivir durante un cierto período de tiempo, recoger el cerebro y examinarlas para su posible novela, fenotipos informativos. De esta manera, el experimentador puede probar hipótesis casi de inmediato y sin los largos períodos de espera necesarios para la producción de mutantes de ratón.
La transfección de ADN en embriones en desarrollo se inició con la electroporación in ovo en embriones de pollo 1. La prueba de concepto esencial para el ratón se realizó en la cultura
El principal problema es para transfectar el cerebro en desarrollo de los embriones en el útero sin matarlos o de la madre. Aprender a realizar la cirugía necesaria (laparotomía, inyección, electroporación) requiere un largo periodo de entrenamiento. Una vez que la cirugía ha sido dominado hasta el punto en que la tasa de supervivencia embrionaria es aceptable, la pregunta clave es: ¿qué estructuras cerebrales son accesibles? No es sorprendente que los primeros trabajos publicados que muestran los resultados obtenidos con la electroporación in utero se centraron en el desarrollo cortical 5-9. Esto sigue siendo cierto para la mayoría de las publicaciones utilizando esta técnica, ya que la región del cerebro de ratón en desarrollo más accesible a los procedimientos quirúrgicos es la corteza (Figura 1). El procedimiento para la electroporación en el útero en la corteza ha sido descritaen la prensa 10 y 11 a 14 en el vídeo. Una modificación de la técnica se puede utilizar para tratar una parte ventral del telencéfalo, los ganglios basales 15.
Más allá del telencéfalo, el diencéfalo (clásicamente dividido en tálamo y el hipotálamo) es una región del cerebro anterior más difícil de alcanzar. Un pequeño número de documentos de informes dirigidos a su parte dorsal y más accesible, el tálamo 16-19.
El hipotálamo es la parte más ventral del cerebro anterior, por lo tanto, el uno localizada más profundamente a partir de la superficie dorsal (corteza) (Figura 1). Esta región sigue siendo un reto difícil para los investigadores comprometidos para manipular genéticamente el cerebro del ratón en el útero. Hasta donde sabemos, sólo muy pocos artículos informen sobre los resultados de la transfección útero en el hipotálamo de ratón 20,21. Sin embargo, la importancia funcional del hipotálamo Cañot ser exagerada, ya que regula los comportamientos como comer y beber, el apareamiento, la reproducción y crianza de los hijos 22. Por otra parte, las alteraciones en el desarrollo hipotalámico contribuyen a originar más adelante en las condiciones de vida como la obesidad, la hipertensión, la diabetes y la pubertad precoz 23. Ser capaz de alterar genéticamente el hipotálamo durante el desarrollo sería una herramienta muy poderosa para entenderlo.
El protocolo quirúrgico básico para la laparotomía de ratones embarazadas que usamos aquí es similar a la utilizada en otros protocolos 11,13,14,24. Vamos a describir aquí brevemente para completar. Clave para nuestro procedimiento, por otro lado, son del tipo de anestesia, el lugar de la inyección, el tipo de electrodos y la inserción y la posición del electrodo positivo con respecto a la cabeza del embrión. Nosotros preferimos para inducir y mantener la anestesia por inhalación de gas sobre la anestesia intraperitoneal sencilla, ya que el primero permite laperíodos algo más largos de la narcosis necesarios para una cirugía difícil. Resultados inhalación isoflurano en la recuperación más rápida de la anestesia, ya que por lo general la madre demuestra un comportamiento normal ya minutos después de la cirugía. El punto más fácil de la inyección de la solución de ADN con la micropipeta de vidrio es el ventrículo lateral, que sin embargo es completamente inadecuado para la electroporación hipotálamo. Inyección directa en el tercer ventrículo es de hecho fundamental orientar la diencephalic estructuras profundas. Es posible transfectar del hipotálamo o de E12.0 E12.5 con electrodos estándar, off-the-shelf. Hemos encontrado algunos de los electrodos fabricados por Nepa Gene (Chiba, Japón) particularmente adecuado para este propósito.
Con nuestro procedimiento se obtiene la transfección de todo el neuroepitelio hipotalámica o, transfección regional parcial dependiendo de la orientación del electrodo. Aquí se demuestra la técnica mediante la transfección del cuerpo mammillary, podría decirse quela más profunda y rebajada de todos los núcleos hipotalámicos. Además, se muestra el análisis histológico detallado de las células transfectadas hacia abajo hasta el nivel celular de la resolución.
