Summary
이 문서에서는, 우리는 안티센스 모르의 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 성인 제브라 피쉬 telencephalon의 심실 세포에서 유전자 발현을 조작하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성인 척추 뇌 기능 연구에 사용할 수있는 효율적이고 빠른 프로토콜로이 방법을 제시한다.
Abstract
조직에서 유전자 발현의 조작은 기능 연구를 수행하기 위해 필요합니다. 본 논문에서, 우리는 성인 zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현을 조절하는 수단으로 cerebroventricular 미세 주입 (CVMI) 기술을 보여줍니다. CVMI를 사용하여 물질 cerebroventricular 유체로 관리 할 수 있으며, 철저하게 뇌의 rostrocaudal 축을 따라 배포 될 수. 우리는 특히 생체 내에서 유전자 발현을 쓰러 뜨린위한 강력한 도구입니다 안티센스 모르의 올리고 뉴클레오티드의 사용에 초점을 맞 춥니 다. 우리의 방법에 적용될 때, 모르 분자는 심실 표면을 일렬로 세우는 세포에 의해 수행된다. 이러한 세포는 신경 인성 조상의 역할 레이디 얼 glial 세포를 포함합니다. 그러므로, 레이디 얼 glial 세포에서 유전자 발현을 노크하는 제브라 피쉬의 광범위한 신경 반응을 분석하는 가장 중요하고, 또한 척추 성인 neurogen을 유지할 수있는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다ESIS 응답. 이러한 이해는 인간의 신경 퇴행성 질환 및 중추 신경계 재생의 임상 응용을위한 노력을 도울 것입니다. 따라서, 우리는 유전자 발현 및 성인 제브라 피쉬 전뇌의 신경 반응을 변경하는 신속하고 효율적인 방법으로 cerebroventricular 미세 주입 방법을 제시한다. 우리는 또한 CVMI 절차를 수행하는 방법에 대한 문제 해결 팁 및 기타 유용한 정보를 제공합니다.
Introduction
성인 신경은 척추 동물에 공통적 인 특성이다, 그러나 유행과 효율성의 정도는 계통 1,2,3,4,5,6에 따라 달라집니다. 경골의 제브라 피쉬는 뇌 전체 4,5,9,10에있는 16 개의 다른 줄기 세포 도메인과 관련된 신경성 영역을 포함하는 동안 예를 들어, 성인 포유류의 뇌는 크게 전뇌 7,8로 제한 줄기 세포 영역을 포함합니다. 포유 동물과 제브라 피쉬 간의 변화는 줄기 세포의 유지 보수 및 전구 세포의 신경 인성 용량 메커니즘의 차이를 반영 할 수 있습니다. 제브라 피쉬의 뇌에 의해 고용 분자 메커니즘이 인간의 신경 퇴행성 질환을 해결하기 위해 치료 응용 프로그램에 무력화 될 수 있기 때문에 뇌의 뉴런을 생산하는 제브라 피쉬의 평생 능력은 임상 적 파급 효과를 일으킬 수 있습니다.
성인 zebrafish의 뇌의 여러 줄기 세포 영역을 분석 한 그리고 그것은 보여왔다 그그 지역의 심실 표면을 일렬로 세우는 세포 전구 세포 9,11-20 역할을합니다. 제브라 피쉬 telencephalon의 상세한 분석은, 예를 들어, 신경성 선조 19, 20 수 있도록이 뇌 영역의 심실 표면을 윤곽을 그리다 레이디 얼 glial 세포를 확인 하였다. 여기에는 소뇌와 neuroepithelial 세포가 신경 인성 입력 16,21를 제공 ventricularly - 위치 광학 tectum, 다른 지역에 대한 진정한 보유하고 있습니다. 이를 위해, 성인 zebrafish의 뇌에서 광범위한 신경 인성 역량을 지배하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 전구 세포에서 유전자 발현의 조작이 필요합니다.
