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Neuroscience

Morpholino oligonucleotides के Cerebroventricular Microinjection का प्रयोग वयस्क zebrafish मस्तिष्क में जीन एक्सप्रेशन के micromanipulation

Published: May 23, 2013 doi: 10.3791/50415
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1DFG-Center for Regenerative Therapies Dresden, Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden

Summary

इस अनुच्छेद में, हम antisense morpholino oligonucleotides उपयोग कर वयस्क zebrafish telencephalon की निलय कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए एक विधि का प्रदर्शन. हम वयस्क हड्डीवाला मस्तिष्क में कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक कुशल और त्वरित प्रोटोकॉल के रूप में इस विधि प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

ऊतकों में जीन की अभिव्यक्ति का हेरफेर कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए आवश्यक है. इस पत्र में, हम वयस्क zebrafish मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति मिलाना करने के लिए एक साधन के रूप में cerebroventricular microinjection (CVMI) तकनीक का प्रदर्शन. CVMI का उपयोग करके, पदार्थ cerebroventricular द्रव में प्रशासित किया जा सकता है और अच्छी तरह से मस्तिष्क की rostrocaudal अक्ष के साथ वितरित किया. हम विशेष रूप से vivo में जीन अभिव्यक्ति नीचे दस्तक के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं जो antisense morpholino oligonucleotides है, के उपयोग पर ध्यान केंद्रित. हमारे विधि में, जब लागू, morpholino अणुओं निलय सतह अस्तर कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है. इन कोशिकाओं को तंत्रिकाजन्य पूर्वज के रूप में कार्य जो रेडियल glial कोशिकाओं, शामिल हैं. इसलिए, रेडियल glial कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति नीचे दस्तक zebrafish में व्यापक न्यूरोजेनेसिस प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है, और भी रीढ़ वयस्क Neurogen उठाना पड़ सकता कैसे में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगाesis प्रतिक्रिया. इस तरह के एक समझ भी मानव neurodegenerative विकारों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के उत्थान में नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए प्रयासों में मदद मिलेगी. इस प्रकार, हम जीन अभिव्यक्ति और वयस्क zebrafish अग्रमस्तिष्क में neurogenesis प्रतिक्रिया को बदलने के लिए एक त्वरित और कारगर तरीके के रूप में cerebroventricular microinjection तरीका मौजूद है. हम भी CVMI प्रक्रिया से बाहर ले जाने के लिए पर समस्या निवारण युक्तियों और अन्य उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैं.

Introduction

वयस्क neurogenesis रीढ़ को एक आम लक्षण है, लेकिन प्रसार और दक्षता की अपनी डिग्री फाइलोजेनी 1,2,3,4,5,6 साथ बदलता रहता है. Teleost zebrafish अपने पूरे मस्तिष्क 4,5,9,10 में सोलह अलग स्टेम सेल डोमेन और संबद्ध तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों में शामिल है, जबकि उदाहरण के लिए, वयस्क स्तनधारी दिमाग काफी हद तक अग्रमस्तिष्क 7,8, के लिए प्रतिबंधित स्टेम सेल क्षेत्रों के होते हैं. स्तनपायी और zebrafish के बीच यह बदलाव स्टेम सेल रखरखाव और पूर्वज कोशिकाओं की तंत्रिकाजन्य क्षमता के तंत्र में एक असमानता प्रतिबिंबित हो सकता है. zebrafish मस्तिष्क द्वारा नियोजित आणविक तंत्र मानव में neurodegenerative विकारों से निपटने के लिए चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में दिमाग में न्यूरॉन्स के उत्पादन के लिए zebrafish के आजीवन क्षमता भी नैदानिक ​​प्रभाव पैदा कर सकता है.

