Summary
幼虫ゼブラフィッシュにおける脳血管の開発の撮像が記載されている。 3Dイメージングを容易にし、化学的処理を用いて脳血管発達を改変するための技術も提供される。
Abstract
ゼブラフィッシュは、 生体内で発生生物学や病理学を研究するための強力なツールです。小型でゼブラフィッシュ胚の相対的な透明度は、心臓や血管の開発などのプロセスを視覚的に検査のために特に有用なものにする。いくつかの最近の研究で、血管内皮細胞におけるEGFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュが画像に使用し、共焦点顕微鏡を用いて、脳および網膜において複雑な血管網を分析する。説明は、準備処置および画像増強緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現するゼブラフィッシュ胚を、次いで脳血管系の総合的な3Dレンダリングを生成するために設けられている。プロトコルは、胚の治療、共焦点イメージング、EGFP蛍光を維持する固定プロトコルを含む。さらに、近くの神経組織にダメージを与えることなく、このような除去などの脳血管構造の高品質の画像、目の取得の有用なヒントが用意されています。潜在的な落とし穴共焦点イメージングでは、自由に利用できるオープンソースソフトウェアを用いた共焦点画像スタックからの3次元再構成を生成するために必要な手順に沿って、議論されている。
Introduction
ゼブラフィッシュは、発生生物学を研究するための強力なシステムを提供し、その胚の相対的な透明度は、画像ベースの研究1の影響を受けやすい。ゼブラフィッシュは今何十年脊椎動物の発生のモデルとして使用されている。ゼブラフィッシュを含む硬骨魚は、無脊椎動物には合理的なホモログを持たない単純化された脊椎動物の血管系を持っている。血液は、それが酸素化されたえら、を介して2つのチャンバ型の心臓の前房から汲み上げられる。鰓からの血液は背側大動脈に収束し、最終的に臓器組織中の毛細血管に到達し、より小さな血管に動脈をその枝を通過する。毛細血管酸素以内に放出され、二酸化炭素が吸収される。毛細管血の静脈側にますます大きな静脈に流れ、最終的にサイクルが繰り返される心臓の房に引き込まれる。
大人のゼブラフィッシュは、一度に200個以上の卵を産み、そしてONCできeは受精し、彼らはすぐに2を開発しています。 1日以内に、体軸は、その契約と絨毛膜の内側の周りの胚を動かす筋肉を含めて、十分に開発されている。 2-7日後に受精（DPF）からほとんどのボディシステムは、目や食べ物に向かって、または離れて明るい光から泳いで調整することができ、中枢神経系を含めて、開発しています。最大7のdpf胚は、顕微鏡による可視化を可能にするのに十分に小さい。蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック系統は、共焦点又は蛍光顕微鏡で画像化することができる。共焦点イメージングは、血管発生のシステム生物学の視点を提供するゼブラフィッシュ胚における完全な血管構造の3Dレンダリングを作成するためのオープンソースソフトウェア3とペアにすることができます。それが血管網4,5のシステムレベルの分析を可能にするので、血管や脳血管の複雑さの変化に関係する研究では、このプロトコルの恩恵を受ける。メソッドやリソースのコンパイルが提供され胚ゼブラフィッシュにおける血管構造の画像化を必要とする研究のために簡単に養子にし、これらの技術のようにするD。動物モデルとしてゼブラフィッシュのコスト効率は、脊椎動物の発生や恒常性の分子経路の血管新生効果を評価するとともに、新たなプラットフォームを提供するために、新たな画像処理技術と組み合わせている。
Protocol
1。ゼブラフィッシュ畜産、胚発生、治療
- 制度的動物管理使用委員会（IACUC）の指導の下で、NIHまたはその他の規制機関/ガイドラインの動物保護ガイドラインの範囲内で、以下のゼブラフィッシュのプロトコルを実施しています。
- 特定の組織、細胞、または器官内の蛍光タンパク質を発現するゼブラフィッシュの株は、ゼブラフィッシュ国際リソースセンター（ZIRC）から入手できます。例えば、Tgは（KDR：EGPF）は、このプロトコルに示されるように完全な3D血管構造を製造するために使用することができる血管内皮細胞6にEGFPを発現するS843。トランスジェニックゼブラフィッシュの他の行はZIRCから入手できます。