다양한 방법 이전에 제브라 피쉬의 조절 유전자 기능에 대해 설명 하였다. 이들은 일렉트로 또는 화학 처리에 결합 된 단일 단백질 플라스미드 기반의 초점 주사 원하는 변형을 표현 조건부 유전자 변형 라인의 생성이 (가) 있습니다. 우리는 이전에 설계성인 zebrafish의 전뇌 (22)의 심실 세포 조절 유전자 기능의 신속하고 효율적인 방법으로 cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 zebrafish의 두뇌에 모르의 올리고 뉴클레오티드 또는 단백질 등 다양한 물질을 관리하기위한 방법. 우리의 연구에서 생체 morpholinos를 때문에 공유 결합 등의 electroporation 23과 같은 추가 permeabilization에 대한 필요없이 관심의 세포에 효율적으로 전달이 가능 풍부한 배달 펩티드를, 아르기닌에 링크 모르 분자를 포함하는 그들의 화학 하였다. 이 주사 후 원하는 조직의 철저한 타겟팅, 우리가 성인 zebrafish의 telencephalon 22에서 관찰 맘 허용합니다. 생체 morpholinos를 사용 따라서 이러한 일렉트로이나 DNA 분자의 초점 주사로 대상 조직의 기존 방법보다 우수합니다.
여기에, 우리는 우리가이 작업을 수행을 제공하는 방법 시각적으로 보여단계별 프로토콜입니다. 우리는 주입 혼합 및 주입 및 주입 장치를 설정하는 방법을 보여줌으로써 진행되는 물고기의 준비를 설명과 함께 시작합니다. 우리는 microinjector를 사용하여 morpholinos와의 두개골과 주입에 절개를 생성 포함 cerebroventricular 주입 방법에 대한 설명을 제공합니다. 우리는 또한 중요한 포인트 최적화 문제 해결 가이드로 진술하여 전체 과정을하는 동안주의해야 할 하나의 필요에 정교한.
Protocol
1. 사출 혼합물의 준비
- 세포가보다 효율적으로 정상적인 모르 분자 이상을 내면화으로 생체 morpholinos를 사용합니다. 자세한 내용은 제조업체의 정보 (: 시약 및 재료 표 1)을 참조하십시오.
- 분사의 정확성을 시각화하는 형광 추적 염료 (예를 들어, CellTracker 레드 CMTPX, Invitrogen 사)를 사용합니다. 이 염료는 세포의 대사 만 섭취 후 세포에서 형광이됩니다. 따라서,이 단계를 효율적으로 cerebroventricular microinjection의 대상이되는 셀을 결정하는 매우 중요합니다.
- 준비 인산 완충 식염수 (PBS) (137 mM의 NaCl을 2.7 mM의 KCl을, 10MM 나 2 HPO 4, 2 밀리미터 KH 2 PO 4, 산도 : 7.4) 모르 솔루션을 희석. 모르 솔루션의 희석이 필요한 경우, 항상 PBS를 사용합니다.
- 모르 솔루션의 10 μL과 일의 1 μl를 추가하여 주입 믹스의 10 μl를 준비전자 셀 추적 염료 (희석 또는 원액을 모르 솔루션의 재고 농도가 500 μM입니다 22 모르의 여러 가지 다른 용량을 나타냅니다 우리의 이전 결과 -.. 50 μM에서 500 μM까지 - 효율적인에서 최저 서로 다른 수준의 결과 hypomorphic 표현형에 최저). 용액 1 μL 한 제브라 피쉬의 뇌에 주입 충분하다.
- 잘 혼합하고 주입 할 때까지 실온에서 보관하십시오.
2. 사출 장치의 준비
- 바늘 풀러를 사용하여 유리 주입 모세를 준비합니다. 난방 사이클 값 : 463, 사이클 값을 당기 : 230, 속도 : 1.5 초, 시간 : 75 밀리 초 다음 매개 변수를 사용합니다.
