Summary
يوصف التصوير التنمية الدماغية في الزرد اليرقات. كما يتم توفير التقنيات اللازمة لتسهيل 3D التصوير وتعديل وضع الدماغية باستخدام العلاجات الكيميائية.
Abstract
الزرد هي أداة قوية لدراسة البيولوجيا التطورية وعلم الأمراض في الجسم الحي. حجم صغير والشفافية النسبية للأجنة الزرد جعلها مفيدة بشكل خاص لفحص البصري للعمليات مثل القلب والأوعية الدموية التنمية. في العديد من الدراسات الحديثة تم استخدام الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن EGFP في الخلايا البطانية في الأوعية الدموية لصورة وتحليل شبكات الأوعية الدموية المعقدة في الدماغ والشبكية، وذلك باستخدام متحد البؤر المجهري. وتقدم وصفا للتحضير، وعلاج الأجنة الزرد الصورة التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر المعززة (EGFP)، ومن ثم توليد الاداءات 3D شاملة للنظام الدماغية. وتشمل بروتوكولات علاج الأجنة، والتصوير متحد البؤر، وبروتوكولات التثبيت التي تحفظ EGFP مضان. علاوة على ذلك، يتم توفير النصائح المفيدة حول كيفية الحصول على صور عالية الجودة من الهياكل الدماغية، مثل إزالة العين دون تلف الأنسجة العصبية في مكان قريب. المزالق المحتملةمع التصوير متحد البؤر وتناقش، جنبا إلى جنب مع الخطوات اللازمة لتوليد اعادة البناء 3D من مداخن صورة متحد البؤر باستخدام متاحة بحرية البرمجيات مفتوحة المصدر.
Introduction
الزرد توفير نظام قوي لدراسة البيولوجيا التطورية، والشفافية النسبية للأجنة التي هي قابلة للدراسات القائم على التصوير 1. وقد تم الآن استخدام الزرد كنموذج للتنمية الفقاريات على مدى عقود. Teleosts، بما في ذلك الزرد، لديها نظام الأوعية الدموية الفقارية مبسطة التي لا يوجد لديه homolog معقولة في اللافقاريات. يتم ضخ الدم من الغرفة الأمامية من حجرات القلب يومين من خلال الخياشيم، حيث يتم الاوكسيجين ذلك. الدم من الخياشيم يتقاطع في الشريان الأبهر الظهري ويمر عبر الشرايين التي تتفرع إلى سفن أصغر وأصغر، في نهاية المطاف التوصل إلى الشعيرات الدموية في أنسجة الجهاز. داخل الشعيرات الدموية الأكسجين يتم تحريرها ويتم امتصاص ثاني أكسيد الكربون. على الجانب الوريدي من الشعيرات الدموية تدفق الدم إلى الأوردة أكبر وأكبر ويوجه أخيرا في الغرفة الخلفية من القلب، حيث يكرر دورة.
والزرد الكبار يمكن أن تضع 200 بيضة أو أكثر في وقت واحد، وانسه المخصبة، فإنها تتطور بسرعة 2. خلال يوم واحد محور الجسم ومتطورة، بما في ذلك عضلات هذا العقد ونقل الجنين داخل الغشاء حول المشيمي. من 2-7 أيام بعد الإخصاب (DPF) معظم أجهزة الجسم تطوير، بما في ذلك العينين والجهاز العصبي المركزي التي يمكن أن تنسق السباحة نحو الطعام أو بعيدا عن الضوء الساطع. تصل إلى 7 أجنة DPF هي صغيرة بما يكفي للسماح التصور مع المجهري. خطوط المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية يمكن تصوير مع مبائر أو مضان المجهري. يمكن إقران التصوير متحد البؤر مع برمجيات المصدر المفتوح 3 لإنشاء الاداءات 3D هياكل الأوعية الدموية كاملة في الأجنة الزرد التي توفر منظور بيولوجيا الأنظمة من تطوير الأوعية الدموية. والدراسات المعنية مع التغيرات في تعقيد الأوعية الدموية والدماغية تستفيد من هذا البروتوكول لأنها تسمح لإجراء تحليل مستوى أنظمة شبكات الأوعية الدموية 4،5. تجميع للطرق وتوفير المواردد للسماح لسهولة اعتماد وهذه التقنيات للدراسات التي تتطلب التصوير هياكل الأوعية الدموية في الزرد الجنينية. كفاءة التكلفة من الزرد كنموذج للحيوانات يتم الجمع بين تقنيات التصوير الناشئة لتوفير منصات جديدة تستخدمها لتقييم آثار عائية من المسارات الجزيئية في التنمية الفقاريات والتوازن.
