Summary
In questo articolo, abbiamo dimostrato un metodo per la manipolazione dell'espressione genica nelle cellule ventricolari del telencefalo zebrafish adulto utilizzando oligonucleotidi antisenso morpholino. Presentiamo questo metodo come protocollo efficiente e rapido che può essere utilizzato per studi funzionali nel cervello dei vertebrati adulto.
Abstract
La manipolazione dell'espressione genica nei tessuti è necessaria per eseguire studi funzionali. In questo lavoro, abbiamo dimostrato la tecnica cerebroventricular microiniezione (CVMI) come mezzo per modulare l'espressione genica nel cervello zebrafish adulto. Utilizzando CVMI, le sostanze possono essere somministrate nel liquido cerebroventricular ed essere accuratamente distribuite lungo l'asse rostrocaudale del cervello. In particolare, ci concentriamo su l'uso di oligonucleotidi antisenso morpholino, che sono potenti strumenti per abbattere l'espressione genica in vivo. Nel nostro metodo, quando applicato, molecole morpholino vengono assorbiti dalle cellule che rivestono la superficie ventricolare. Queste cellule sono le cellule gliali radiali, che fungono da progenitori neurogena. Pertanto, abbattendo l'espressione genica nelle cellule gliali radiali è della massima importanza per analizzare la risposta di neurogenesi diffusa in zebrafish, e inoltre avrebbe fornito indizi su come i vertebrati potrebbero sostenere Neurogen adultorisposta ESIS. Tale comprensione aiuterebbe anche gli sforzi per le applicazioni cliniche in patologie neurodegenerative umane e la rigenerazione del sistema nervoso centrale. Così, vi presentiamo il metodo di microiniezione cerebroventricular come un modo rapido ed efficace per alterare l'espressione genica e la risposta neurogenesi nel cervello anteriore zebrafish adulto. Forniamo anche la risoluzione dei problemi e altre informazioni utili su come effettuare la procedura CVMI.
Introduction
Neurogenesi adulta è un tratto comune a vertebrati, tuttavia il suo grado di diffusione e di efficienza varia con la filogenesi 1,2,3,4,5,6. Per esempio, il cervello dei mammiferi adulti sono presenti regioni di cellule staminali in gran parte limitato al prosencefalo 7,8, mentre il pesce zebra teleosteo contiene sedici diversi domini di cellule staminali e zone neurogena associati in tutto il suo cervello 4,5,9,10. Questa variazione tra mammiferi e zebrafish potrebbe riflettere una disparità nei meccanismi di mantenimento delle cellule staminali e la capacità neurogena delle cellule progenitrici. La competenza per tutta la vita di zebrafish per produrre neuroni nel cervello potrebbe anche comportare conseguenze cliniche, come i meccanismi molecolari impiegati da zebrafish cervello potrebbero essere sfruttate per applicazioni terapeutiche per affrontare le malattie neurodegenerative nell'uomo.
Diverse cellule staminali zone del cervello zebrafish adulto sono stati analizzati ed è stato dimostrato che ilcellule che rivestono la superficie ventricolare di quelle regioni fungono da cellule progenitrici 9,11-20. Analisi dettagliate nel telencefalo zebrafish, per esempio, hanno identificato le cellule gliali radiali, che delineano la superficie ventricolare di questa regione del cervello per essere progenitori neurogena 19, 20. Questo vale per le altre regioni, come il cervelletto e il tetto ottico, dove ventricularly-trova cellule neuroepiteliale forniscono l'input neurogena 16,21. A tal fine, la comprensione dei meccanismi molecolari che regolano la diffusa competenza neurogena nel cervello adulto zebrafish richiede la manipolazione dell'espressione genica nelle cellule progenitrici.
Vari metodi sono stati descritti in precedenza per la funzione del gene modulante in zebrafish. Questi includono la generazione di linee transgeniche esprimenti varianti condizionali desiderati di una singola proteina, iniezioni focali plasmide basati accoppiati ad elettroporazione o trattamenti chimici. Abbiamo già progettato unmetodo per la somministrazione di varie sostanze tra cui morpholino oligonucleotidi o proteine nel cervello zebrafish adulti usando microiniezione cerebroventricular come un modo rapido ed efficiente della funzione genica modulando nelle cellule ventricolari dell'adulto zebrafish prosencefalo 22. Nei nostri studi, sono stati utilizzati in vivo Morpholinos causa della loro chimica coinvolge la molecola morfolino legato covalentemente ad arginina peptidi consegna ricche, che consentono consegna efficiente alle cellule di interesse, senza necessità di permeabilizzazione extra come elettroporazione 23. Ciò consentirebbe una Targeting approfondita del tessuto desiderato dopo l'iniezione, proprio come quello che abbiamo osservato in zebrafish adulto telencefalo 22. L'uso di Morpholinos vivo sono quindi superiore ai metodi già esistenti di tessuto di targeting come elettroporazione o iniezione focale di molecole di DNA.