- 압력 소스를 켜고 50 PSI 또는 3.5 바까지 압력 설정을 조정합니다.
- 다음과 같이 microinjector 설정을 조정 압력 : 20 PSI, 배출 압력이 10 psi의 게이팅 2.5, 100 밀리 초 범위의 기간 값을 누릅니다.
- 회전링 조명과 현미경 스테이지를 통해 반지를 찾습니다.
- 현미경 옆에 적절한 위치에 모세관 홀더를 놓습니다.
- 홀더에 모세관 유리를 삽입합니다. 45도까지 분사 각도를 조정합니다.
- 미세 끝 집게를 사용하여 모세관 유리의 끝을 물고 오리피스의 압력 출력을 보정합니다. 이 물고기 물에 바늘의 끝을 담그고 지속적인 압력 펄스를 제공하여 테스트해야합니다. 발생하는 기포는 최적의 압력 / 오리피스의 크기 표시 하나만 행되어야한다. 이 교정의 데모 비디오를 참조하십시오.
- 공기 방울이없이 주사 용액을 모세관 유리를로드합니다.
- 모세관 유리와로드 주입 솔루션의 끝 사이의 공기를 제거하는 압력을 적용합니다.
3. 마취
- 에틸 - 마취제의 원액 (0.1 % MESAB 준비M-aminobenzoate methanesulphonate).
- 물이 충분한 양의 플라스틱 마우스 케이지 또는 다른 운송 컨테이너에 자신의 탱크에서 물고기의 원하는 번호를 제거합니다.
- 마취 원액 5 ㎖와 물고기 물 200 mL를 혼합하여 작은 플라스틱 상자에 진통제 솔루션을 준비합니다. 마취제의 최종 농도 : 0.0025 % (v / v)의.
- 마취와 플라스틱 페트리 접시를 반 입력합니다. 주입이 접시를 사용합니다.
- 물고기 정복 할 때까지 마취제에있는 물고기를 품어.
4. 절개 Cerebroventricular 미세 주입
- 물고기 그물을 사용하여 상자에서 물고기를 제거하고 페트리 접시에 놓습니다.
- 부드럽게 약간 아래로 기울어하는 방식으로 집게와 방향을 머리와 물고기를 잡아. 이 절개를 용이하게합니다.
- 30 게이지 가시 엔드 바늘을 사용하여 두개골에 작은 슬릿을 생성합니다. 바늘의 전용 팁을 사용하고 이상 침투하지 않습니다만큼이 같은 뇌에는 뇌 조직에 손상을 일으킬 출혈로 매니페스트됩니다 것입니다.
- 물고기를 잡고 유지하고 유리의 끝이 절개 사이트를 통해 모세관 삽입합니다.
- 동양 유리의 끝은 telencephalon으로 모세관. 이 조직 손상을 생성하고 또한 주입 솔루션의 분산을 방지로 뇌 조직을 만지지 마십시오.
- 솔루션을 주입. 액체는 즉시 주사 후 분산.
5. 복구 및 사출 정확도 분석
- 신선한 생선 물을 가진 플라스틱 상자에 주입 설정과 장소에서 물고기를 제거합니다.
- 복구 할 수 있습니다.
- 간단히 0.0025 %의 MESAB로 물고기를 다시 마취시키다과 형광 현미경 물고기를 확인합니다. 빨간 형광의 철저한 분산 주입 액체의 광범위한 분포의 표시이다.
- 플라스틱 상자로 물고기를 넣습니다.
- t에 플라스틱 상자를 연결오랜 시간 동안 산소 물고기와 유지에 그는 순환 시스템입니다.
- 같은 행동 분석 등 원하는 목적을 위해 물고기를 사용하거나 추가 분석 (조직 학적 시약 염색, 면역 등) 조직 표본을 준비하는 주사 후 원하는 시간 지점에서 동물을 희생. 9,11,17-20,24-27 다음 참조는 성인 zebrafish의 뇌를 분석하는 방법의 예를 제공합니다. (50 % 이상 최저) 효율적인 최저를 관찰하는 가장 빠른 시간은 우리의 연구 22에서 12 시간이었다.