Una comparación de la electroporación en el útero con otros enfoques para transfectar el cerebro en desarrollo en el útero del ratón se puede encontrar en la sección de Discusión.
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Protocol
1. Preparación de ADN y vidrio Micropipetas para Inyección
- Buenas micropipetas de vidrio de calidad son esenciales para reducir la velocidad inicial alta aborto debido a la pérdida de líquido amniótico. El procedimiento para sacar micropipetas de vidrio ha sido bien documentado 13,18,25. Use 1,2 mm de diámetro capilares tirado en una convencional Sutter P-97 dispositivo con los ajustes P = 500; calor = 300; Tire = 40; Velocidad = 50; Tiempo = 50. Coloque el extractor de 3 mm filamentos "valle" (Sutter Instrument FT330B). Los filamentos de tamaño de 2 mm han dado para nosotros los resultados menos satisfactorios. Por otro lado, biselado de la micropipeta consejos no parece mejorar los resultados para nosotros.
- Disolver purificada, plásmido de ADN libre de endotoxina en PBS (cultivo celular de grado) que contiene 0,1% Fast Green a una concentración final de 1 a 2 g / l. The Green Fast hará que la solución inyectada visible en el ventrículo del cerebro embrionario.
- Cargar 10 l de la solución de ADN en la micropipeta de vidrio. Conectar la micropipeta de vidrio para el sistema de inyección (Bomba Pico) o pipeta de boca.
2. Anestesia
Prepare la mesa de operaciones con una almohadilla eléctrica y los instrumentos quirúrgicos. Encienda las fuentes de luz fría para facilitar la visualización de los embriones. Desinfectar las herramientas quirúrgicas que utilizan, por ejemplo, un cordón esterilizador de vidrio.
Tres procedimientos de anestesia son posibles para este protocolo (ver Discusión). Aquí vamos a describir el que consideramos la mejor, usar la inhalación de isoflurano para la inducción de la anestesia (tasa de flujo de 0,5 L / min), así como de mantenimiento (tasa de flujo de 1 l / min).
- Introducir el ratón embarazada en un pequeño transparente (por lo que el ratón permanece visible) recipiente conectado a la Komesaroff Marcos 5 Anestésico dispositivo por un tramo corto de tubo.
- Llene el vaporizador con isoflurano, a continuación, abra la botella de oxígeno conectado al dispositivo. Sopla una o dos pulsos de isoflUrane / oxígeno (0,5 L / min) en el recipiente que contiene el ratón y el reloj de la narcosis de establecer pulg
- Tome el ratón fuera, cubrir sus ojos con un ungüento para evitar que se sequen y se ajustan a la máscara de anestesia de flujo en la cabeza de inmediato.
3. Laparotomía
- Coloque el ratón panza arriba sobre el cojín eléctrico (de lo contrario su temperatura corporal bajará muy rápido, disminuyendo las posibilidades de recuperación) y asegurar su cuerpo en su lugar, fijando sus cuatro patas a los lados con cinta adhesiva. Evaluar la profundidad de la anestesia mediante la comprobación de la pérdida de la respuesta a la estimulación refleja (por ejemplo, los pies o el pellizco de la cola con una presión firme).
- Afeitarse la superficie abdominal y desinfectar con el iodophorpovidone-yodo (Braunoderm).
- Hacer una incisión longitudinal (1 a 1,5 cm de largo) sobre la piel abdominal. Luego se corta el peritoneo. Coloque una gasa de algodón alrededor de la incisión. Hacer un cuerno uterino visible y tire de ella con cuidado con unas pinzas romas en la PBS-enjuagado gauze. Enjuague el útero con PBS muy a menudo para mantener siempre humedecido (Figuras 2A y 2B). Durante todo el procedimiento de evitar tirar la mesometrio o el útero apretado, ya que la presión dentro del útero transmitirá al embrión aumenta las posibilidades de pérdida de fluido de la inyección resulta en aborto.
4. Inyección de ADN en el ventrículo cerebral
- Mantenga el útero de tal manera que los ventrículos del cerebro pueden ser visualizados. No cambiar la posición ampliamente un embrión que se encuentra en una posición desfavorable - esto sólo aumenta las posibilidades de aborto.