वयस्क zebrafish मस्तिष्क के कई स्टेम कोशिकाओं क्षेत्रों का विश्लेषण किया गया है और यह दिखाया गया है किउन क्षेत्रों का निलय सतह परत कोशिकाओं पूर्वज कोशिकाओं 9,11-20 के रूप में सेवा करते हैं. Zebrafish telencephalon में विस्तृत विश्लेषण करती है, उदाहरण के लिए, तंत्रिकाजन्य पूर्वज 19, 20 होने के लिए यह मस्तिष्क क्षेत्र के निलय सतह चित्रित जो रेडियल glial कोशिकाओं की पहचान की. इस तरह के सेरिबैलम और neuroepithelial कोशिकाओं तंत्रिकाजन्य इनपुट 16,21 प्रदान ventricularly स्थित जहां ऑप्टिक tectum, के रूप में अन्य क्षेत्रों के लिए सच है. यह अंत करने, वयस्क zebrafish मस्तिष्क में व्यापक तंत्रिकाजन्य योग्यता शासी आणविक तंत्र को समझने पूर्वज कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के हेरफेर की आवश्यकता है.

विभिन्न तरीकों पहले से zebrafish में नियमन जीन समारोह के लिए बताया गया. ये electroporation या रासायनिक उपचार करने के लिए मिलकर एक प्रोटीन, प्लाज्मिड आधारित फोकल इंजेक्शन के वांछित वेरिएंट व्यक्त सशर्त ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी में शामिल हैं. हम पहले से एक बनाया गयावयस्क zebrafish अग्रमस्तिष्क 22 की निलय कोशिकाओं में नियमन जीन समारोह का एक त्वरित और कारगर तरीके के रूप में cerebroventricular microinjection का उपयोग कर वयस्क zebrafish मस्तिष्क में morpholino oligonucleotides या प्रोटीन सहित विभिन्न पदार्थों के प्रशासन के लिए विधि. हमारे अध्ययन में, विवो morpholinos क्योंकि covalently ऐसे electroporation के रूप में 23 अतिरिक्त permeabilization के लिए आवश्यकता के बिना ब्याज की कोशिकाओं को कुशल प्रसव जो सक्षम अमीर वितरण पेप्टाइड्स, arginine से जुड़ा हुआ morpholino अणु को शामिल उनके रसायन शास्त्र का इस्तेमाल किया गया. इस इंजेक्शन के बाद वांछित ऊतक के एक संपूर्ण लक्ष्यीकरण, बस हम वयस्क zebrafish telencephalon 22 में मनाया क्या तरह की अनुमति होगी. विवो morpholinos के प्रयोग इसलिए ऐसे इलेक्ट्रोपोरेशन या डीएनए अणु का केन्द्र इंजेक्शन के रूप में लक्षित कर ऊतक की पहले से ही मौजूदा तरीकों से बेहतर कर रहे हैं.

यहाँ, हम यह कार्रवाई करने और एक प्रदान कैसे नेत्रहीन प्रदर्शितकदम दर कदम प्रोटोकॉल. हम इंजेक्शन मिश्रण और इंजेक्शन, और इंजेक्शन तंत्र की स्थापना की है कि कैसे प्रदर्शन करके आगे बढ़ना होने की मछली की तैयारी समझाने के साथ शुरू करते हैं. हम microinjector का उपयोग कर morpholinos की खोपड़ी और इंजेक्शन में एक चीरा सृजन शामिल है जो cerebroventricular इंजेक्शन विधि, की एक विवरण प्रदान करते हैं. हम यह भी महत्वपूर्ण बिंदुओं अनुकूलन या समस्या निवारण गाइड के रूप में उन्हें बताते हुए पूरी प्रक्रिया के दौरान सतर्क रहने की एक की जरूरत पर प्रकाश डालेंगे.

