Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino

Published: May 23, 2013 doi: 10.3791/50415
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1DFG-Center for Regenerative Therapies Dresden, Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden

Summary

في هذه المقالة، ونحن يبرهن على وجود طريقة للتلاعب في التعبير الجيني في الخلايا البطين من الدماغ الانتهائي الزرد الكبار باستخدام العقاقير أليغنوكليوتيد] morpholino. نقدم هذه الطريقة كبروتوكول فعالة وسريعة والتي يمكن استخدامها للدراسات وظيفية في الفقاريات الدماغ الكبار.

Abstract

مطلوب التلاعب في التعبير الجيني في الأنسجة لإجراء دراسات وظيفية. في هذه الورقة، ونحن لشرح حقن مكروي cerebroventricular (CVMI) تقنية كوسيلة لتعديل التعبير الجيني في الزرد الدماغ الكبار. باستخدام CVMI، يمكن أن تدار المواد في السائل cerebroventricular ويتم توزيعها بدقة على طول محور rostrocaudal من الدماغ. ونحن نركز بشكل خاص على استخدام العقاقير morpholino أليغنوكليوتيد]، التي هي أدوات قوية لاسقاط التعبير الجيني في الجسم الحي. في أسلوبنا، عند تطبيقها، وتتخذ الجزيئات morpholino من قبل الخلايا المبطنة للسطح البطين. وتشمل هذه الخلايا الخلايا الدبقية شعاعي، التي تعمل بمثابة الأسلاف العصبية. ولذلك، هدمت التعبير الجيني في الخلايا الدبقية شعاعي أمر في غاية الأهمية لتحليل استجابة الخلايا العصبية على نطاق واسع في الزرد، وأيضا من شأنه أن يوفر نظرة ثاقبة كيف يمكن الحفاظ على الفقاريات نوروجين الكباراستجابة ESIS. ان مثل هذا الفهم يساعد أيضا الجهود المبذولة من أجل التطبيقات السريرية في اضطرابات الاعصاب الإنسان ووسط تجديد الجهاز العصبي. وبالتالي، فإننا نقدم طريقة حقن مكروي cerebroventricular كوسيلة سريعة وفعالة لتغيير التعبير الجيني واستجابة الخلايا العصبية في الدماغ المقدم الزرد الكبار. كما نقدم نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها وغيرها من المعلومات المفيدة حول كيفية تنفيذ الإجراء CVMI.

Introduction

تكوين الخلايا العصبية الكبار هو سمة مشتركة بين الفقاريات، لكن درجته من انتشار وكفاءة يختلف مع نسالة 1،2،3،4،5،6. على سبيل المثال، أدمغة الثدييات الكبار تحتوي على مناطق الخلايا الجذعية محدود إلى حد كبير إلى الدماغ الأمامي 7،8، في حين أن الزرد مكتملة العظام يحتوي على ستة عشر مختلف المجالات الخلايا الجذعية العصبية المرتبطة بها ومناطق في الدماغ بكامله 4،5،9،10. هذا الاختلاف بين الثدييات والزرد قد تعكس وجود تفاوت في آليات صيانة الخلايا الجذعية والقدرة العصبية من الخلايا الاصلية. يمكن أن اختصاص مدى الحياة من الزرد لإنتاج الخلايا العصبية في الدماغ تشكل أيضا تشعبات السريرية والآليات الجزيئية التي تستخدمها الزرد الدماغ يمكن تسخيرها للتطبيقات العلاجية لمعالجة الاضطرابات العصبية لدى البشر.

وقد تم تحليل العديد من الخلايا الجذعية مناطق من الدماغ الزرد الكبار، ولقد ثبت أنالخلايا المبطنة للسطح البطين من تلك المناطق بمثابة الخلايا الاصلية 9،11-20. تحليلات مفصلة في الدماغ الانتهائي الزرد، على سبيل المثال، حدد الخلايا الدبقية شعاعي، التي تحدد السطح البطيني من هذه المنطقة في الدماغ لتكون الأسلاف العصبية 19 و 20. هذا ينطبق على المناطق الأخرى مثل المخيخ والسقف البصري، حيث ventricularly، وتقع خلايا عصبية ظهارية توفير المدخلات العصبية 16،21. وتحقيقا لهذه الغاية، فهم الآليات الجزيئية التي تنظم الكفاءة العصبية انتشارا في البالغين الزرد الدماغ يتطلب التلاعب في التعبير الجيني في الخلايا الاصلية.