- En cuanto a la cabeza del embrión a partir de la parte superior, localizar visualmente el hueco o fisura entre los hemisferios corticales izquierdo y derecho. Los hemisferios son fáciles de distinguir y los ventrículos laterales dentro de ellos (por no ser objetivo) por lo general pueden ser percibidas como formas un tanto oscuras. Si se encuentra un embrión a ser perfectamente orientada para la inyección de ADN (FigurES 2C y 2D), es posible perforar la pared uterina y entran en el tercer ventrículo a la vez. Mantenga la micropipeta de vidrio a 45 ° a la pared uterina y la punción que en el extremo rostral de la brecha entre los hemisferios corticales, penetrando por alrededor de 1 mm. De esta manera, la punta de la micropipeta de vidrio entrará en el tercer ventrículo del cerebro (no el ventrículo lateral) (Figuras 2C y 2D). En embriones de menos orientados favorablemente es útil primero perforar la pared uterina (siempre a 45 °) en la proximidad de la cabeza embrionaria, colocar la punta de la micropipeta en la posición correcta entre los hemisferios corticales y sólo entonces perforar el cerebro. Inyectar aproximadamente 1 l de solución de ADN en el tercer ventrículo (una buena inyección llena el ventrículo con el líquido verde). Repita el mismo procedimiento con todos los embriones de un cuerno uterino. Esto permite algún tiempo para que la solución de ADN para mezclar uniformemente con el fluido del ventrículo y llegar a la entirneuroepitelio correo.
5. Orientación por el hipotálamo para electroporación
- Cambie el electroporador y ajuste la configuración según la edad embrionaria (por E12.5 usamos 5 pulsos de onda cuadrada, 50 V, 50 ms ON/950 mseg OFF). Uso como polo positivo del electrodo de aguja de acero inoxidable (CUY550-10) y como polo negativo de un electrodo plano y redondo (CUY700P4L). (Es importante que los electrodos son más pequeños que el embrión, ya que de lo contrario la corriente sólo fluye alrededor del embrión, pero no a través de él.)
- Seleccionar para electroporación esos embriones cuya parte dorsal es hacia arriba (es decir, se volvió hacia el experimentador) (ya que la mayoría de ellos lo son), y descartar aquellos cuya orientación no es favorable. Ahora es seguro tocar al útero con los dedos etanol desinfectados o con guantes. Sosteniendo el útero con fórceps, sin embargo, podría interferir con el flujo de corriente durante la electroporación.
- Pierce la pared uterina por la cabeza del embrión entre el amniotic saco y la placenta empujando hacia abajo a través de él con la punta del electrodo de aguja. Utilice el dedo índice de la otra mano, como bloque de empuje. Acerca de 5 mm de la punta del electrodo deben ser ahora entre el saco amniótico y la pared uterina, a aproximadamente el nivel del mesencéfalo (Figuras 2E y 2F). Recuerde que este es el "electrodo de orientación", por lo que su posición va a determinar qué es lo más probable que se transfectaron parte del neuroepitelio hipotálamo. El embrión tiene que ser muy suavemente "exprimido" entre los electrodos.
- Con la otra mano, la posición del electrodo plano y redondo fuera de la pared del útero en el lado opuesto de la cabeza del embrión (Figuras 2E y 2G).
- Utilice el interruptor de pedal para aplicar tensión (50 V, 50 mseg ON, 950 mseg OFF, 5 pulsos de onda cuadrada).
- Tire lentamente el electrodo de aguja del útero mientras que la celebración posterior del útero con el dedo índice de la otra mano - si amniolíquido tic se pierde a través de la pared perforada, por lo general el embrión será sometido a aborto. Repita el procedimiento con todos los embriones.
- Devuelva el cuerno uterino en el abdomen y repetir la inyección y la electroporación en el cuerno remanente.
6. Para terminar la operación
- Después de la inyección y la electroporación de todos los embriones, colocar el útero en el abdomen con mucho cuidado, posicionada exactamente como eran antes y húmeda de la cavidad peritoneal con solución salina antes de cerrarlo.
- Suturar el peritoneo con catgut quirúrgico (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Para el cierre de la utilización piel "interrumpió la puntada" methodwith una sutura más resistentes (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner A 07171L).
- Desinfectar la superficie del abdomen con povidona yodada (Braunoderm) e inyectar un no-esteroides anti-inflamatorios por vía subcutánea (por ejemplo, 100 l de una solución de 1:10 de Rimadyl en NaCl al 0,9%) o, mejor aún, un opioide como buprenorphine (Temgesic, 0,05 a 0,1 mg / kg de peso corporal en 0,9% NaCl) para aliviar el dolor.