6. 제안 된 과학 제어
- 음성 대조군으로 어떤 표현형의 원인이되어 있지 않은 불일치 모르 분자를 사용합니다. 호텔의 모든 유전자는 표준 모르 분자 또는 특별히 디자인 모르 컨트롤을 사용합니다. 또한, 어법의 비 특정 효과 나 독성을 평가하기 위해 더 대조군으로 (이 경우 PBS)에 용매를 사용모르 주사를 제어 / ATCH.
- PCNA morpholinos를 긍정적 인 컨트롤로 이전 22 설명한 사용합니다. 이 모르은 성인 zebrafish의 뇌 (주입 1 일 안에 75~95%의 최저 효율) 22 효율적인 최저의 원인이됩니다.
Representative Results
Cerebroventricular 미세 주입은 주입 솔루션의 광범위한 배포에 이르게
그림 1에 묘사 된 cerebroventricular 미세 주입의 흐름과 기술 체계 사용하여, 우리는 성인 zebrafish의 두뇌에 모르의 올리고 뉴클레오티드를 관리. 정확한 주입 프로토콜은 심실 표면 (그림 2A)에 가까운 세포를 표적으로 뇌와 효율을 통해 주입 된 액체의 분산에 이르게한다. 모세관 유리의 뇌 조직을 impales 주사 주입 지점 (그림 2B)에서 조밀 한 형광 신호를해야합니다. 주입 된 양이 충분하지 않은 경우, 약한 형광 신호는 (그림 2C) 관찰됩니다.
Cerebroventricular 미세 주입은 성인 zebrafish의 두뇌의 심실 영역에서 유전자 발현을 쓰러 뜨린 사용할 수 있습니다
우리는 일을 보여생체 morpholinos를에서 심실 표면 내부에 몇 가지 세포의 직경을 관통 할 수 있고, 따라서 효율적으로 심실 세포 (그림 3A의, 3B) 타겟팅 할 수 있습니다. 모르 주입은 해당 단백질 (그림 3C, 3D에서와 같이 예 PCNA입니다)의 생산을 완화하므로 최저 유전자 발현 할 수 있습니다. 우리는 이전에이 기술을 사용하여 유전자를 노크하는 성인 신경 세포 (그림 3E, 3F) 또는 재생 응답 (그림 3 세대, 3H) 동안 작동 결과에 이르게 것을 증명하고있다. 우리는 효율적인 최저 범위는 (50 % 이상 최저) morpholinos를 22 주사 후 약 12 시간을 달성 것을 보여 주었다. 우리는 또한 효율적인 최저 기간은 약 5 ~ 일 PCNA 단백질 22 주사 후까지입니다 것을 관찰했다. 70 % 이상 최저 3 일 주사 22 후까지 보였다. 최저 곡선은 따라 오입니다N 내인성 단백질과 모르 분자의 효율성의 표현의 수준, 그리고이 실험에 의해 모든 유전자에 대해 결정해야합니다. 우리의 연구에서 우리는 모르 분자의 관리가 로컬 및 전신 독성을 일으키지 않는 탓 CVMI 절차는 동물의 생존을 위태롭게 것을 보지 않았다.