وقد وصفت وسائل مختلفة من قبل لتحوير وظيفة الجين في الزرد. وتشمل هذه الجيل من خطوط المعدلة وراثيا المشروطة التعبير عن المتغيرات المطلوبة من البروتين الحقن تنسيق وحيد، القائم على البلازميد بالإضافة إلى electroporation أو الكيميائية العلاجات. نحن سابقا بتصميمطريقة لإدارة المواد المختلفة بما في ذلك [أليغنوكليوتيد أو morpholino البروتينات في الدماغ الزرد الكبار باستخدام حقن مكروي cerebroventricular كوسيلة سريعة وفعالة من تحوير وظيفة الجين في خلايا البطين من الدماغ المقدم الزرد الكبار 22. في دراساتنا، واستخدمت morpholinos الجسم الحي بسبب الكيمياء التي تنطوي على جزيء morpholino مرتبطة تساهميا إلى أرجينين الببتيدات تسليم الغنية، والتي تتيح تسليم كفاءة لخلايا الفائدة دون الحاجة إلى permeabilization إضافية مثل electroporation 23. وهذا من شأنه السماح لاستهداف شامل للنسيج المطلوب بعد الحقن، تماما مثل ما لاحظنا في الزرد الكبار الدماغ الانتهائي 22. استخدام morpholinos فيفو بالتالي فهي متفوقة على الأساليب القائمة بالفعل من الأنسجة استهداف مثل electroporation أو حقن التنسيق من جزيئات الحمض النووي.

هنا، علينا أن نظهر بصريا كيف يمكننا تنفيذ هذه العملية وتوفيربروتوكول خطوة بخطوة. نبدأ مع شرح إعداد خليط حقن والأسماك ليتم حقنه، والمضي قدما من خلال إظهار كيف يتم تعيين جهاز حقن ما يصل. ونحن نقدم وصفا للطريقة حقن cerebroventricular، الذي ينطوي على توليد شق في الجمجمة وحقن morpholinos باستخدام microinjector. نحن أيضا تفاصيل عن النقاط الحرجة يحتاج المرء أن يكون حذرا في أثناء إجراء كله بالقول بأنها الأمثل أو أدلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Protocol

1. إعداد خليط حقن

  1. استخدام morpholinos الجسم الحي كما الخلايا استيعاب يجعلها أكثر كفاءة من جزيئات morpholino العادي. انظر المعلومات الخاص بالشركة المصنعة للحصول على التفاصيل (الجدول 1: الكواشف والمواد).
  2. استخدام صبغة الفلورسنت تتبع (مثل CellTracker الأحمر CMTPX، إينفيتروجن) لتصور دقة الحقن. يتم استقلاب هذه الصبغة في الخلايا ويصبح الفلورسنت فقط في الخلية بعد امتصاص. لذلك، هذه الخطوة حاسمة لتحديد الخلايا التي تستهدف بكفاءة من قبل حقن مكروي cerebroventricular.
  3. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 10MM نا 2 هبو 4، 2 مم KH 2 PO 4، ودرجة الحموضة: 7.4) لتمييع الحل morpholino. إذا كنت بحاجة لتخفيف من الحل morpholino، دائما استخدام برنامج تلفزيوني.
  4. إعداد 10 ميكرولتر من مزيج الحقن وذلك بإضافة 9 ميكرولتر من الحل morpholino و 1 ميكرولتر من اله خلية تعقب صبغ (مخفف أو غير مخفف تركيز الأسهم من الحل morpholino هو 500 ميكرومتر نتائجنا السابقة تشير إلى أن 22 عدة جرعات مختلفة من morpholino - تتراوح من 50 ميكرون إلى 500 ميكرون - نتيجة في مستويات مختلفة من ضربة قاضية من كفاءة ضربة قاضية إلى الظواهر hypomorphic). 1 ميكرولتر من الحل هو بما فيه الكفاية للحقن في واحدة الزرد الدماغ.
  5. تخلط جيدا وتخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى الحقن.