Protocol
1. الزرد تربية وتوليد الأجنة، والعلاج
- إجراء البروتوكولات التالية الزرد تحت إشراف لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (IACUC) وضمن المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من المعاهد الوطنية للصحة أو الهيئات الأخرى / المبادئ التوجيهية التنظيمية.
- وتتوفر من مركز الزرد الدولية الموارد (ZIRC) سلالات الزرد التي تعبر عن البروتينات الفلورية في أنسجة معينة، والخلايا، أو الأجهزة. على سبيل المثال، تيراغرام (KDR: EGPF) s843 التعبير عن EGFP في الخلايا البطانية الوعائية 6، والتي يمكن استخدامها لإنتاج الهياكل الأوعية الدموية 3D كاملة كما هو موضح في هذا البروتوكول. خطوط أخرى من الزرد المعدلة وراثيا المتوفرة من ZIRC.
- بيت الزرد الكبار في نظام تربية الأحياء المائية المناسبة التي تراقب درجة الحموضة، والملوحة، ودرجة الحرارة، الأوكسجين المذاب، والضوء، والعوامل البيئية الأخرى 7. وتم إيواء الزرد هو موضح هنا في نظام Aquaneering شركة (سان دييغو، كاليفورنيا) في 28.5 درجة مئوية مع الممتاز 14 ساعةht/10 ساعة دورة الظلام. إطعام الزرد الكبار اتباع نظام غذائي متوازن من الأرتيميا وإدارة الجنسية والإقامة 4/6 علف الأسماك (الماء المالح الروبيان المباشر، أوجدن، يوتا).
- وينبغي أن يضم الذكور البالغين والزرد الإناث في سن تربية منفصل لزيادة نجاح التزاوج.
- تحفيز وضع البيض والإخصاب عن طريق وضع الإناث (2-4) والذكور (4-6) معا في وعاء يحتوي على التزاوج أسفل يتناغم مع ثقوب كبيرة بما يكفي للبيض في الانخفاض خلال، ولكن صغيرة جدا بالنسبة للبالغين الزرد لتمرير . إعداد التزاوج المساء قبل؛ وضعت البيض قرب الفجر، وعادة في حين أن ضوء النهار دورة يزيد ببطء في شدة (الفجر). التحقق من وجود البيض في أسفل الحاوية التزاوج كل 15-30 دقيقة.
- جمع البيض باستخدام مصفاة شبكة ونظيفة مع العازلة E3 (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 مم CaCl 2، 0.33 ملي MgSO 4). نقل البيض إلى 100 لوحات ثقافة ملم مليئة E3 العازلة وتخزينها في الحاضنة 28 درجة مئوية.
- لدراسة المواد الكيميائية التي تغير السرطانebrovascular المتفرعة إضافة التركيزات الكيميائية المرجوة. على سبيل المثال يمكن أن يتسبب المتفرعة neovasular مع γ-secretase المانع (GSI IX/DAPT/N- [N-(3،5-Difluorophenacetyl-L-ألانيل)]-S-phenylglycinet بوتيل استر) solubilized في DMSO 4، ابتداء من 24 آخر ساعة الإخصاب (HPF). في ذلك الوقت نقطة الأجنة لا تزال داخل المشيمه، ويمكن أن العديد من المواد الكيميائية تمر عبره 8. إذا شرط المعاملة لديه العصبية الحركية أو الآثار التي قد تضعف قدرة الأجنة للتحرر من المشيمه، ثم الأجنة يجب إزالة chorionated بين 24 و 48 HPF، والتي يمكن أن يتم ذلك إما مع ملقط من pronase 2. تم dechorionated الأجنة هو مبين في الصور المقدمة عن طريق الاستيلاء بلطف المشيماء مع اثنين من ملقط شحذ وتمزق مفتوحا.
- إذا لزم الأمر / المطلوب، تشكيل الصباغ يمكن تثبيط بإضافة 0.003٪ N-الفنيل (PTU) إلى المخزن المؤقت E3 في 24 HPF.
2. التصوير متحد البؤر الدماغية من البنيةالقوام ثابت في الزرد الأجنة
- التضحية الأجنة في 250 ملغ / لتر تريكين methanesulfonate، ومن ثم اصلاحها عن طريق الغمر في 2-4٪ بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. حاويات مع الأجنة الفلورسنت ينبغي أن تكون ملفوفة في احباط. مرة واحدة ثابتة، ويجب أن يتم تخزين الأجنة في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى تصوير - EGFP يصبح أقل كثافة مضان حلها بعد نحو أسبوع، ولكن يتم الاحتفاظ مورفولوجيا (كما تراه في حقل مشرق) أطول بكثير.