Protocol

1. इंजेक्शन मिश्रण की तैयारी

  1. कोशिकाओं को और अधिक कुशलता से सामान्य morpholino अणुओं से उन्हें भली रूप विवो morpholinos का प्रयोग करें. जानकारी के लिए निर्माता की जानकारी (: अभिकर्मकों और सामग्री तालिका 1) देखें.
  2. इंजेक्शन की सटीकता की कल्पना करने के लिए एक फ्लोरोसेंट ट्रैकिंग डाई (जैसे CellTracker लाल CMTPX, Invitrogen) का प्रयोग करें. यह डाई सेल में metabolized और केवल तेज होने के बाद सेल में फ्लोरोसेंट हो जाता है. इसलिए, इस चरण कुशलतापूर्वक cerebroventricular microinjection के द्वारा लक्षित कर रहे हैं कि कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  3. तैयार फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10mM ना 2 4 HPO, 2 मिमी 2 के.एच. पीओ 4, पीएच: 7.4) morpholino समाधान गिराए लिए. Morpholino समाधान के कमजोर पड़ने की आवश्यकता है, हमेशा पीबीएस का उपयोग करें.
  4. Morpholino समाधान के 9 μl और वीं की 1 μl जोड़कर इंजेक्शन मिश्रण के 10 μl तैयारई सेल ट्रैकर डाई (पतला या undiluted morpholino समाधान के शेयर एकाग्रता 500 माइक्रोन है 22 morpholino की है कि कई अलग अलग मात्रा का संकेत हमारे पिछले परिणाम -.. 50 माइक्रोन से 500 माइक्रोन से लेकर - एक कुशल से पछाड़ना के विभिन्न स्तरों में परिणाम hypomorphic phenotypes को पछाड़ना). समाधान के 1 μl एक zebrafish के मस्तिष्क में इंजेक्शन के लिए पर्याप्त है.
  5. अच्छी तरह मिक्स और इंजेक्शन तक कमरे के तापमान पर स्टोर.

2. इंजेक्शन उपकरण की तैयारी

  1. एक सुई खींचने का उपयोग गिलास इंजेक्शन केशिकाओं तैयार. ताप चक्र मूल्य: 463, चक्र मूल्य खींच: 230, वेग: 1.5 सेकंड, समय: 75 मिसे निम्नलिखित मानकों का प्रयोग करें.
  2. दबाव स्रोत पर मुड़ें और 50 साई या 3.5 सलाखों के दबाव सेटिंग्स समायोजित.
  3. निम्नानुसार microinjector सेटिंग्स समायोजित करें: दबाव 20 साई, बेदखल दबाव 10 साई, gating के 2.5 और 100 मिसे सीमा की अवधि के मूल्य पकड़.
  4. मोड़अंगूठी प्रकाशक पर और खुर्दबीन मंच पर अंगूठी का पता लगाएँ.
  5. माइक्रोस्कोप के बगल में एक उपयुक्त स्थान पर केशिका धारक रखें.
  6. धारक में केशिका गिलास डालें. 45 डिग्री के लिए इंजेक्शन कोण समायोजित करें.
  7. एक ठीक अंत संदंश का उपयोग केशिका कांच की नोक बंद स्नैप और छिद्र से दबाव उत्पादन जांचना. यह मछली पानी में सुई की नोक डुबो और एक निरंतर दबाव पल्स देकर परीक्षण किया जाना चाहिए. उत्पन्न होने वाली हवाई बुलबुले इष्टतम दबाव / छिद्र आकार का एक संकेत है जो केवल एक ही पंक्ति, होना चाहिए. इस अंशांकन के प्रदर्शन के लिए वीडियो देखें.
  8. हवाई बुलबुले को फँसाने के बिना इंजेक्शन समाधान के साथ केशिका गिलास लोड.
  9. केशिका गिलास और लोड इंजेक्शन समाधान की नोक के बीच हवा निकालने के लिए दबाव लागू करें.