- pHは、塩分濃度、温度、溶存酸素、光、および他の環境要因7を監視し、適切な養殖システムの住宅の大人のゼブラフィッシュ。ここに示したゼブラフィッシュは、14時間営業のLIGと28.5℃でAquaneering株式会社システム（カリフォルニア州サンディエゴ）で飼育したht/10時間暗のサイクル。フィード大人のゼブラフィッシュブラインシュリンプとNRD 4月6日魚食（ブラインシュリンプ直接、オグデン、ユタ州）のバランスの取れた食事。
- 成人男性と繁殖可能年齢の女性のゼブラフィッシュは、交尾成功高めるために別々に収容する必要があります。
- ゼブラフィッシュ大人に合格するためには卵がフォールスルーするのは十分な大きさが、あまりにも小さな穴を持つメッシュボトムを持っている相手側の容器で一緒に（2-4）、女性を配置することにより、産卵と受精を刺激し、男性（4-6） 。前夜交配を設定;卵は昼間の光周期が徐々に強度（夜明け）に増加し、通常ながら、夜明け近くにレイアウトされている。すべての15〜30分、相手コンテナの底に卵を確認してください。
- E3バッファー（5のNaCl、0.17のKCl、0.33のCaCl 2、0.33 mMのMgSO 4）したメッシュストレーナーとクリーンを使って卵を収集します。 28℃のインキュベーター内のE3バッファとストアで満たされた100mm培養プレートに卵を移す。
- CERを変える化学物質を研究するために、所望の化学濃度を追加分岐ebrovascular。例えばneovasular分岐がγ-セクレターゼ阻害剤（GSI IX/DAPT/N- [N-（3,5 - Difluorophenacetyl-L-アラニル）]-S-phenylglycinet-ブチルエステル）で誘導することができる24を、初めにDMSO中で可溶化4時間後に受精（HPF）。その時点での胚は、絨毛膜の中に残っているし、多くの化学物質がその8を通過することができる。処理条件は、絨毛膜の自由になる胚の能力を損なうことがあり、神経や運動の効果がある場合、胚はプロナーゼ2のいずれかの鉗子を用いて行うことができる24〜48 HPF、の間で解除chorionatedする必要があります。提供された画像に示された胚を静かに2本の尖ったピンセットで絨毛をつかみ、それを開いた引き裂くことによって絨毛膜を除去した。
- 所望/必要に応じて、顔料の形成は24ゼブラにおけるE3緩衝液に0.003％N-フェニルチオ尿素（PTU）を添加することによって阻害することができる。
脳血管構造体の2。共焦点イメージング固定ゼブラフィッシュ胚におけるURES
- 250 mg / Lのトリカインメタンで胚を犠牲にしてから、2に浸漬することにより、それらを修正 - 4℃で一晩4％パラホルムアルデヒド蛍光胚を持つコンテナは、箔に包まれなければならない。画像化されるまで一度固定、胚は、4℃でPBS中に保存されるべきである - EGFP蛍光強度は約一週間後にあまり解決になりますが、形態は（明視野で見て）はるかに長く保持されます。
- 最初の尖ったタングステン針を用いて1の目を削除することによって胚をマウントするために準備します。筋肉を切断し、最終的には目を置換する視神経をカットまず目を結ぶ組織の周りにカット。 （注：両サイドを画像化することは、両眼を削除希望する場合。）
- 目が除去されると、3％のメチルセルロースのドロップを使ってカバーガラス上で胚をマウントします。オリエント胚削除された目のある側がカバーガラスに直面して、できるだけガラスに近くなるとなるよう。メチル全体胚をカバー撮像中に乾燥を防ぐためにlcellulose。
- 画像すぐに高品質20Xプランアポ目標（開口数= 0.75以上）を備えた倒立型共焦点顕微鏡を使用してマウント胚。この構成は、二つのガラス面間の胚を挟んで、上部ガラスに対して胚を押す必要とする非倒立顕微鏡に好適である。
- 中·大口径の設定を使用して1μm刻み光学スライスを収集します。 2.5μmの大きい工程を使用することもできるが、それは小さなオブジェクトの空間的順序を決定することはより困難であり得る。小さな開口部は、シャープなディテールを生産するが、必要な長いスキャンは、EGFPを漂白しても達成することができる胚にイメージングの深さを制限することがあります。共焦点顕微鏡は、胚を通じて半分程度イメージングを可能にします。
- 全体魚の撮影が必要な場合は、最初に両眼を削除する（ステップ3.2に注を参照）、イマジン後の胚を回転させる反対側のための2.5 - G 1側とを繰り返して、2.3を繰り返します。
胚ゼブラフィッシュ脳血管系の3。3次元再構成
- 3Dレンダリング、無料で、パソコン、MacおよびLinuxコンピュータとの互換性のために最適化されたオープンソースのImageJ（http://fiji.sc）、フィジー分布3を使用してください。