Qui, dimostriamo visivamente come eseguire questa operazione e di fornire unprotocollo step-by-step. Iniziamo con spiegare la preparazione della miscela di iniezione e il pesce da iniettare, e procedere dimostrando come l'apparato di iniezione è impostato. Forniamo una descrizione del metodo di iniezione cerebroventricular, che comporta la generazione di una incisione nel cranio e l'iniezione dei Morpholinos utilizzando microinjector. Noi elaboriamo anche sui punti critici si ha la necessità di essere prudenti durante l'intera procedura da loro affermando come l'ottimizzazione o guide risoluzione dei problemi.
Protocol
1. Preparazione della miscela Iniezione
- Utilizzare Morpholinos vivo come cellule li interiorizzano in modo più efficiente rispetto ai normali molecole morpholino. Vedere le informazioni del produttore per i dettagli (Tabella 1: Reagenti e materiali).
- Utilizzare un colorante fluorescente tracciamento (es. CellTracker Rosso CMTPX, Invitrogen) per visualizzare la precisione dell'iniezione. Questo colorante è metabolizzato nella cella e diventa fluorescente soltanto nella cella dopo l'assorbimento. Pertanto, questo passaggio è essenziale per determinare le cellule che sono efficientemente mira dal microiniezione cerebroventricular.
- Preparare tampone fosfato salino (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM di Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH: 7,4) per diluire la soluzione morfolino. Se è richiesta una diluizione della soluzione morfolino, utilizzare sempre PBS.
- Preparare 10 microlitri della miscela di iniezione aggiungendo 9 microlitri della soluzione morfolino e 1 ml di secoloe cellule inseguitore colorante (diluito o non diluito la concentrazione il punto della soluzione morfolino è di 500 micron nostri risultati precedenti 22 indicano che diverse dosi diverse del morpholino -.. che vanno da 50 micron a 500 micron - Risultato in diversi livelli di atterramento da un efficiente atterramento di fenotipi hypomorphic). 1 ml di soluzione è sufficiente per l'iniezione in un cervello zebrafish.
- Mescolare bene e conservare a temperatura ambiente fino a quando l'iniezione.
2. Preparazione del dispositivo di iniezione
- Preparare il vetro iniezione capillari con un estrattore ago. Utilizzare i seguenti parametri: valore del ciclo di riscaldamento: 463, tirando valore di ciclo: 230, velocità: 1,5 sec, tempo: 75 msec.
- Accendere la fonte di pressione e regolare le impostazioni di pressione a 50 psi o 3,5 bar.
- Regolare le impostazioni microinjector come segue: tenere la pressione di 20 psi, pressione di espulsione 10 psi, valore di periodo di 2,5 e 100 msec di gating.
- Giraresull'anello illuminatore e individuare l'anello sopra il palco microscopio.
- Posizionare il supporto capillare in una posizione appropriata accanto al microscopio.
- Inserire il capillare di vetro nel supporto. Regolare l'angolo di iniezione a 45 gradi.
- Snap off la punta del capillare di vetro usando un fine-end pinza e calibrare la pressione di uscita dall'orifizio. Questo deve essere testato immergendo la punta dell'ago in acqua pesce e dando un impulso di pressione continua. Le bolle d'aria risultanti devono essere solo una riga, che è un'indicazione della pressione ottimale / dimensione dell'orifizio. Si prega di vedere il video di dimostrazione di questa calibrazione.
- Caricare il capillare di vetro con la soluzione di iniezione senza intrappolare bolle d'aria.
- Applicare pressione per rimuovere l'aria tra la punta del capillare di vetro e la soluzione iniettabile caricato.
3. Anestesia
- Preparare la soluzione di riserva degli anestetici (0,1% MESAB - etil-m-aminobenzoate Metansolfonato).
- Rimuovere il numero desiderato di pesci dai loro carri armati nelle gabbie del mouse di plastica o in altri contenitori di trasporto con sufficiente quantità di acqua.