2. إعداد جهاز حقن

  1. إعداد حقن الشعيرات الدموية الزجاج باستخدام مجتذب إبرة. استخدام المعلمات التالية: قيمة دورة التدفئة: 463، وسحب قيمة دورة: 230، السرعة: 1.5 ثانية، والوقت: 75 ميللي ثانية.
  2. بدوره على مصدر الضغط وضبط إعدادات الضغط إلى 50 رطل أو 3.5 بار.
  3. ضبط إعدادات microinjector على النحو التالي: عقد الضغط 20 رطل، إخراج الضغط 10 رطل، قيمة الفترة من 2.5 و 100 ميللي ثانية مجموعة من النابضة.
  4. تحولعلى إضاءة الحلبة وحدد موقع خاتم على المسرح المجهر.
  5. ضع حامل الشعرية إلى الموقف المناسب بجانب المجهر.
  6. إدراج الزجاج الشعرية في حامل. ضبط زاوية الحقن الى 45 درجة.
  7. المفاجئة قبالة غيض من الزجاج الشعرية باستخدام غرامة نهاية ملقط ومعايرة الضغط الناتج من الفوهة. يجب أن يتم اختبار هذا بغمر رأس الإبرة في الماء الأسماك وإعطاء نبض الضغط المستمر. ينبغي أن تكون فقاعات الهواء الناشئة صف واحد فقط، وهو دلالة من الضغط الأمثل / حجم الفوهة. يرجى الاطلاع على الفيديو لمظاهرة من هذا المعايرة.
  8. تحميل الزجاج الشعرية مع الحل حقن بدون محاصرة فقاعات الهواء.
  9. تطبيق ضغط لإزالة الهواء بين غيض من الزجاج الشعرية والحل حقن المحملة.

3. خدر

  1. إعداد محلول المخزون من التخدير (0.1٪ MESAB - إيثيلM-أمينوبنزوات methanesulphonate).
  2. إزالة العدد المطلوب من الأسماك من دباباتهم في أقفاص الماوس البلاستيك أو حاوية النقل الأخرى مع كمية كافية من الماء.
  3. إعداد الحل تخدير في مربع صغير من البلاستيك عن طريق خلط 200 مل من الماء الأسماك مع 5 مل من التخدير الأسهم الحل. تركيز النهائي من التخدير: 0.0025٪ (V / V).
  4. نصف ملء طبق بتري البلاستيكية التي تحتوي على مواد التخدير. استخدام هذا الطبق لحقن.
  5. احتضان الأسماك في التخدير حتى يهزم الأسماك.

4. شق وحقن مكروي Cerebroventricular

  1. إزالة الأسماك من مربع باستخدام صافي الأسماك ووضعه في طبق بتري.
  2. عقد بلطف السمك مع ملقط وتوجيه الرأس في هذه الطريقة أنه يميل إلى الأسفل قليلا. وسوف يسهل هذا الشق.
  3. إنشاء فتحة صغيرة في الجمجمة باستخدام إبرة قياس 30 الشائكة نهاية. استخدام سوى غيض من الإبرة لا تخترق وأكثر منبما فيه الكفاية في الدماغ وهذا سوف يسبب الضرر لأنسجة المخ وسوف تظهر كما النزيف.
  4. الحفاظ على عقد الأسماك وإدراج غيض من الزجاج الشعرية من خلال موقع شق.
  5. توجيه غيض من الزجاج الشعرية نحو الدماغ الانتهائي. تجنب لمس أنسجة المخ وهذا يخلق تلف الأنسجة ويمنع أيضا تشتت من الحل حقن.
  6. حقن الحل. السائل يشتت فورا بعد الحقن.