- プラグイン> LOCI> BioFormatsインポーター9その後 、ニコンスタック（ 図2A）用など name.idsを共焦点のファイルを選択するために行くことによって、フィジーへのインポート共焦点スタック。スプリットチャンネルをチェックして、オートスケールを確認して、グレースケール：Hyperstack、カラーモードを見るこのスタックを選択します。
- これらの選択は、4つの別々のチャンネルパネルを開きます。 EGFP 1つだけが、通常、第三のいずれかの下に必要とされるであろう。 C = 1（ 図2A）に続く長い名前の16ビット画像を残して、他の3パネル（赤、青、アルファ）を閉じます。
- 画像がスクロールTAを使用しますが、スキャンでスレッショルドを調整B目的の領域または構造を持つスライスを見つけるため底部に沿って、その後（ 図2C）>しきい値を調整>画像に移動します。
- 登場パネルで、構造が背景に非常によく見ることができるように、左側にある最上部のバー（黒レベル）をスライドさせ、それが（ 図2D）である下段（白レベル）のまま。白黒を選択して、暗い背景を選択します。別の調整は各スライスのために必要とされる場合を除き、各画像についての計算しきい値を選択し、黒の背景を選択しないでください。このプロセスは、新たな8ビットの画像を作成する。
- 警告：しきい値を元に戻すか、保存されたImageJの中なので、共焦点スタックは変更が必要になるたびに再読み込みする必要がありますすることができません。番号を書き留めて、望ましい結果が達成されるまで、別の設定を試してみてください。
- 緑の3D出力を作るために赤と青のカラーボックスの選択を解除し、因子1（最高の）または2（良い）をリサンプリング、プラグイン> 3Dビューア>しきい値0に行く - それ以外の場合は、WILL白レンダリングを生成- （非オート）（ 図2E）適用]を選択します。
- 回転スピンし、マウスとキーボードのコントロール（ 図2F）を使用して3D画像をズームします。
- メニューのキャプチャ]オプションを使用して、任意のポイントで、静止画を保存します。スクリーン上の画像ボックスのサイズは、高解像度の画像が右下隅をドラッグして、ボックスを大きくすることが望まれる場合のように生成される画像のピクセル寸法を決定する。
- [表示]> [録音360度回転します（ 図2G）を選択することにより、スピニング3Dムービーを作成します。回転ステップごとに2度のデフォルトは、それははるかに小さいファイルサイズが作成されている、例えば5度に変更することができますが、アニメーションにぎくしゃくを追加することがあります。
- 後、メディアプレーヤーを表示して、インターネットへのアップロード、またはPowerPointプレゼンテーションで使用するためのいくつかの利用可能な形式のいずれかでファイルを保存します。オープンソースのメディアプレーヤー、VLC（ HTTP :/ / www.videolan.org / VLC / index.htmlを）無料で、非常によく、これらのビデオを処理します。
Representative Results
血管構造の3次元再構成は、ゼブラフィッシュの開発の包括的かつ視覚的に興味深い視点を提供します。これらは一般的に行われているよう1および2の表示方法を示す 。 図3は、内皮細胞におけるEGFPを発現したゼブラフィッシュ胚DPF 6で血管構造のいくつかの角度を示している。固体緑または白の色では、信号強度を評価することが困難なことができます。擬似着色ルックアップテーブルから画像強度を提供し、構造が重なった場合より良好な奥行き知覚を可能にする。ゼブラフィッシュのdpf 6の脈管構造の疑似着色3D画像の一例を図4に提供されているライブ胚の蛍光イメージングは、目と身体の動き、および心臓活動を含む生理学的特性を研究するために使用することができる。 図3及び図4トランスジェニックゼブラフィッシュラインを使用して、これらの方法で得られた代表的な結果を示している記載され。撮像分解能は、顕微鏡の特性に依存するが、EGFP信号の輝度は、ほとんどの市販のシステムとの良好な画像品質のために十分である。 3D表現の復興とレンダリングは一貫しており、このオープンソースソフトウェア内のオプションは、一貫して良好な結果を提供します。