- Preparare la soluzione di anestesia in una piccola scatola di plastica mescolando 200 ml di acqua di pesce con 5 ml di soluzione madre di anestetici. Concentrazione finale del anestetici: 0,0025% (v / v).
- Riempire a metà un piatto di plastica Petri con anestetici. Utilizzare questo piatto per preparazioni iniettabili.
- Incubare il pesce negli anestetici fino agli soggioga pesce.
4. Incisione e microiniezione Cerebroventricular
- Togliere il pesce dalla scatola con una rete di pesce e metterlo nel piatto di Petri.
- Premere delicatamente il pesce con il forcipe e orientare la testa in un modo che si inclina leggermente verso il basso. Ciò faciliterà l'incisione.
- Generare una piccola fessura sul cranio con un 30 gauge spinato-end. Usare solo la punta di un ago e non penetrano più disufficiente nel cervello ciò causerebbe danni al tessuto cerebrale e si manifesterà come sanguinamento.
- Continua a tenere il pesce e inserire la punta di un capillare di vetro attraverso il sito di incisione.
- Orientare la punta del capillare di vetro verso il telencefalo. Evitare di toccare il tessuto cerebrale come questo crea danno tissutale e impedisce anche la dispersione della soluzione iniettata.
- Iniettare la soluzione. Il liquido disperde immediatamente dopo l'iniezione.
5. Recupero e l'analisi dei iniezione Precisione
- Togliere il pesce dalla configurazione di iniezione e posto in una scatola di plastica con acqua di pesce fresco.
- Consentire il recupero.
- Re-anestetizzare il pesce con 0,0025% MESAB brevemente e controllare il pesce sotto il microscopio a fluorescenza. Una dispersione approfondita di fluorescenza rossa è un'indicazione di ampia diffusione del liquido iniettato.
- Mettete il pesce alla scatola di plastica.
- Collegare la scatola di plastica per tegli sistema di circolazione per ossigenare il pesce e mantenere per lunghi periodi di tempo.
- Utilizzare i pesci per scopi desiderati come analisi comportamentali o sacrificare gli animali nei punti di tempo desiderato dopo l'iniezione per preparare campioni di tessuto per ulteriori analisi (colorazioni istologiche, immunoistochimica, ecc.) I riferimenti seguenti forniscono esempi di come analizzare l'adulto zebrafish cervello: 9,11,17-20,24-27. Il miglior tempo di osservare un atterramento efficiente (più del 50% atterramento) è stato 12 ore nei nostri studi 22.
6. Controlli scientifici consigliati
- Utilizzare un disallineamento morfolino molecola che non dovrebbe causare alcun fenotipo come controllo negativo. Utilizzare una molecola morpholino standard o specificamente di progettazione controlli morpholino per ogni gene di interesse. Inoltre, utilizzare il solvente (in questo caso PBS) come ulteriore controllo negativo per valutare gli effetti o tossicità non specifici del mismoatch / controllare iniezioni morpholino.
- Utilizzare PCNA Morpholinos precedentemente descritto 22 come controlli positivi. Questo morpholino provoca atterramento efficace nel cervello zebrafish adulto (75-95% di efficienza atterramento entro 1 giorno di iniezione) 22.
Representative Results
Microiniezione Cerebroventricular porta ad un'ampia distribuzione della soluzione iniettata
Utilizzando lo schema di flusso di lavoro e tecnica della microiniezione cerebroventricular illustrato nella figura 1, abbiamo somministrato morfolino oligonucleotidi nel cervello zebrafish adulto. Un protocollo di iniezione accurato fa disperdere il liquido iniettato in tutto il cervello ed efficiente il targeting delle cellule vicine alla superficie ventricolare (Figura 2A). Iniezioni dove il vetro capillare infilza il tessuto cerebrale avrà un segnale fluorescente denso nel punto di iniezione (Figura 2B). Se la quantità iniettata non è sufficiente, si osserverà segnale fluorescente debole (Figura 2C).