- Retire la madre de la máquina de anestesia y colocarlo en una jaula que es calentada por una resistencia de calentamiento. Supervisar el ratón continuamente hasta que esté completamente recuperado de la anestesia. Más tarde, visita a los animales diariamente para asegurar que se están recuperando de un procedimiento sin ningún signo de infección o dolor.
7. El análisis de los resultados
- Cosecha de los embriones (o postnatals) de acuerdo con el día de análisis deseado. Ratones postnatales (1 a 2 días de edad) se sacrificaron por decapitación.
- Separar cada embrión de acuerdo con la anotación electroporación anterior. Diseccionar el cerebro bajo un estereomicroscopio y comprobar bajo el microscopio para la señal fluorescente verde (GFP del reportero) en la región apropiada.
- El cerebro seleccionado puede ser analizada "fresco": fijar el tejido durante un corto período de tiempo en 4% de paraformaldehído y incrustar en agarosa al 4% o en una gelatina-lbumin, a continuación, la sección en un dispositivo de tipo vibratomo (Figura 3). Para el análisis inmunohistoquímico más detallada (Figura 4), crio-proteger el cerebro en solución de sacarosa al 30%, incrustar en medio de montaje (OCT Tissue Tek) luego se corta secciones 20 micras en un criostato.
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Representative Results
La mayoría de las neuronas del hipotálamo nacen entre E11.5 a E15.2, según el análisis de nacimiento-dating en la rata 26 traducido en el desarrollo de algo más corta ratón 27,28. El pico de la neurogénesis hipotálamo se alcanza a E12.5 29-31. En consecuencia, a la edad de transfección elegido para el presente estudio (E12.5), una gran proporción de neuronas hipotalámicas puede ser etiquetado en cualquier nivel rostro-caudal dado.
Análisis en E18.5 en secciones gruesas de tipo vibratomo (Figuras 3A y 3B) muestra que la totalidad de la extensión rostro-caudal del neuroepitelio hipotálamo es accesible a electroporación (Figura 3A). En cualquier edad, las neuronas pueden ser etiquetados en todos los niveles medio-lateral (Figura 3B), de acuerdo con estudios de linaje 32. El cuerpo mamilar (MBO) es un núcleo neuronal en desarrollo desde el neuroepitelio alineando un rebaje en el más ventral y la porción caudal del cerebro anterior. Esto hace que el MBO, en principio, muy difícil objetivo. Funcionalmente, el MBO es una estructura clave para la consolidación de la memoria y sus resultados degeneración patológica en la amnesia anterógrada 33. Hemos sido capaces de transfectar plásmidos indicadores muy específicamente en este núcleo (Figuras 3C y 3D). MBO neuronas extienden axones que forman dos muy característicos y funcionalmente extensiones importantes que también están clasificados después de la transfección (puntas de flecha en la Figura 3C). Las secciones transversales muestran que las neuronas en E12.5 nacidos (edad de la transfección) forman una "capa" curva alrededor de una masa no marcado de las neuronas generadas anteriormente (es decir, antes de que el experimento de transfección se llevó a cabo) (Figura 3D).
Más allá de los patrones de migración generales mostrados por examen en secciones gruesas con la ayuda de las proteínas fluorescentes reportero, un análisis más detallado de los resultados es Possse obtienen al utilizar anticuerpos específicos en secciones de criostato (Figura 4). Para analizar el ejemplo elegido aquí, el MBO, nos preparó secciones horizontales paralelas al plano de los procesos gliales radiales que emanan desde el rebaje mamilares (Figura 4A). A continuación, identificaron las neuronas MBO nacidos de neuroepitelio etiquetada en E12.5 por medio de anticuerpos contra la GFP (Figura 4B). Como era de esperar, el anticuerpo marcado a un grupo restringido de células MBO (punta de flecha en las Figuras 4B, 4C y 4D). Este grupo se encuentra entre dos áreas sin marcar MBO lateral y medial, respectivamente, correspondientes a las neuronas MBO nacidos antes (lateral) y después (medial) E12.5. A modo de ejemplo, aquí nos co-tiñeron con un anticuerpo contra la nestina (rojo en las Figuras 4C y 4D) con el fin de mostrar el modo de migración de neuronas marcadas de forma individual en los procesos gliales radiales del neuroepitelio.
Figura 1. Las posiciones relativas de Hipotálamo y la corteza en mitad de la gestación. Sagital (A) y transversal (B) diagramas del cerebro de un embrión de ratón mitad de la gestación que muestra la estructura del cerebro anterior más dorsal y más superficial, la corteza (CTX, azul), así como el más profundamente estructura del cerebro anterior colocado, el hipotálamo (HY, rojo).