- إعداد لتركيب الجنين عن طريق إزالة عين واحدة أولا باستخدام إبرة التنغستن شحذ. قطع حول الأنسجة التي تربط العين الأولى ثم قطع العضلات، وأخيرا قطع العصب البصري لتهجير العين. (ملاحظة: إذا كان التصوير إزالة كلا الجانبين هو المطلوب كلتا العينين.)
- بمجرد إزالة العين، جبل الجنين على ساترة باستخدام قطرة من 3٪ ميثيل. توجيه الجنين بحيث الجانب بالعين إزالتها تواجه ساترة وأقرب إلى الزجاج ممكن. تغطية الجنين كامل مع methylcellulose لمنع جفاف أثناء التصوير.
- صورة الجنين شنت على الفور باستخدام المجهر متحد البؤر مقلوب مجهزة عالية الجودة الهدف 20X خطة آبو (الفتحة العددية = 0.75 أو أفضل). هذا التكوين هو الأفضل المجهر غير مقلوب التي من شأنها أن تتطلب يقحم الجنين بين طائرتين الزجاج، والضغط على الجنين على الزجاج العلوي.
- جمع شرائح الضوئية في 1 ميكرون الزيادات باستخدام إعداد فتحة متوسطة أو كبيرة. يمكن أيضا خطوات أكبر من 2.5 ميكرون يمكن استخدامها، ولكن قد يكون أكثر صعوبة لتحديد الترتيب المكاني للكائنات أصغر. فتحات صغيرة تنتج أكثر وضوحا من التفصيل، ولكن بالاشعة تعد مطلوبة قد تبييض EGFP ويحد أيضا من عمق التصوير في الجنين التي يمكن تحقيقها. A المجهر متحد البؤر يسمح للتصوير حوالي نصف الطريق من خلال الجنين.
- إذا كان المطلوب تصوير السمك كله، وإزالة كلتا العينين في البداية (انظر ملاحظة في الخطوة 3.2)، وتناوب على الجنين بعد تخيلز جانب واحد وكرر الخطوات من 2،3-2،5 عن الجانب المقابل.
3. إعادة الإعمار 3D الجنينية الزرد Cerebrovasculature
- استخدام توزيع فيجي 3 من يماغيج مفتوحة المصدر (http://fiji.sc)، الذي هو الأمثل لالاداءات 3D، مجانا، ومتوافقة مع جهاز الكمبيوتر، لينكس وماك أجهزة الكمبيوتر.
- استيراد مداخن مبائر إلى فيجي عن طريق الذهاب إلى الإضافات> الامكنه> BioFormats المستورد 9 ثم حدد الملف متحد البؤر، مثل name.ids للمداخن نيكون (الشكل 2A). حدد عرض مكدس مع وضع Hyperstack، اللون: الرمادي، والتحقق autoscale، تحقق قنوات الانقسام.
- وهذه التحديدات فتح أربع لوحات قناة منفصلة؛ لEGFP سوف تكون هناك حاجة واحدة فقط، وعادة ثالث واحد لأسفل. إغلاق الألواح الثلاثة الأخرى (الأحمر والأزرق وألفا) وترك الصورة 16 بت مع اسم طويل تليها C = 1 (الشكل 2A).
- ضبط عتبة عن طريق المسح الضوئي على الرغم من أن الصورة باستخدام التمرير تاب على طول الجزء السفلي للعثور على شريحة لديها المنطقة أو بنية الفائدة، ثم انتقل إلى صورة> ضبط> عتبة (الشكل 2C).
- في لوحة أن يأتي، حرك الشريط العلوي (مستوى الأسود) إلى اليسار بحيث يمكن رؤية الهيكل تماما على الخلفية، وترك الشريحة السفلي (مستوى أبيض) حيث هو (الشكل 2D). حدد B & W، حدد الخلفية المظلمة. لم تقم بتحديد عتبة حساب لكل صورة ما لم يتم إجراء تعديلات مختلفة لكل شريحة، حدد خلفية سوداء. هذه العملية يخلق صورة جديدة من 8 بت.