3. संज्ञाहरण

  1. एथिल - anesthetics के शेयर समाधान (0.1% MESAB तैयारमीटर aminobenzoate methanesulphonate).
  2. पानी की पर्याप्त राशि के साथ प्लास्टिक माउस पिंजरों या अन्य परिवहन कंटेनर में अपने टैंक से मछली की वांछित संख्या निकालें.
  3. निश्चेतक स्टॉक समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ मछली पानी की 200 मिलीलीटर के मिश्रण से एक छोटे प्लास्टिक के डिब्बे में बेहोशी समाधान तैयार है. निश्चेतक के अंतिम एकाग्रता: 0.0025% (v / v).
  4. निश्चेतक के साथ एक प्लास्टिक पेट्री डिश आधा भरें. इंजेक्शन के लिए इस डिश का प्रयोग करें.
  5. मछली subdues तक एनेस्थेटिक्स में मछली सेते हैं.

4. चीरा और Cerebroventricular Microinjection

  1. एक मछली जाल का उपयोग कर बॉक्स से मछली निकालें और पेट्री डिश में जगह.
  2. धीरे यह थोड़ा नीचे की ओर झुक जाता है कि एक तरह से संदंश और पूरबी सिर के साथ मछली पकड़. इस चीरा की सुविधा होगी.
  3. एक 30 गेज कांटेदार अंत सुई का उपयोग खोपड़ी पर एक छोटा सा छेद उत्पन्न करें. सुई के टिप का उपयोग करें और अधिक से अधिक प्रवेश नहीं करतेपर्याप्त इस रूप में मस्तिष्क में मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान होता है और खून बह रहा है के रूप में प्रकट होगा.
  4. मछली पकड़ रखें और कांच की नोक चीरा साइट के माध्यम से केशिका डालें.
  5. ओरिएंट कांच की नोक telencephalon की ओर केशिका. यह ऊतकों को नुकसान बनाता है और भी इंजेक्शन समाधान के फैलाव को रोकता है के रूप में मस्तिष्क के ऊतकों को छूने से बचें.
  6. समाधान इंजेक्षन. तरल तुरंत इंजेक्शन के बाद disperses.

5. वसूली और इंजेक्शन शुद्धता का विश्लेषण

  1. ताजा मछली पानी के साथ एक प्लास्टिक के डिब्बे में इंजेक्शन सेटअप और जगह से मछली निकालें.
  2. वसूली की अनुमति दें.
  3. संक्षेप में 0.0025% MESAB साथ मछली फिर से बेहोश करना और प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे मछली की जाँच करें. लाल प्रतिदीप्ति की एक पूरी तरह फैलाव इंजेक्शन तरल के व्यापक वितरण का एक संकेत है.
  4. प्लास्टिक बॉक्स को वापस मछली रखो.
  5. टी के लिए प्लास्टिक बॉक्स से कनेक्ट करेंसमय की लंबी अवधि के लिए आक्सीजन के साथ मछली और बनाए रखने के लिए वह परिसंचरण तंत्र.
  6. इस तरह के व्यवहार के विश्लेषण के रूप में वांछित उद्देश्यों के लिए मछली का प्रयोग करें या आगे के विश्लेषण (ऊतकीय stainings, immunohistochemistry, आदि) के लिए ऊतक नमूनों को तैयार करने के लिए इंजेक्शन के बाद वांछित समय बिंदुओं पर पशुओं की बलि. 9,11,17-20,24-27: निम्न संदर्भ वयस्क zebrafish मस्तिष्क का विश्लेषण करने के लिए कैसे का उदाहरण देते हैं. (50% से अधिक पछाड़ना) एक कुशल पछाड़ना निरीक्षण करने के लिए सबसे तेज समय हमारे अध्ययन के 22 में 12 घंटा थी.

6. सुझाव वैज्ञानिक नियंत्रण

  1. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किसी भी फेनोटाइप का कारण नहीं माना जाता है कि एक बेमेल morpholino अणु का प्रयोग करें. ब्याज की हर जीन के लिए या तो एक मानक morpholino अणु या विशेष रूप से डिजाइन morpholino नियंत्रण का प्रयोग करें. इसके अतिरिक्त, mism की गैर विशिष्ट प्रभाव या विषाक्तता का आकलन करने के लिए एक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस मामले (पीबीएस में) विलायक का उपयोगmorpholino इंजेक्शन / नियंत्रण atch.
  2. PCNA morpholinos सकारात्मक नियंत्रण के रूप में पहले 22 में वर्णित का उपयोग करें. इस morpholino वयस्क zebrafish मस्तिष्क (इंजेक्शन के 1 दिन के भीतर 75-95% पछाड़ना दक्षता) 22 में कुशल पछाड़ना का कारण बनता है.