図1。赤目除去。 A）タングステン必要性と、固定3 DPFの胚は、目の隣に配置。組織は、この位置から目の周りカットされます。B）目が抜けていると基本的な眼の筋肉と視神経が切断されています。空の眼窩は、点線の円で示されている。C）は 、同じ胚を裏返して上に向けインタクトな目で、メチルセルロースが搭載されている。 hres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。ステップバイステップの共焦点画像スタックの3次元再構成。 A）関心領域とスライスを見つけた後。B）を選択するためにプラグイン> LOCI> Bioformatを使用してフィジーにロードファイルを開く（4104.1.ids）、しきい値調整を示す。C）として選択されたしきい値は、トップを使用して214に調整されているスライダー、[適用方向について、3次元再構成をそのまま目でゼブラフィッシュの図示されている）のように、D）3Dビューアが呼び出され、Eが選択されています。F）の画像をズームや回転している。G）の 360度回転の映画図示のように行われる。 res.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。3次元再構成からの視点。 A）10倍の目的で画像化6 DPF胚の内側の視点、口が右側にあり、口の中ではないエラ。 のB同じ胚の）横方向、ノートフィンが途中でループです。20X目的で画像化、C）と同じ胚、 20X客観的イメージングの中間視点、ノート鰓の解像度。D）横視点。フィンは、パネルの右端にある。20X客観的イメージングのE）の前-内側図、右側に20X客観的、頭、それを用いて画像化、同じ胚の口の中の音符のエラ。F）腹部。右下の卵黄嚢に血管系に注意してください。jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。6 DPF胚における強度差。信号強度のための疑似カラールックアップテーブルを用いて、6 DPFの再構築のイメージ。口、脳、えらや卵黄嚢はオリエンテーションのためにラベルが付いています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5。4 DPFのゼブラフィッシュにおける再構築された血管系の映画は。魚は2.5程度で画像化した。イメージはなかった胚の半分を撮像する。 図6に提供GSI処理ゼブラフィッシュにおける構造と血管構造を比較してください。頭の中の血管の低い密度と大きなエラに注意してください。 （ダウンロードの下の「Zfish_spin.avi「補足ファイルを参照してください）
図6。4 DPFのGSI処理胚における血管系の3Dムービー。魚が正中線の側方から貫通2.5ミクロンで画像化した。 図5に示す制御4 DPFの魚と血管構造を比較してください。アーチ型のバックと小型化、この化学物質で処理された胚における典型的なものである。 （ダウンロードの下の「GSI-treated_4dpf_fish.avi「補足ファイルを参照してください）
Discussion
ここに記載されている方法は、ゼブラフィッシュの開発に血管系の視覚的な研究のための基盤を提供します。固定したサンプルは、高解像度の共焦点画像化。 ショウジョウバエおよびC.のために使用することができるが、ライブの標本は、例えば、心拍数および心臓の拍出量のような生理学的パラメータを評価するために使用することができる虫は全身イメージングを可能にするが、ゼブラフィッシュは、脊椎動物であり、内皮細胞で裏打ち血管系を含む脊椎動物の組織のための有用なモデルを提供する。これらの研究は、ゼブラフィッシュの研究コミュニティからの重要なトランスジェニック系統とゲノムリソースを組み込むことができます。 3D再構成及び胚ゼブラフィッシュからの共焦点画像のレンダリング、ここで説明するように、血管の分岐や、ラットやマウスのような大きな動物モデルでは不可能な血管密度のシステム生物学的アプローチが可能になります。さらに、ゼブラフィッシュは、変更可能な環境（E3バッファ）で開発する羊膜のように、どこで人は簡単にCを追加することができます血管の発達に影響する特定の酵素または他のプロセスを阻害するhemicals。化学物質デリバリーの濃度およびタイミングは微調整処理条件に研究を可能にする、変更することができる。
1。変更およびトラブルシューティング
このシステムへの変更は10組織、臓器または地域特有の様々なパターンにEGFPまたは他の蛍光タンパク質を発現するゼブラフィッシュのトランスジェニック系統を組み込むことができます。さらに、ゼブラフィッシュ網膜における血管新生の変化の分析は、最近5を出版されました。年齢以上の胚および成体ゼブラフィッシュにおける色素沈着の問題は、スケール顔料または網膜色素を産生しないトランスジェニック系統と交配することによって補償することができる。減少した蛍光に関する問題は、一般的に不適切な固定条件から生じる。 1日のパラホルムアルデヒド（4％）が最適であるが、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム又はアルコールなどのより強力な固定剤は、よいEGFP蛍光を破壊する。固定後、胚を4℃のPBSに保つ必要があり、常に直射日光の当たらない。