그림 1. cerebroventricular 주입 기술의 도식 표현. (A) 주사 광학 tectum의 수준 (구약 2)에서 성인 zebrafish의 (1)의 등쪽에서 수행됩니다. 절개는 30 게이지 바늘 (3)와 광학 tectal 두개골 접시 위에 만든다. 유리 모세관 사용 모르 분자는 심실 유체 (4)에 주입된다. 철저한 분산은(5) 즉시 chieved. (B) canula과 가시 끝이 높은 배율로 표시됩니다. (C) 절개하기 전에 바늘의 방향. (D) 절개 동그라미와 점선에 의해 설명된다. (E) 표시 및 사출이 수행되는 모세관 주입에 있습니다. 모든 패널은 심판에서 적응되었다. 22. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 분사의 효율성과 정확성의 비교. (A) 좋은 주사는 심실 표면에 가까운 세포를 표적으로 이어집니다. 모세관 유리의 뇌 조직에 삽입되어있는 경우 (B)이 중앙에 위치한 형광 신호를 생성합니다. (C
그림 3. . GFP 양성 핵을 보여주는 유전자 변형 라인 : 모르 침투, 유전자 knockdowns 및 기능 결과의 효율성 (A) GFP 컨트롤의 telencephalic 단면 전이를 (GFP H2A) 모르 주입에 면역 염색. GFP 양성 핵을 보여주는 유전자 변형 라인 (B) GFP가 전이 (GFP H2A)를 모르 주입 GFP 안티센스의 telencephalic 단면에 면역 염색. 심실 지역에서 GFP 신호의 차이를 확인합니다. V : 뇌실. (C) PCNA 제어 모르 주입 PCNA 양성 세포의 광범위한 분포를 보여주는 두뇌에 면역 염색. (
Discussion
우리가 여기에서 설명하는 방법은 성인 zebrafish의 두뇌에 morpholinos를 쉽고 빠르게 관리 할 수 있습니다. 우리는 우리의 주입 방법은 효율적으로 심실 세포와 신경 반응의 기능적 결과의 결과에 유전자 발현을 차단하는 것을 증명하고있다.
cerebroventricular 미세 주입을 실행하는 동안에 대해주의해야 할 중요한 점이있다. 예를 들어, 모르 분자의 효과는 사용되는 농도에 따라 달라집니다. 이 농도는 최종 사용자에 의해 결정되어야한다. 우리는 표준 배아 주입 프로토콜 28-30을 사용하여 배아에 주입하여 사전 테스트에 이상적 원액으로 시작 (500 μM) 및 직렬 희석을 수행하는 것이 좋습니다합니다. 이전에, 우리는 50 μM에서 500 μM (22)에 이르기까지 morpholinos를 농도와 최저 효율의 다른 수준을 얻었다. 둘째, 모세관 유리의 오리피스이 Larg 수 없습니다이 같은 E는 주사 후 뇌에 광범위한 액체 유입으로 이어질 것입니다. 이 적절한 주입을 방지하므로 마찬가지로, 오프닝이 너무 좁은 안됩니다. 하나는 물 페트리 접시에 공기를 펌핑하여 최적의 오리피스 압력 조합을 확인할 수 있습니다. 발생하는 거품이 아니라 여러 행의 단일 행에 있어야합니다. 우리는 비디오에서이 문제를 보여줍니다. 셋째, 마취제에있는 물고기를 배양하는 것은 중요합니다. 물고기 마취제의 2 분보다 더 오래 보존 할 수 없습니다. 이 주사 후 회복 속도를 방해합니다. 넷째, 절개의 위치는 철저하게 주입 된 액체를 분산 중요합니다. 광학 tectum에 심실 지역은 중앙선 위의 크고 옆으로 좁아집니다. 따라서 실험은 중간 선에 두개골 주변의 틈새를 생성해야하고 telencephalic 지역을 덮고있는 두개골 플레이트 바로 꼬리.
cerebroventricular injectio의 장점 중 하나N (CVMI) 메소드는 신속성이다. CVMI 유전자 기능을 시금위한 빠른 방법입니다. 일반적으로 몇 개월이 걸릴 기능 연구를위한 유전자 변형 라인의 세대에 비해이 기능은 중요하고 유용하다. 또한, CVMI는 주입 된 액체의 균일 한 분포에 이르게하므로 초점 주사 또는 electroporation을 비교하여 유전자 활동의 상대적으로 철저한 조작을 제공합니다. CVMI하여 여러 유전자 주입을 준비하는 여러 morpholinos를 올리고 뉴클레오타이드를 포함하는 혼합하여 동시에 무너 뜨렸다 수 있습니다. CVMI은 주어진 모르의 올리고 뉴클레오티드의 다른 농도를 주입하고, 따라서 hypomorphic 표현형 분석을 위해 사용될 수있다 사용할 수 있습니다. 마지막으로,이 주사 패러다임은 독성을 일으키거나 동물의 생존을 손상하지 않습니다.