Representative Results

Cerebroventricular microinjection के इंजेक्शन समाधान के व्यापक वितरण करने के लिए सुराग

चित्र 1 में दर्शाया cerebroventricular microinjection की कार्यप्रवाह और तकनीकी योजना का उपयोग करना, हम वयस्क zebrafish मस्तिष्क में morpholino oligonucleotides दिलाई. एक सटीक इंजेक्शन प्रोटोकॉल निलय सतह (2A चित्रा) के करीब लक्ष्य कक्षों मस्तिष्क और कुशल भर इंजेक्शन तरल के फैलाव की ओर जाता है. केशिका गिलास मस्तिष्क के ऊतकों impales जहां इंजेक्शन इंजेक्शन के बिंदु (चित्रा 2 बी) पर एक घना फ्लोरोसेंट संकेत होगा. इंजेक्शन राशि पर्याप्त नहीं है, कमजोर फ्लोरोसेंट संकेत (चित्रा -2) मनाया जाएगा.

Cerebroventricular microinjection के वयस्क zebrafish मस्तिष्क के निलय क्षेत्र में जीन अभिव्यक्ति नीचे दस्तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है

हम वें से पता चला हैविवो morpholinos में निलय सतह के अंदर कुछ सेल व्यास प्रवेश कर सकते हैं और इसलिए कुशलतापूर्वक निलय कोशिकाओं (आंकड़े 3 ए, 3 बी) को लक्षित कर सकते हैं. Morpholino इंजेक्शन यह इसी प्रोटीन (आंकड़े -3 सी, 3 डी में दिखाया के रूप में एक उदाहरण PCNA है) का उत्पादन कम होगा के रूप में पछाड़ना जीन अभिव्यक्ति कर सकते हैं. हम पहले से इस तकनीक का उपयोग जीन नीचे दस्तक वयस्क neurogenesis (आंकड़े 3E, 3F) या उत्थान प्रतिक्रिया (आंकड़े 3 जी, 3H) के दौरान कार्यात्मक परिणाम की ओर जाता है कि प्रदर्शन किया है. हम कुशल पछाड़ना (सीमा 50% से अधिक पछाड़ना) morpholinos 22 के इंजेक्शन के बाद लगभग 12 घंटे उपलब्ध हो जाता है कि प्रदर्शन किया. हम भी कुशल पछाड़ना अवधि लगभग 5 दिनों PCNA प्रोटीन 22 के लिए इंजेक्शन के बाद जब तक है कि मनाया. 70% से अधिक पछाड़ना 3 दिनों इंजेक्शन 22 के बाद जब तक देखा गया था. पछाड़ना घटता निर्भर हैं ओएन अंतर्जात प्रोटीन और morpholino अणुओं की दक्षता की अभिव्यक्ति के स्तर, और प्रयोगकर्ता द्वारा हर जीन के लिए निर्धारित किया गया है. हमारे अध्ययन में, हम morpholino अणुओं का प्रशासन स्थानीय है और एक प्रणालीगत विषाक्तता का कारण नहीं है शायद क्योंकि CVMI प्रक्रिया, पशु का अस्तित्व समझौता है कि नहीं देखा था.