この技術の2。制限事項
このプロトコルを用いて製造さ3Dレンダリングの品質と解像度は、生成された画像の品質に依存します。これらの胚を通る光の浸透は、標準の共焦点顕微鏡を用いて正中矢状平面に制限されています。イメージングのこの態様は、古い胚および成人における撮像の深さを制限するが、より高度なマルチフォトン顕微鏡検査システムは、より大きな深さでの撮像を可能にする。
既存の方法に関して3。意義
このプロトコルは、動物全体を組み込むことができ、システムレベルでの血管網の分析へのアプローチを提供します。そのようなデータの以前の表現はよく一緒にレイアウトされた一連の画像に依存していましたが、3Dレンダリング、空間RELAの優れた分解能を提供します関わっtionships。
4。将来のアプリケーション
イメージングおよび組織処理における新たな展開は、古い胚、大人の透明11-14行うことを含むことがあり、これらの方法には多くの新しいアプリケーションを提供します。強化された透明性を大幅に共焦点と多光子レーザーによる組織への浸透を増加します。また、カメラ、光電子増倍管のような分析速度の4 番目の次元を提供し、それはすぐにリアルタイムで魚の3Dレンダリングを生成することが可能であってもよい増やす。
5。重要なステップ
このプロトコルにおける重要なステップは、適切な固定を含んイメージングのための準備である。イメージングは、利用可能な最良の数値開口を有し、高品質目標で固定した後、できるだけ早く行う必要があります。解像度が使用される画像化システムに依存するため、高品質なシステムは一般に良好である。 3Dレンダリングを生成することは、メモリを集中的にメモリと良好なグラフィックス·プロセッサを大量に持つので、より新しい、ハイエンドのコンピュータに推奨されています。
これらの方法は、ニューロン、筋肉、腺または任意の数の集団において、GFP、または他の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック胚に適合させることができるが、ここで説明視覚生物系は、血管内皮細胞にEGFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュのために最適化された他のセル。このシステムでの作業中の主な利点は、固定および/または生きた動物では、この発達期間中の任意の時点で全体の胚で何が起こっているのか研究する能力である。
Disclosures
開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、これらの技術の開発を支援私たちの研究室の過去と現在のメンバーに感謝。部分的な資金調達、再生医療/ CIRM（RN1-00538）のためのカリフォルニア工科大学からの助成金によって、DEに提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4 °C | |
| E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
| Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
| GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
| 24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
| Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipettes | |
| Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
| NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
| Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
| Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
| Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |
References
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