Figura 2. Diagrama del procedimiento. (A) La presa embarazada se anestesia y el útero expuesto. (B) En cada una hinchazón uterina identificar la inserción placentaria (negro punta de flecha),placenta (PL) y el embrión. ME, mesometrio. (C) Identificar el punto en el medio de los hemisferios corticales izquierdo y derecho (X roja) de inyección. (D) Inyectar la solución de ADN en el tercer ventrículo. (E) El electrodo de aguja (positivo) perfora la pared uterina entre el embrión y la inserción placentaria. El electrodo plano (negativo) se apoya en el lado libre del útero. (F) Hipotético vista desde el lado de la placenta que muestra la posición del electrodo positivo a lo largo del hipotálamo. (G) Vista desde el lado libre del útero que muestra la posición de la electrodo negativo.
Figura 3. Transfecting todo el hipotálamo o en parte de ella. Gruesas secciones vibrante-micrótomo de cuatro diferentesE18.5 de tipo salvaje cerebros de los ratones que muestran el hipotálamo en el útero después de la transfección del plásmido de ADN que lleva los genes reportero fluorescente GFP (A, C) o PPC (B, D) en E12.5. (A) Sección sagital (rostral a la izquierda) que muestra una hipotálamo rostral a transfectadas de caudal. Barra de escala 500 (B) Sección transversal micras.. En el lado transfectadas, las células marcadas se pueden encontrar en todos los niveles medio-lateral. (C) Sección sagital que muestra un cuerpo mamilar transfectadas específicamente (línea de trazos, asterisco) y etiquetado de su árbol axonal característica (puntas de flecha). (D) Sección transversal a través del cuerpo mamilares (línea discontinua). En el lado electroporación (asterisco), una banda marcada correspondiente a las neuronas nacidos en E12.5 se puede ver. Hy, hipotálamo, Th, tálamo
La Figura 4. Analizar los pasos específicos en el desarrollo hipotalámico. (A) Diagrama de una sección horizontal a través del cerebro en desarrollo que muestra el cuerpo mamilar (rojo). La región se muestra en (B) y (C) está enmarcado. (B) Anticuerpo etiquetado de GFP en una sección horizontal a través del cuerpo mamilar E18.5 después de la transfección de GFP en E12. Las células nacidos en E12.5 forman una banda distinta en el núcleo (punta de flecha en B, C y D). Barra de escala 100 m. (C) el etiquetado de anticuerpos de neuroepitelial marcador nestin (roja) de la sección mostrada en (B). Barra de escala 100 m. (D) Las células individuales se pueden identificar en la banda específica E12.5 en el cuerpo mammillary con gran aumento. Barra de escala 20 micras.
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Discussion
Acerca de la anestesia: Desde electroporación en el útero en el hipotálamo puede ser técnicamente difícil y requerir tiempos más largos narcosis, preferimos para inducir y mantener la anestesia mediante la administración de una mezcla de oxígeno e isoflurano. En nuestra experiencia, los animales se mantienen adecuadamente anestesiado de esta manera por períodos de hasta una hora por lo menos, la recuperación de la madre es muy rápido, y la supervivencia de los embriones mejorar. Otros enfoques para la anestesia también están disponibles. El procedimiento más sencillo consiste en inducir y mantener la narcosis por inyección intraperitoneal de 2,5 ml / kg de peso corporal de una mezcla de ketamina (25 mg / ml), xilazina (1,2 mg / ml) y Acepromazin (0,35 mg / ml) en 0,9 % estéril de NaCl ("triple combo"). Con esta mezcla solos, a las dosis recomendadas aquí, la narcosis de aproximadamente 30 min (hasta 45 min en algunos casos) se induce. Esto suele ser suficiente para la electroporación in utero en la corteza en E12.5 (a través injexión en el ventrículo lateral). La ventaja de este método es que evita completamente la necesidad de un dispositivo de narcosis y otros equipos. Sin embargo, este tipo de anestesia intraperitoneal no es recomendable si los tiempos más largos de la cirugía es necesaria, ya que más inyecciones en el animal anestesiado con el fin de prolongar el período de anestesia suelen ir seguidas de muerte. También es posible combinar intraperitoneal y la anestesia por inhalación usando primero una inyección de la "triple combinado" (como anteriormente) con el fin de inducir la narcosis, a continuación, mantener por inhalación de isoflurano / oxígeno. Aunque con este método en particular la narcosis se puede mantener durante tanto tiempo como sea necesario, la recuperación de la embarazada ratón después de la operación no es tan bueno como con la inhalación solo. Además, cuando se utiliza el "triple combo" inyección intraperitoneal, la supervivencia embrionaria disminuye.