चित्रा 1
चित्रा 1. Cerebroventricular इंजेक्शन तकनीक का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (ए) इंजेक्शन ऑप्टिक tectum का स्तर (ओ.टी., 2) में वयस्क zebrafish (1) के पृष्ठीय से किया जाता है. एक चीरा एक 30 गेज सुई (3) के साथ ऑप्टिक tectal खोपड़ी थाली से अधिक कर दिया है. कांच capillaries का प्रयोग, morpholino अणुओं निलय तरल पदार्थ (4) में इंजेक्ट किया जाता है. एक पूरी तरह से फैलाव है एक(5) तत्क्षण chieved. (बी) Canula और इसकी कांटेदार अंत उच्च वृद्धि में दिखाया गया है. (सी) चीरा पहले सुई के उन्मुखीकरण. (डी) चीरा परिक्रमा की और धराशायी लाइनों द्वारा उल्लिखित है. (ई) दिखाया और इंजेक्शन किया जाता है के रूप में केशिका इंजेक्शन स्थित है. सभी पैनलों रेफरी से अनुकूलित किया गया. 22. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. इंजेक्शन दक्षता और सटीकता की तुलना करें. (ए) एक अच्छा इंजेक्शन निलय सतह के करीब की कोशिकाओं को निशाना बनाने के लिए जाता है. केशिका गिलास मस्तिष्क के ऊतकों में डाला जाता है तो (बी), यह एक केन्द्र स्थित प्रतिदीप्ति संकेत उत्पन्न होगा. (सी

चित्रा 3
चित्रा 3. . GFP सकारात्मक नाभिक दिखा ट्रांसजेनिक लाइन: morpholino पैठ, जीन knockdowns और कार्यात्मक परिणाम की दक्षता (ए) GFP नियंत्रण के telencephalic पार वर्गों टीजी (GFP H2A) morpholino इंजेक्शन पर immunostaining. GFP सकारात्मक नाभिक दिखा ट्रांसजेनिक लाइन: (बी) GFP टीजी (GFP H2A) morpholino इंजेक्शन GFP antisense की telencephalic पार वर्गों पर immunostaining. निलय क्षेत्र में GFP के संकेत में अंतर ध्यान दें. ध्: निलय. (सी) PCNA नियंत्रण morpholino इंजेक्शन PCNA पॉजिटिव कोशिकाओं के व्यापक वितरण दिखा दिमाग पर immunostaining. ( PCNA antisense morpholino इंजेक्शन दिमाग पर immunostaining. (ई) BrdU और Huc / डी नियंत्रण पर immunostaining morpholino इंजेक्शन दिमाग 22 से पहले वर्णित एक BrdU पल्स पीछा प्रयोग के बाद नवजात न्यूरॉन्स निर्धारित करने के लिए. (एफ) BrdU और Huc / डी 22 से पहले वर्णित एक BrdU पल्स पीछा प्रयोग के बाद नवजात न्यूरॉन्स निर्धारित करने के लिए PCNA antisense morpholino इंजेक्शन दिमाग पर immunostaining. (जी) दस्तक डाउन PCNA CVMI कार्यात्मक परिणामों को जन्म दे जो पछाड़ना अंतर्जात जीन, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह दर्शाता है कि नवजात न्यूरॉन्स की पीढ़ी में महत्वपूर्ण कमी की ओर जाता है. सभी पैनलों रेफरी से अनुकूलित किया गया. 22 बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

हम यहाँ वर्णन विधि वयस्क zebrafish मस्तिष्क में morpholinos के लिए आसान और तेजी से प्रशासन की अनुमति देता है. हम अपनी इंजेक्शन विधि कुशलतापूर्वक निलय कोशिकाओं और neurogenesis के जवाब में कार्यात्मक परिणाम में परिणाम में जीन की अभिव्यक्ति को रोकता है कि प्रदर्शन किया है.