5. استرداد وتحليل حقن دقة

  1. إزالة الأسماك من الإعداد حقن ومكان في علبة بلاستيكية مع أسماك المياه العذبة.
  2. السماح باستعادة.
  3. إعادة تخدير السمك مع 0.0025٪ MESAB لفترة وجيزة والتحقق من الأسماك تحت المجهر مضان. A تشتت شامل من مضان أحمر وهذا مؤشر على توزيع واسع النطاق من السائل المحقون.
  4. وضع الأسماك مرة أخرى إلى مربع من البلاستيك.
  5. ربط مربع من البلاستيك إلى Tانه نظام التداول إلى الأوكسجين في الأسماك والمحافظة لفترات أطول من الوقت.
  6. استخدام الأسماك للأغراض المرجوة مثل التحليلات السلوكية أو تضحية الحيوانات في نقطة الوقت المطلوب بعد الحقن لإعداد عينات الأنسجة لإجراء المزيد من التحليلات (stainings النسيجي، المناعية، الخ). المراجع التالية إعطاء أمثلة عن كيفية تحليل الدماغ الزرد الكبار: 9،11،17-20،24-27. وكان أسرع الوقت للاطلاع على ضربة قاضية كفاءة (أكثر من 50٪ ضربة قاضية) 12 ساعة في دراساتنا 22.

6. الضوابط العلمية واقترح

  1. استخدام عدم تطابق morpholino الجزيء الذي لا يفترض أن يسبب أي النمط الظاهري كعنصر تحكم سلبية. استخدام إما جزيء morpholino القياسية أو على وجه التحديد تصميم الضوابط morpholino عن كل الجينات في المصالح. بالإضافة إلى ذلك، استخدام المذيبات (في هذه الحالة PBS) كعنصر تحكم سلبي آخر لتقييم آثار غير محددة أو سمية mismATCH / السيطرة على حقن morpholino.
  2. استخدام وصف PCNA morpholinos سابقا 22 والضوابط الإيجابية. هذا يسبب ضربة قاضية morpholino فعالة في الدماغ الزرد الكبار (75-95٪ كفاءة ضربة قاضية في حدود 1 يوم من الحقن) 22.

Representative Results

حقن مكروي Cerebroventricular يؤدي إلى توزيع على نطاق واسع من الحل حقن

باستخدام نظام سير العمل والتقنية للحقن مكروي cerebroventricular مبين في الشكل 1، ونحن تدار أليغنوكليوتيد] morpholino في الزرد الدماغ الكبار. بروتوكول حقن دقيقة يؤدي إلى تشتت السائل تحقن في جميع أنحاء الدماغ وكفاءة استهداف الخلايا القريبة من السطح البطيني (الشكل 2A). سوف الحقن حيث الزجاج الشعرية يخوزق أنسجة المخ لديهم إشارة الفلورسنت كثيفة عند نقطة الحقن (الشكل 2B). إذا كان المبلغ حقن ليست كافية، وسيراعى في إشارة الفلورسنت ضعيفة (الشكل 2C).

حقن مكروي Cerebroventricular يمكن استخدامها لاسقاط التعبير الجيني في منطقة البطين من الدماغ الزرد الكبار

لقد أظهرنا الفي morpholinos الجسم الحي يمكن ان تخترق بعض أقطار الخلية داخل السطح البطيني، وبالتالي يمكن أن تستهدف بكفاءة الخلايا البطين (أرقام 3A، 3B). Morpholino حقن ضربة قاضية يمكن التعبير الجيني لأنها سوف تخفف من إنتاج البروتين المقابلة (على سبيل المثال هو PCNA كما هو موضح في الشكلين 3C، 3D). لقد أثبتنا سابقا أن هدمت الجينات باستخدام هذه التقنية يؤدي إلى عواقب وظيفية خلال تكوين الخلايا العصبية الكبار (أرقام 3E، 3F) أو استجابة التجدد (أرقام الجيل الثالث 3G، 3H). أثبتنا أن مجموعة ضربة قاضية كفاءة (أكثر من 50٪ ضربة قاضية) ويتحقق ما يقرب من 12 ساعة بعد الحقن من morpholinos 22. لاحظنا أيضا أن الفترة ضربة قاضية كفاءة هو حتى بعد ما يقرب من 5 أيام لحقن البروتين PCNA 22. واعتبر أكثر من 70٪ ضربة قاضية حتى 3 أيام بعد الحقن 22. منحنيات ضربة قاضية هي O تعتمدن مستوى التعبير عن البروتينات الذاتية وكفاءة جزيئات morpholino، ويجب أن تحدد لكل جينة من قبل المجرب. في دراستنا، لم نكن نرى أن الإجراء CVMI يهدد بقاء الحيوان، ربما لأن الإدارة من الجزيئات morpholino هو محلي ولا يسبب سمية جهازية.