- تحذير: عتبة لا يمكن التراجع أو حفظها في ImageJ، وبالتالي فإن كومة متحد البؤر يجب أن تكون إعادة تحميل كل مرة هناك حاجة إلى التغيير. كتابة الأرقام ومحاولة إعدادات مختلفة حتى يتم تحقيق النتيجة المرجوة.
- انتقل إلى الإضافات> عارض 3D> عتبة 0، اختزال عامل 1 (الأفضل) أو 2 (جيد)، قم بإلغاء تحديد خانات اللون الأحمر والأزرق لجعل الانتاج 3D الخضراء - وإلا فإنه وايليرة لبنانية تنتج تقديم البيضاء - حدد تطبيق (لا تلقائي) (الشكل 2E).
- تدوير، وتدور وتكبير صورة 3D باستخدام الماوس والضوابط لوحة المفاتيح (الشكل 2F).
- حفظ الصور الثابتة في أي لحظة باستخدام الخيار الالتقاط في القائمة. حجم مربع الصورة على الشاشة يملي أبعاد بكسل من الصورة أنتجت حتى إذا كان المطلوب على صورة عالية الدقة جعل مربع أكبر عن طريق سحب الركن الأيمن السفلي.
- إنشاء فيلم 3D الغزل عن طريق اختيار عرض> سجل 360 درجة دوران (الشكل 2G). التخلف التناوب إلى 2 درجة لكل خطوة، ولكن يمكن أن تتغير إلى 5 درجات على سبيل المثال، والتي من شأنها خلق أحجام ملف أصغر من ذلك بكثير، ولكن قد تضيف الاهتزاز إلى الرسوم المتحركة.
- حفظ الملف في واحدة من العديد من الأشكال المتاحة لمشاهدتها لاحقا مع لاعبين وسائل الإعلام، وتحميلها على شبكة الإنترنت، أو استخدام في العروض التقديمية. المصدر المفتوح وسائل الاعلام لاعب، VLC ( حزب التحريرن :/ / www.videolan.org / VLC / index.html و)، هو مجانا ويعالج أشرطة الفيديو هذه بشكل جيد للغاية.
Representative Results
إعادة الإعمار 3D هياكل الأوعية الدموية يوفر منظور شامل وبصريا للاهتمام التنمية الزرد. أرقام أساليب 1 و 2 تظهر لأنها عادة القيام به. ويبين الشكل 3 عدة زوايا هياكل الأوعية الدموية في 6 DPF الجنين الزرد أن أعرب EGFP في الخلايا البطانية. مع اللون الأخضر أو الأبيض الصلبة يمكن أن يكون من الصعب أن نقدر كثافة إشارة؛ الزائفة التلوين توفير كثافة صورة من الجدول نظرة المتابعة ويسمح أفضل عمق التصور عندما تتداخل الهياكل. مثال على شبه الملونة صورة 3D من الأوعية الدموية في 6 DPF يتم توفير الزرد في الشكل 4. يمكن استخدامها الإسفار التصوير الأجنة الحية لدراسة الخصائص الفسيولوجية التي تشمل العين وحركة الجسم، ونشاط القلب. أرقام 3 و 4 وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها مع ممثل هذه الأساليب، وذلك باستخدام خط الزرد المعدلة وراثيا وصفها. القرار التصوير يعتمد على خصائص المجهر، ولكن سطوع إشارة EGFP كافية لجودة الصورة جيدة مع معظم الأنظمة التجارية. إعادة الإعمار وتقديم التمثيل 3D يتفق والخيارات في هذا البرنامج مفتوح المصدر تقديم نتائج جيدة باستمرار.