CVMI 기술은 이러한 modulatory 펩티드, 마약, 플라스미드 DNA 또는 RNA modulatory 개월의 주입과 같은 연구의 다른 유형에 대한 확장 될 수세포의 생리에 영향을 미칠 수 lecules 또는 다른 물질. 분자의 조합을 시금 및 용량 반응 분석을 수행 가능 hypomorphic 표현형을 연구 있도록 우리의 방법을 사용하고 있습니다. 이러한 특성을 가진, CVMI는 성인 zebrafish의 뇌에서 발현 연구를위한 빠르고 쉽게 분석 할 증명하고 신속한 검사 및 기능 분석을 엽니 다.
성인 제브라 피쉬의 뇌는 구조적으로 전체 rostrocaudal 축을 따라 새로운 뉴런을 생성 할 수 있으며, 또한 외상성 부상 후 재생성 할 수 있습니다. 이 제한된 신경과 만약에 전혀, 오히려 가난한 재생 능력을 가진 포유 동물의 두뇌에 대조적입니다. 이러한 광범위한 줄기 세포 활동과 회복 능력은 현재 대부분 알 수 있습니다 중추 신경계 재생에 필요한 분자 프로그램을 이해하기위한 유용한 모델 생물을 제브라 피쉬 있습니다. 따라서 '제의 재생 적성의 분자 기초 조사brafish 뇌는 물고기와 포유류의 뇌 부상 후 반응 또한 인간의 재생 의학 치료를위한 도로를 부여하는 방법의 근본적인 차이를 설명 할 흥미로운 연구 영역이다. 그들은 신경성 조상 3,8,20이기 때문에 척추 뇌 가소성 및 재생의 분자 인프라를 이해하기 위해서는, glial 세포는 중요한 연구 영역으로 역할을합니다. 따라서, 제브라 피쉬의 뇌의 방사상 glial 세포에서 유전자 기능을 변경하는 CVMI 기술을 사용하면 해명 수단이 얼마나 물고기 뇌가 효율적으로 성인 신경과 재생 반응 커플 전구 활동을 할 수 있습니다. 우리는 최근 성인 zebrafish의 두뇌 24,26,27의 회생 신경 반응의 여러 요소와 신호 경로의 참여와 요구 사항을 보여,이 연구는 CVMI 방법의 사용에 의해 가능하게되었다. 전반적으로, 우리는 제브라 피쉬의 뇌에서 얻는 지식은 리젠를 부과 무력화 될 수있다상해에 반응하고, 따라서 인간의 신경 질환 및 급성 부상에 대한 임상 치료를 설계하는 데 도움이됩니다 포유류 glial 세포에 rative 능력.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (SFB 655)과 유럽 연합 (ZF-건강)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| CellTracker Red CMTPX | Life Technologies, Invitrogen | C34552 | Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy |
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing the fish |
| Petri dishes | Sarstedt | 821,472 | For handling the fish during injection and imaging |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | As sterile dilution medium |
| Vivo morpholinos | Gene Tools Inc. | Customized | More info on vivo morpholinos: www.gene-tools.com |
| Equipment | |||
| Barbed-end needle | Becton-Dickinson | 305178 | To generate the incision in the skull |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | To snap off the tip of the glass capillary |
| Fluorescence camera | Zeiss, Nikon, Leica | Varies with the manufacturer | To visualize the fluorescence after injection |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | To hold the fish in position |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | For microinjection |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjection |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjection |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | For illuminating the specimen |
References
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