الشكل 1
الشكل 1. التمثيل التخطيطي للتقنية الحقن cerebroventricular. (A) يتم تنفيذ الحقن من الظهري من الزرد الكبار (1) على مستوى السقف البصري (OT، 2). يتم إجراء شق خلال البصرية لوحة الجمجمة سقفي مع إبرة عيار 30 (3). استخدام الزجاج الشعيرات الدموية، ويتم حقن جزيئات morpholino في السائل البطين (4). A تشتت شامل هوchieved على الفور (5). (B) ويرد قنية ولها نهاية الشائكة في تضخم عالية. (C) التوجه من الإبرة قبل شق. (D) وحلقت شق والتي حددها الخطوط المتقطعة. (E) يقع حقن الشعرية كما هو مبين ويتم تنفيذ الحقن. تم تكييف جميع لوحات من المرجع 22. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. مقارنة بين كفاءة الحقن ودقة. (A) يؤدي A حقن جيدة لاستهداف الخلايا القريبة من السطح البطيني. (ب) إذا تم إدراج الزجاج الشعرية إلى أنسجة المخ، وهذا سوف تولد إشارة مضان في موقع مركزي. (C

الشكل (3)
الشكل (3). . Morpholino الاختراق، وكفاءة knockdowns الجينات والعواقب الوظيفية (A) GFP المناعية على المقاطع العرضية الدماغ الانتهائي من السيطرة morpholino حقن تيراغرام (H2A: GFP) خط المعدلة وراثيا تبين نوى GFP إيجابية. (B) GFP المناعية على المقاطع العرضية الدماغ الانتهائي من GFP العقاقير morpholino حقن تيراغرام (H2A: GFP) خط المعدلة وراثيا تبين نوى GFP إيجابية. لاحظ الفرق في إشارة GFP في منطقة البطين. الخامس: البطين. (C) PCNA المناعية على السيطرة morpholino حقن العقول تبين التوزيع الواسع النطاق للخلايا إيجابية PCNA. ( بكنا العقاقير العقول morpholino حقن تبين انخفاض كبير كميات من إيجابية الخلايا PCNA، وتبين أن CVMI يمكن ضربة قاضية الجينات الذاتية. (E) BrdU وHUC / D المناعية على السيطرة morpholino حقن العقول لتحديد الخلايا العصبية الوليد بعد BrdU نبض مطاردة تجربة وصفها قبل 22. (F) BrdU وHUC / D المناعية على بكنا العقاقير العقول morpholino حقن لتحديد الخلايا العصبية الوليد بعد BrdU نبض مطاردة تجربة وصفها قبل 22. (G) يطرق إلى أسفل PCNA يؤدي إلى انخفاض كبير في جيل من الخلايا العصبية حديثي الولادة، مشيرا إلى أن CVMI يمكن استخدامها لضربة قاضية الجينات الذاتية، التي تؤدي إلى عواقب وظيفية. تم تكييف جميع لوحات من المرجع 22 انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Discussion

الأسلوب وصفنا هنا يسمح إدارة سهلة وسريعة من morpholinos في الزرد الدماغ الكبار. لقد أثبتنا أن طريقة الحقن لدينا يمنع التعبير الجيني بكفاءة في الخلايا البطين والنتائج في عواقب وظيفية في الخلايا العصبية استجابة.