الشكل 1. إزالة العين. أ) الثابتة 3 DPF الجنين مع حاجة التنغستن وضعه بجانب العين. يتم قطع الأنسجة حول العين من هذا الموقف. B) العين هو يقع خارج ويتم قطع عضلات العين الأساسي والعصب البصري. يشار إلى محجر العين الفارغة مع دائرة متقطع. C) يتم تشغيل نفس الجنين أكثر ومزودة ميثيل السليلوز، مع العين سليمة مواجهة. hres.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. خطوة بخطوة إعادة الإعمار 3D من صورة كومة متحد البؤر. A) الملف المفتوح (4104.1.ids) محملة داخل فيجي باستخدام الإضافات> الامكنه> Bioformat لتحديد باء) بعد العثور على شريحة مع المنطقة من الفائدة، يتم تحديد عتبة التعديل كما هو مبين. C) يتم ضبط عتبة إلى 214 باستخدام أعلى يتم تحديد وتطبيق المنزلق. يسمى المشاهد D) 3D كما هو مبين. E) يظهر إعادة الإعمار 3D من الزرد مع العين سليمة، لتحديد اتجاهاتها. F) تم تصغيرها الصورة وتدويرها. G) A 360 درجة دوران الفيلم يتم كما هو مبين. res.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. وجهات نظر من إعادة الإعمار 3D. أ) المنظور الإنسي من 6 DPF الجنين تصويرها مع 10x الهدف والفم هو على حق، وليس الخياشيم داخل الفم. B) الجانبي من نفس الجنين، علما الزعنفة هو حلقة في الوسط. C) نفس الجنين المصورة مع 20x والهدف، منظور وسطي، علما القرار الخيشومية. D) المنظور الجانبي من 20x والتصوير الهدف. الزعنفة هو على الحافة اليمنى من لوحة. E) عرض انتيرو-20x وسطي من التصوير موضوعية، علما الخياشيم داخل الفم. F) بطن من نفس الجنين تصويرها مع 20x والهدف، فإنه الرأس إلى اليمين. ملاحظة الأوعية الدموية على الكيس المحي في أسفل اليمين.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الاختلافات في كثافة 6 DPF الجنين. صورة لإعادة الإعمار 6 DPF باستخدام نظرة متابعة الجدول pseudocolor لكثافة الإشارة. وصفت الفم والدماغ والخياشيم والكيس المحي لتحديد اتجاهاتها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. فيلم من الأوعية الدموية التي أعيد بناؤها في الزرد 4 DPF. تم تصويرها الأسماك عند 2.5 ميكرون. كانت الصورمن تصوير نصف الجنين. مقارنة مع الهياكل هياكل الأوعية الدموية في الزرد GSI المعاملة المنصوص عليها في الشكل 6. ملاحظة كثافة أقل من الأوعية الدموية في الرأس والخياشيم أكبر. (راجع "Zfish_spin.avi" ملف التكميلي تحت التحميل)
الرقم 6. فيلم 3D من الأوعية الدموية في جنين GSI المعاملة في 4 DPF. تم تصويرها الأسماك عند 2.5 ميكرون من خلال من الأفقي إلى خط الوسط. مقارنة هياكل الأوعية الدموية مع التحكم 4 DPF الأسماك هو مبين في الشكل 5. وتقوس الظهر وحجم أصغر هي نموذجية في الأجنة تعامل مع هذه المادة الكيميائية. (راجع "GSI-treated_4dpf_fish.avi" ملف التكميلي تحت التحميل)
Discussion
الأساليب المذكورة هنا توفير أساس للدراسات البصرية لنظام الأوعية الدموية في تطوير الزرد. عينات حية يمكن استخدامها لتقييم المعلمات الفسيولوجية، مثل معدل ضربات القلب والقلب حجم السكتة الدماغية، في حين عينات ثابتة يمكن استخدامها لعالية الدقة التصوير متحد البؤر. ذبابة الفاكهة وC. ايليجانس تسمح للتصوير الجسم كله، ولكن الزرد هي الفقاريات وتقدم نموذجا مفيدا للأنسجة الفقاريات، بما في ذلك نظام الأوعية الدموية مبطنة الخلايا البطانية. ويمكن لهذه الدراسات تتضمن خطوط المعدلة وراثيا كبيرا والموارد الجيني من مجتمع البحوث الزرد. إعادة الإعمار 3D وجعل من الصور متحد البؤر من الزرد الجنينية، كما هو موضح هنا، والسماح لنهج النظم لعلم الأحياء المتفرعة الأوعية الدموية والدم كثافة السفينة لم يكن ذلك ممكنا مع النماذج الحيوانية الكبيرة مثل الجرذان والفئران. كذلك، amniotes الزرد التطور في بيئة قابلة للتعديل (العازلة E3)، حيث يمكن للمرء بسهولة إضافة جhemicals التي تمنع إنزيمات معينة أو العمليات الأخرى التي تؤثر على التنمية الأوعية الدموية. تركيز وتوقيت التسليم الكيميائية يمكن تغييرها، مما يتيح للباحث ظروف العلاج لصقل.
1. التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
يمكن إدخال تعديلات على هذا النظام دمج خطوط المعدلة وراثيا من الزرد التي تعبر عن البروتينات الفلورية EGFP أو غيرها في مجموعة متنوعة من الأنسجة أو جهاز أو المنطقة أنماط محددة 10. علاوة على ذلك، تم مؤخرا نشر التوعية المستحدثة تحليل التغيرات في شبكية العين الزرد 5. مشاكل مع تصبغ في الأجنة الزرد الكبار في السن ويمكن تعويضها عن طريق عبور مع خطوط المعدلة وراثيا التي لا تنتج على نطاق وأصباغ أو صبغة الشبكية. مشاكل مع مضان تقلص ينتج عادة من ظروف غير ملائمة التثبيت. بارافورمالدهيد (4٪) لمدة 1 يوم هو الأمثل، ولكن قد مثبتات أقوى، مثل غلوتارالدهيد، رباعي أكسيد الأوزميوم أو الكحول،تدمير EGFP مضان. بعد التثبيت، يجب أن تبقى الأجنة في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية ومحمية دائما من أشعة الشمس المباشرة.
2. حدود هذه التقنية
جودة ودقة الأداءات 3D المنتجة مع هذا البروتوكول يعتمد على نوعية الصور ولدت. اختراق الضوء من خلال هذه الأجنة يقتصر على الطائرة منتصف السهمي باستخدام مجهر متحد البؤر القياسية. هذا الجانب من التصوير يحد من عمق التصوير في الأجنة الأكبر سنا والبالغين، ولكن أنظمة متعددة الفوتون المجهري أكثر تقدما تسمح للتصوير في أعماق أكبر.
3. أهمية فيما يتعلق بأساليب القائمة
يوفر هذا البروتوكول مدخلا لتحليل شبكات الأوعية الدموية على مستوى النظم التي يمكن أن تتضمن حيوان بأكمله. كثيرا ما يعتمد التمثيل في وقت سابق من هذه البيانات على مجموعة من الصور التي وضعت معا، ولكنها توفر 3D تقديم أفضل قرار من العالقات المكانيةtionships المعنية.
4. التطبيقات المستقبلية
والتطورات الجديدة في مجال التصوير ومعالجة الأنسجة توفير العديد من التطبيقات الجديدة لهذه الأساليب التي يمكن أن تتضمن الإدلاء الأجنة الأكبر سنا أو البالغين شفافة 11-14. سوف الشفافية المحسن زيادة كبيرة في اختراق الأنسجة بواسطة الليزر متحد البؤر ومتعددة الفوتون. أبعد من ذلك، لأن سرعة الكاميرات وأنابيب مضخم زيادة قد يكون من الممكن قريبا لإنتاج الاداءات 3D من الأسماك في الوقت الحقيقي، وتوفير البعد 4 عشر من التحليل.
5. خطوات حاسمة
خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو إعداد للتصوير، والذي يتضمن تثبيت المناسبة. وينبغي أن يتم التصوير في أقرب وقت ممكن بعد التثبيت مع أهداف الجودة العالية التي لديها أفضل فتحات الرقمية المتاحة. يعتمد القرار على نظام التصوير المستخدمة، وأنظمة الجودة عالية جدا عادة ما تكون أفضل. توليد الاداءات 3D هو الذاكرة المكثفةلذلك أجدد، أجهزة الكمبيوتر الراقية مع كمية كبيرة من الذاكرة ومعالجات رسومات جيدة ويوصى.
وقد تم تحسين نظام البيولوجيا البصرية الموصوفة هنا لالزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن EGFP في الخلايا البطانية في الأوعية الدموية، رغم أن هذه الأساليب يمكن أن تتكيف مع الأجنة وراثيا التي تعبر عن GFP، أو البروتينات الفلورية الأخرى، والسكان من الخلايا العصبية والعضلات والغدد أو أي عدد من الخلايا الأخرى. والميزة الرئيسية في العمل مع هذا النظام هو القدرة على دراسة ما يحدث في الجنين بأكمله في أي وقت خلال هذه الفترة التنموية، في الحيوانات ثابتة و / أو الحية.
Disclosures
ليس هناك شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
الكتاب أشكر أعضاء في الماضي والحاضر من مختبراتنا الذي ساعد في تطوير هذه التقنيات. التمويل الجزئي المقدمة للDE بمنحة من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي / CIRM (RN1-00538).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4 °C | |
| E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
| Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
| GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
| 24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
| Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipettes | |
| Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
| NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
| Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
| Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
| Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |
References
- Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , University of Oregon Press. (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-β plays a conserved role in angiogenesis. PLoS ONE. 7, (2012).
- Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. Amyloid-β increases capillary bed density in the adult zebrafish retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo. Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Opitz, R., et al. Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development. Dev Biol. 372, 203-216 (2012).
- Gleave, J. A., et al. Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging. Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy. Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. 68, e4272 (2012).