Microiniezione Cerebroventricular può essere utilizzato per abbattere l'espressione genica a regione ventricolare del cervello adulto zebrafish
Abbiamo dimostrato thin vivo Morpholinos può penetrare alcuni diametri delle celle all'interno della superficie ventricolare e quindi può efficientemente bersaglio le cellule ventricolari (Figure 3A, 3B). Iniezione morfolino can espressione genica smontabile come allevierà la produzione della proteina corrispondente (un esempio è PCNA come mostrato nelle figure 3C, 3D). Abbiamo precedentemente dimostrato che abbattendo i geni che utilizzano questa tecnica porta a conseguenze funzionali durante la neurogenesi adulta (figure 3E, 3F) o di risposta rigenerazione (Figure 3G, 3H). Abbiamo dimostrato che la gamma knockdown efficiente (più del 50% atterramento) viene raggiunto approssimativamente 12 ore dopo l'iniezione del Morpholinos 22. Abbiamo anche osservato che il periodo atterramento efficiente è fino a circa 5 giorni dopo l'iniezione per la proteina PCNA 22. Più del 70% knockdown era visto entro 3 giorni dopo l'iniezione 22. Le curve knockdown sono dipendenti on il livello di espressione delle proteine endogene e l'efficienza delle molecole morfolino, e deve essere determinato per ogni gene dallo sperimentatore. Nei nostri studi, non abbiamo visto che la procedura CVMI compromette la sopravvivenza dell'animale, probabilmente perché l'amministrazione delle molecole morpholino è locale e non provoca una tossicità sistemica.
Figura 1. Rappresentazione schematica della tecnica di iniezione cerebroventricular. (A) L'iniezione è eseguita dalla dorsale del zebrafish adulti (1) a livello del tetto ottico (ot, 2). L'incisione viene fatta sulla piastra cranio tectal ottica con un ago da 30 gauge (3). Usando vetro capillari, le molecole morpholino sono iniettati nel liquido ventricolare (4). Una dispersione è una approfonditachieved istantaneamente (5). (B) La cannula ed il suo spinato-end è mostrato in alto ingrandimento. (C) La posizione del l'ago prima dell'incisione. (D) L'incisione viene cerchiato e delineato da linee tratteggiate. (E) L'iniezione capillare si trova come mostrato e viene eseguita l'iniezione. Tutti i pannelli sono stati adattati dal rif. 22. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Confronto di efficienza dell'iniezione e precisione. (A) Una buona iniezione conduce il targeting delle cellule vicine alla superficie ventricolare. (B) Se il vetro capillare viene inserito nel tessuto cerebrale, questo genererà un segnale di fluorescenza in posizione centrale. (C
Figura 3. . Morpholino penetrazione, l'efficienza di atterramenti geniche e le conseguenze funzionali (A) GFP immunoistochimica sulle sezioni trasversali telencefalici di controllo morpholino-iniettati Tg (H2A: GFP) linea transgenica che mostra nuclei GFP-positive. (B) GFP immunoistochimica sulle sezioni trasversali telencefalici di GFP antisenso morpholino-iniettato Tg (H2A: GFP) linea transgenica che mostra nuclei GFP-positive. Notare la differenza nel segnale-GFP in corrispondenza della zona ventricolare. v: ventricolo. (C) PCNA immunoistochimica sul controllo morpholino-iniettato cervello mostrano capillare distribuzione delle cellule PCNA-positivi. (
Discussion
Il metodo che descriviamo qui permette l'amministrazione facile e rapida Morpholinos nel cervello zebrafish adulto. Abbiamo dimostrato che il nostro metodo di iniezione blocca efficacemente l'espressione genica nelle cellule ventricolari e comporta conseguenze funzionali nella risposta neurogenesi.
Ci sono punti importanti da essere cauti durante l'esecuzione della microiniezione cerebroventricular. Per esempio, l'effetto delle molecole morpholino dipende dalla concentrazione usata. Questa concentrazione deve essere determinata dal finale. Si consiglia di iniziare con la soluzione di riserva (500 micron) e l'esecuzione di diluizioni seriali, e idealmente a pre-test per iniezione in embrioni utilizzando standard di embrione iniezione protocolli 28-30. In precedenza, abbiamo ottenuto diversi livelli di efficienza knockdown con concentrazioni di Morpholinos vanno da 50 micron a 500 micron 22. Secondo, l'orifizio del vetro capillare non deve essere large come questo porterà ad ampio afflusso di liquido nel cervello dopo l'iniezione. Analogamente, l'apertura non deve essere troppo stretto in modo da evitare l'iniezione adeguato. Si può determinare la combinazione ottimale orifizio-pressione di pompaggio di aria in una piastra di Petri con acqua. Le bolle derivanti dovrebbero essere in una singola riga ma non in più righe. Dimostriamo questo nel video. Terzo, incubando i pesci nelle anestetici è critica. Il pesce non deve essere tenuto più di 2 min negli anestetici. Ciò ostacolerà il tasso di recupero dopo l'iniezione. In quarto luogo, la posizione dell'incisione è critica per disperdere completamente il liquido iniettato. La regione ventricolare sopra il tetto ottico è maggiore al di sopra della linea mediana e si restringe lateralmente. Pertanto, lo sperimentatore dovrebbe generare la fenditura nel cranio vicino alla linea mediana e appena caudalmente alla piastra cranio copre la regione telencefalico.