Cerebroventricular microinjection निष्पादित करते समय के बारे में सतर्क रहने की महत्वपूर्ण बातें हैं. उदाहरण के लिए, morpholino अणुओं के प्रभाव का इस्तेमाल किया एकाग्रता पर निर्भर करता है. यह एकाग्रता अंत उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया गया है. हम मानक भ्रूण इंजेक्शन प्रोटोकॉल 28-30 उपयोग कर भ्रूण में इंजेक्शन से पूर्व परीक्षण के लिए आदर्श शेयर समाधान के साथ शुरू (500 माइक्रोन) और धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं, और. इससे पहले, हम 50 माइक्रोन से 500 माइक्रोन 22 से लेकर morpholinos की सांद्रता के साथ पछाड़ना दक्षता के विभिन्न स्तरों से प्राप्त की. दूसरा, केशिका गिलास के छिद्र larg नहीं किया जाना चाहिएइस रूप में ई इंजेक्शन के बाद मस्तिष्क में व्यापक तरल बाढ़ को बढ़ावा मिलेगा. यह पर्याप्त इंजेक्शन को रोकने जाएगा के रूप में इसी तरह, उद्घाटन भी संकीर्ण नहीं होना चाहिए. एक पानी के साथ एक पेट्री डिश में हवा पंप से इष्टतम छिद्र दबाव संयोजन निर्धारित कर सकते हैं. उत्पन्न होने वाली बुलबुले नहीं बल्कि कई पंक्तियों में एक ही पंक्ति में होना चाहिए. हम वीडियो में यह प्रदर्शित करता है. तीसरा, निश्चेतक में मछली incubating महत्वपूर्ण है. मछली एनेस्थेटिक्स में 2 मिनट से अधिक समय तक नहीं रखा जाना चाहिए. इस इंजेक्शन के बाद वसूली दर प्रभावित होगी. चौथा, चीरा के स्थान पर अच्छी तरह से इंजेक्शन तरल dispersing के लिए महत्वपूर्ण है. ऑप्टिक tectum अधिक निलय क्षेत्र midline के ऊपर बड़ा है और laterally संकरा हो जाता है. इसलिए, प्रयोगकर्ता midline के लिए खोपड़ी में बंद भट्ठा उत्पन्न करनी चाहिए और telencephalic क्षेत्र को कवर खोपड़ी प्लेट को सिर्फ दुम.

Cerebroventricular injectio के लाभ में से एकएन (CVMI) विधि इसके द्रुतगति है. CVMI जीन समारोह परख करने की क्रिया के लिए एक त्वरित तरीका है. आम तौर पर कई महीने लगेंगे जो कार्यात्मक अध्ययन के लिए ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी की तुलना में जब यह सुविधा महत्वपूर्ण और उपयोगी है. इसके अतिरिक्त, CVMI इंजेक्शन तरल के समान वितरण की ओर जाता है और इसलिए फोकल इंजेक्शन या electroporation की तुलना में जब जीन गतिविधि का एक अपेक्षाकृत पूरी तरह जोड़ - तोड़, प्रदान करता है. CVMI के साथ, कई जीनों इंजेक्शन की तैयारी कई morpholinos oligonucleotide युक्त घोला जा सकता से एक साथ नीचे गिरा दिया जा सकता है. CVMI एक दिया morpholino oligonucleotides के विभिन्न सांद्रता इंजेक्षन करने के लिए, और इसलिए hypomorphic phenotypes के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, इस इंजेक्शन प्रतिमान विषाक्तता का कारण या जानवरों के अस्तित्व समझौता नहीं करता.

CVMI तकनीक ऐसी modulatory पेप्टाइड्स, दवाओं, प्लास्मिड डीएनए या modulatory आरएनए मो के इंजेक्शन के रूप में अध्ययन के अन्य प्रकार के लिए विस्तारित किया जा सकता हैकोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान को प्रभावित कर सकता है कि lecules या अन्य पदार्थ. अणुओं के संयोजन परख और खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण प्रदर्शन संभव hypomorphic phenotypes का अध्ययन करने की अनुमति, हमारे विधि का उपयोग कर रहे हैं. इन गुणों के साथ, CVMI वयस्क zebrafish मस्तिष्क में अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए एक त्वरित और आसान परख होना साबित करता है, और तेजी से जांच और कार्यात्मक विश्लेषण को खोलता है.