El posicionamiento de los electrodos en la cabeza del embrión como se muestra en La laparotomía es bastante sencillo. Sin embargo, el experimentador alcanza el nivel de habilidad que permite la alta relación de supervivencia de los embriones (después de la inyección intraventricular seguido por la administración de pulsos eléctricos) después de una curva de aprendizaje plana. Habilidad individual es un factor importante para que electroporación en el útero, en general, y su aplicación al hipotálamo, en particular, puede no resultar totalmente práctico para algunos estudiantes . Para acortar el período de aprendizaje, así como para aumentar la reproducibilidad y el análisis estadístico hemos considerado útil para llenar un protocolo detallado que incluye información sobre el número y posición de los embriones, y el aspecto, la calidad de la inyección y la posición aproximada de los electrodos de los embriones individuales. La comparación de estos datos sobre el experimento con los resultados finales, sobre una base embrión-por-embrión ha demostrado ser útil para entender y mejorar el procedimiento. Otros informes 20,21 han dirigido el hipotálamo con Nepagene electrodos tipo pinza. Se obtiene consistentemente mejores resultados con la aplicación de un electrodo de aguja y una cubierta-electrodo plano del mismo fabricante. En nuestra experiencia, el uso de este método hace rostro-caudal objetivo más fácil. Electrodos de pinzas parecen requerir ya sea más experiencia / habilidad o un mucho mayor número de experimentos con el fin de obtener resultados útiles.
El otro grupo de enfoques evita la cirugía por completo, ya que se basa en la inyección de las construcciones para transfectar en el torrente sanguíneo del ratón embarazada. Vena de inyección de cola (vena caudal) de shRNA 34,35 o plásmidos 36 tiene el potencial para manipular genéticamente embriones muy tempranos, aunque focalización específica de la región no es posible con este método. Este enfoque prometedor no parece todavía listos para su aplicación general. Las partículas virales (virus adeno-asociado) inyectados en la vena facial de ratones recién nacidos (pero no ratones de más edad) es capaz de transfectar neuronas del cerebro 37. Finalmente, las nanopartículas, lo que eventualmente podrían ser utilizados como portadores de ADN, pueden alcanzar el cerebro después de la cola vein inyección en ratones adultos 38. Estos dos métodos, que se abren la posibilidad de transfección de embriones muy tempranos, tienen a nuestro conocimiento aún no ha sido utilizado en ratones preñados.
Edad de la transfección y recogida: Para aprender el procedimiento, es probablemente el mejor para tratar de transfectar E14.5 embriones y, a continuación, pasar a edades embrionarias tempranas y más difíciles. En nuestra experiencia, la expresión de GFP es visible bajo luz UV ya las 24 horas después de la transfección. Después de la transfección E12.5, la expresión de GFP en E18.5 es muy fuerte. Hemos electroporación en E12.5, E13.5, E14.5, E15.5 y E17.5 y analizado en, E18.5, P0 y P1 ser capaz de encontrar una fuerte expresión reportero en todos los casos. Cuando los embriones cuyos cerebros han sido transfectadas en el útero se les permite llegar a término (para la recolección de datos posnatal), a veces se comen selectivamente por la madre. Esto sugiere que los cambios sutiles en la apariencia de las crías o el comportamiento inducido por la manipulación del cerebro (su temperaturatura podría ser menor, o tal vez que no emiten las señales de sonido adecuados). En los animales postnatales que sobreviven sacrificio materna, hemos observado la expresión del indicador hasta P1 al menos. Informes en la literatura muestran la expresión de las construcciones transfectadas hasta cuatro meses después del nacimiento 10.
Los vectores para la electroporación: se utilizan plásmidos informadores bicistrónicos dirigido por el promotor CAG 39, seguido por el cDNA del gen de interés, separados por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) 40, a partir del ADNc de un indicador fluorescente, por ejemplo la mayor proteína fluorescente verde 41. El promotor de CAG es tan fuerte en las neuronas que puede producir niveles de ADN demasiado alto para las células transfectadas, matarlos. Aunque nunca hemos observado apoptosis masiva después de la transfección, una solución posible, debe aparecer el problema, sería el uso de un promotor menos eficiente, como el EF1 alfa 42.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Fundación Alemana de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
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