Uno dei vantaggi del injectio cerebroventricularn metodo (CVMI) è il suo rapidness. CVMI è un metodo rapido per saggiare la funzione del gene. Questa caratteristica è importante e utile quando rispetto alla generazione di linee transgeniche per studi funzionali, che generalmente necessari diversi mesi. Ulteriormente, CVMI porta ad una distribuzione uniforme del liquido iniettato e quindi fornisce una manipolazione relativamente approfondita di attività genica, rispetto alle iniezioni focali o elettroporazione. Con CVMI, più geni possono essere abbattuti contemporaneamente preparando iniezione miscele contenenti più Morpholinos oligonucleotide. CVMI può essere utilizzato per iniettare concentrazioni diverse di una data oligonucleotidi morfolino, e quindi può essere utilizzato per analizzare fenotipi hypomorphic. Infine, questo paradigma iniezione non provoca tossicità o comprometta la sopravvivenza degli animali.
La tecnica CVMI potrebbe essere esteso per altri tipi di studi come l'iniezione di peptidi modulatori, droghe, DNA plasmidico o modulatorio RNA molecules o altre sostanze che potrebbero influenzare la fisiologia delle cellule. Saggio combinazione di molecole e di effettuare analisi dose-risposta sono possibili utilizzando il nostro metodo, che consente lo studio fenotipi hypomorphic. Con queste proprietà, CVMI dimostra di essere un saggio rapido e facile per studi di espressione nel cervello adulto zebrafish, e apre screening rapido e analisi funzionali.
Il cervello zebrafish adulto può costitutivamente produrre nuovi neuroni lungo l'intero asse rostrocaudale e può anche rigenerarsi dopo lesioni traumatiche. Questo è in netto contrasto con il cervello dei mammiferi con neurogenesi limitato e se non del tutto, piuttosto scarsa capacità rigenerativa. Tale diffusa attività di cellule staminali e la capacità di recupero rende zebrafish un organismo modello utile per comprendere i programmi molecolari necessari per la rigenerazione del sistema nervoso centrale, che sono attualmente in gran parte sconosciute. Pertanto, indagare le basi molecolari della attitudine rigenerativa di zebrafish cervello è un interessante ambito di ricerca che potrebbe spiegare la differenza fondamentale come pesci e mammiferi cervello reagiscono dopo un infortunio, e di dotare anche strade per terapie mediche rigenerative in esseri umani. Per comprendere l'infrastruttura molecolari della plasticità del cervello dei vertebrati e la rigenerazione, le cellule gliali servono come un'area di ricerca importante come sono i progenitori neurogena 3,8,20. Così, usando la tecnica CVMI di alterare la funzione del gene nelle cellule gliali radiali del cervello zebrafish è strumentale a spiegare come il cervello dei pesci può paio attività progenitore di efficiente neurogenesi adulta e risposta rigenerativa. Recentemente abbiamo dimostrato il coinvolgimento e la necessità di diversi fattori e le vie di segnalazione nella risposta rigenerativa neurogenesi dell'adulto zebrafish cervello 24,26,27, e questi studi sono stati resi possibili con l'uso di metodo CVMI. Nel complesso, la conoscenza che acquisiamo da zebrafish cervello potrebbe essere sfruttata per imporre la rigenerazionecapacità figurativo alle cellule gliali mammiferi che reagiscono a lesioni e sarà quindi aiutare la progettazione di terapie cliniche per le malattie neurologiche umane e lesioni acute.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) e l'Unione europea (Zf-Sanità).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| CellTracker Red CMTPX | Life Technologies, Invitrogen | C34552 | Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy |
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing the fish |
| Petri dishes | Sarstedt | 821,472 | For handling the fish during injection and imaging |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | As sterile dilution medium |
| Vivo morpholinos | Gene Tools Inc. | Customized | More info on vivo morpholinos: www.gene-tools.com |
| Equipment | |||
| Barbed-end needle | Becton-Dickinson | 305178 | To generate the incision in the skull |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | To snap off the tip of the glass capillary |
| Fluorescence camera | Zeiss, Nikon, Leica | Varies with the manufacturer | To visualize the fluorescence after injection |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | To hold the fish in position |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | For microinjection |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjection |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjection |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | For illuminating the specimen |
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