वयस्क zebrafish मस्तिष्क अनिवार्यता पूरी rostrocaudal अक्ष के साथ नए न्यूरॉन्स का उत्पादन कर सकते हैं और यह भी दर्दनाक चोटों के बाद पुनर्जीवित कर सकते हैं. इस सीमित न्यूरोजेनेसिस और अगर सब पर है, बल्कि गरीब पुनर्योजी क्षमता के साथ स्तनधारी दिमाग के विपरीत में है. इस तरह बड़े पैमाने पर स्टेम सेल गतिविधि और स्वस्थ हो जाना क्षमता वर्तमान में काफी हद तक अनजान हैं जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के उत्थान के लिए आवश्यक आणविक कार्यक्रम, समझने के लिए एक उपयोगी मॉडल जीव zebrafish बनाता है. इसलिए, ज़ी की पुनर्योजी योग्यता के आणविक आधार की जांचbrafish मस्तिष्क मछली और स्तनधारी दिमाग एक चोट के बाद प्रतिक्रिया, और मनुष्यों में भी पुनर्योजी चिकित्सा उपचार के लिए अवसर प्रदान करना कैसे मौलिक अंतर की व्याख्या हो सकती है कि अनुसंधान का एक दिलचस्प क्षेत्र है. वे तंत्रिकाजन्य पूर्वज 3,8,20 के रूप में हड्डीवाला मस्तिष्क plasticity और उत्थान के आणविक बुनियादी ढांचे को समझने के क्रम में, glial कोशिकाओं एक महत्वपूर्ण अनुसंधान के क्षेत्र के रूप में सेवा करते हैं. इस प्रकार, zebrafish के मस्तिष्क के रेडियल glial कोशिकाओं में जीन समारोह में परिवर्तन करने CVMI तकनीक का उपयोग elucidating में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है कैसे मछली मस्तिष्क कुशल वयस्क neurogenesis और पुनर्योजी प्रतिक्रिया के लिए जोड़े को पूर्वज गतिविधि कर सकते हैं. हमने हाल ही में वयस्क zebrafish मस्तिष्क 24,26,27 के पुनर्योजी neurogenesis के जवाब में कई कारकों और संकेत दे रास्ते की भागीदारी और आवश्यकता से पता चला है, और इन अध्ययनों CVMI विधि के प्रयोग से संभव बनाया गया. कुल मिलाकर, हम zebrafish के मस्तिष्क से हासिल ज्ञान regene लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैचोटों के लिए प्रतिक्रिया और इसलिए मानव मस्तिष्क संबंधी बीमारियों और गंभीर चोटों के लिए नैदानिक ​​उपचारों को डिजाइन करने में मदद मिलेगी कि स्तनधारी glial कोशिकाओं को rative क्षमता.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (SFB 655) और यूरोपीय संघ (ZF-स्वास्थ्य) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
CellTracker Red CMTPX Life Technologies, Invitrogen C34552 Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing the fish
Petri dishes Sarstedt 821,472 For handling the fish during injection and imaging
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056 As sterile dilution medium
Vivo morpholinos Gene Tools Inc. Customized More info on vivo morpholinos: www.gene-tools.com
Equipment
Barbed-end needle Becton-Dickinson 305178 To generate the incision in the skull
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer Part of the whole injection setup
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985 To snap off the tip of the glass capillary
Fluorescence camera Zeiss, Nikon, Leica Varies with the manufacturer To visualize the fluorescence after injection
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265 To hold the fish in position
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10 For microinjection
PicoNozzle kit (microinjector holder) World Precision Instruments 5430-12 For microinjection
Pneumatic PicoPump (microinjector) World Precision Instruments SYS-PV820 For microinjection
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG For illuminating the specimen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Morpholino oligonucleotides के Cerebroventricular Microinjection का प्रयोग वयस्क zebrafish मस्तिष्क में जीन एक्सप्रेशन के micromanipulation
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Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (75), e50415, doi:10.3791/50415 (2013).

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