هناك نقطة هامة أن يكون حذرا حول أثناء تنفيذ حقن مكروي cerebroventricular. على سبيل المثال، تأثير الجزيئات morpholino يعتمد على التركيز المستخدم. هذا التركيز يجب أن يحدده المستخدم النهائي. نوصي بدءا من محلول المخزون (500 ميكرون) وإجراء التخفيفات المتسلسلة، ومثالي لمرحلة ما قبل الاختبار عن طريق الحقن في الأجنة باستخدام معيار حقن الجنين بروتوكولات 28-30. سابقا، حصلنا على مستويات مختلفة من الكفاءة ضربة قاضية مع تركيزات morpholinos تتراوح من 50 ميكرون إلى 500 ميكرون 22. الثانية، وفتحة من الزجاج الشعرية لا ينبغي أن تأوسوف البريد لأن هذا يؤدي إلى تدفق السائل واسعة في الدماغ بعد الحقن. وبالمثل، يجب فتح لا تكون ضيقة جدا حيث سيؤدي ذلك إلى منع حقن كافية. يمكن للمرء تحديد الأمثل مزيج فوهة الضغط عن طريق ضخ الهواء في طبق بيتري مع الماء. ينبغي أن تكون الفقاعات الناشئة في صف واحد ولكن ليس في صفوف متعددة. علينا أن نظهر هذا في شريط الفيديو. ثالثا، يحتضنها الأسماك في التخدير أمر بالغ الأهمية. لا ينبغي أن تبقى السمكة أطول من 2 دقيقة في التخدير. وهذا يعيق معدل الاسترداد بعد الحقن. الرابعة، وموقع من شق هو أمر حاسم لتفريق بدقة السائل المحقون. منطقة البطين خلال السقف البصري أكبر فوق خط الوسط ويحصل أضيق أفقيا. ولذلك، ينبغي أن المجرب توليد فتحة في الجمجمة لإغلاق خط الوسط والذيلية لمجرد لوحة جمجمة تغطي منطقة الدماغ الانتهائي.

واحدة من المزايا التي تتمتع بها مباشرة صب cerebroventricularن طريقة (CVMI) هو rapidness لها. CVMI هو وسيلة سريعة لمعايرة وظيفة الجين. هذه الميزة مهمة ومفيدة بالمقارنة مع جيل من خطوط المعدلة وراثيا للدراسات الفنية، والتي تأخذ عادة عدة أشهر. بالإضافة إلى ذلك، CVMI يؤدي إلى توزيع موحد للسائل المحقون وبالتالي يوفر التلاعب شامل نسبيا من النشاط الجيني، بالمقارنة مع الحقن تنسيق أو electroporation. مع CVMI، يمكن طرقت جينات متعددة في وقت واحد أسفل من خلال إعداد الحقن التي تحتوي على خليط morpholinos متعددة قليل النوكليوتيد. CVMI يمكن استخدامها لحقن تركيزات مختلفة من إعطاء أليغنوكليوتيد] morpholino، وبالتالي يمكن استخدامها لتحليل الظواهر hypomorphic. وأخيرا، هذا النموذج الحقن لا يسبب سمية أو تعرض للخطر بقاء هذه الحيوانات.

يمكن توسيع نطاق هذه التقنية CVMI لنوع آخر من الدراسات مثل حقن من الببتيدات تغييري، والمخدرات، DNA البلازميد أو تغييري RNA موlecules أو غيرها من المواد التي قد تؤثر على علم وظائف الأعضاء من الخلايا. يعاير مزيج من جزيئات وإجراء تحليلات الاستجابة للجرعة ممكنة باستخدام طريقة لدينا، مما يسمح بدراسة الظواهر hypomorphic. مع هذه الخصائص، CVMI يبرهن على أن تكون مقايسة سريعة وسهلة للدراسات التعبير في الزرد الدماغ الكبار، ويفتح الفحص السريع والتحليلات الفنية.

الزرد الدماغ الكبار يمكن ان تنتج خلايا عصبية جديدة جوهري على طول محور rostrocaudal كله، وأنه يمكن أيضا تجديد بعد الإصابات. هذا هو في تناقض صارخ مع أدمغة الثدييات مع تكوين الخلايا العصبية محدودة وعلى كل حال، بدلا من الفقراء قدرة التجدد. هذا على نطاق واسع نشاط الخلايا الجذعية وقدرتها الاستجمام يجعل الزرد كائن نموذج مفيد لفهم البرامج الجزيئية اللازمة لتجديد الجهاز العصبي المركزي، والتي هي غير معروفة إلى حد كبير حاليا. ولذلك، والتحقيق في الأساس الجزيئي للالموهبه التجدد زيbrafish الدماغ هو عالم مثير للاهتمام من البحوث التي قد تفسر الفرق الأساسي كيفية رد فعل الأسماك والثدييات العقول بعد الإصابة، وأيضا منح سبل العلاجات الطبية التجدد في البشر. من أجل فهم البنية التحتية الجزيئية من الفقاريات اللدونة الدماغ وتجديد، والخلايا الدبقية بمثابة منطقة بحثية هامة لأنها هي الأسلاف العصبية 3،8،20. وهكذا، وذلك باستخدام تقنية CVMI لتغيير وظيفة الجين في الخلايا الدبقية شعاعي من الدماغ الزرد هو دور فعال في توضيح كيف يمكن لنشاط السلف الزوجين لكفاءة الخلايا العصبية الكبار واستجابة التجدد الدماغ الأسماك. لقد أظهرنا مؤخرا تورط وشرط من عدة عوامل ومسارات الإشارات في استجابة الخلايا العصبية على التجدد من الدماغ الزرد الكبار 24،26،27، وقدمت هذه الدراسات ممكن عن طريق استخدام أسلوب CVMI. وعموما، فإن المعرفة التي نكتسبها من الزرد الدماغ يمكن تسخيرها لفرض regeneالقدرة rative إلى الخلايا الدبقية الثدييات التي تتفاعل إلى وقوع إصابات وبالتالي سوف تساعد على تصميم علاجات سريرية لعلاج الاضطرابات العصبية البشرية والإصابات الحادة.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (SFB 655) والاتحاد الأوروبي (ZF-الصحية).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
CellTracker Red CMTPX Life Technologies, Invitrogen C34552 Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing the fish
Petri dishes Sarstedt 821,472 For handling the fish during injection and imaging
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056 As sterile dilution medium
Vivo morpholinos Gene Tools Inc. Customized More info on vivo morpholinos: www.gene-tools.com
Equipment
Barbed-end needle Becton-Dickinson 305178 To generate the incision in the skull
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer Part of the whole injection setup
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985 To snap off the tip of the glass capillary
Fluorescence camera Zeiss, Nikon, Leica Varies with the manufacturer To visualize the fluorescence after injection
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265 To hold the fish in position
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10 For microinjection
PicoNozzle kit (microinjector holder) World Precision Instruments 5430-12 For microinjection
Pneumatic PicoPump (microinjector) World Precision Instruments SYS-PV820 For microinjection
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG For illuminating the specimen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stocum, D. Regenerative Biology and Medicine. , Academic Press. London. (2006).
  2. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  3. Doetsch, F., Scharff, C. Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals. Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).
  4. Kaslin, J., et al. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  5. Kizil, C., et al. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  6. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev. Genes Evol. , In Press (2013).
  7. Kempermann, G. Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , 2nd Edition, Oxford University Press. Oxford. (2010).
  8. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).
  9. Grandel, H., et al. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell. 295 (1), 263-277 (2006).
  10. Chapouton, P., et al. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  11. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  12. Byrd, C. A., Brunjes, P. C. Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish. Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).
  13. Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
  14. Lam, C. S., et al. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish. 238 (2), 475-486 (2009).
  15. Wang, X., et al. Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus. Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).
  16. Kaslin, J., et al. Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche. J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).
  17. Ganz, J., et al. Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon. Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).
  18. März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
  19. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  20. Kroehne, V., et al. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  21. Ito, Y., et al. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).
  22. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
  23. Morcos, P. A., et al. Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues. Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).
  24. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
  25. Chapouton, P., et al. her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain. Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).
  26. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  27. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  28. Rosen, J. N., et al. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  29. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  30. Rikin, A., et al. A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis. J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).

Tags

علم الأعصاب، العدد 75، علم الأعصاب، علم الوراثة، علم الأحياء الجزيئي، علم الأحياء الخلوي وعلم الأحياء التطوري، الكيمياء الحيوية، والدماغ، الزرد، Morpholinos، تقنيات ضربة قاضية الجينات، أليغنوكليوتيد] morpholino، حقن مكروي cerebroventricular، العلوم العصبية، والخلايا الدبقية شعاعي، حقن مكروي، التعبير الجيني،
المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., … More

Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (75), e50415, doi:10.3791/50415 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter