Summary
Визуализация цереброваскулярной развития в личиночной данио описывается. Методы по содействию 3D визуализации и изменять цереброваскулярные развитие с помощью химической обработки также предоставляются.
Abstract
Данио рерио являются мощным инструментом для изучения биологии развития и патологии в естественных условиях. Небольшой размер и относительной прозрачности эмбрионов данио рерио делают их особенно полезными для визуального изучения процессов, таких как сердце и развития сосудов. В ряде недавних исследований трансгенных данио, которые выражают EGFP в эндотелиальных клетках сосудов были использованы для изображения и анализа сложных сосудистых сетей в мозге и сетчатке, с помощью конфокальной микроскопии. Описания предусмотрены для подготовки, лечения и изображение эмбрионов данио рерио, которые экспрессируют усиленный зеленый флуоресцирующий белок (EGFP), а затем генерировать подробные 3D визуализации на цереброваскулярных системы. Протоколы включают лечение эмбрионов, работы с изображениями конфокальной и фиксации протоколы, которые сохраняют флуоресценции EGFP. Кроме того, полезные советы по получению высококачественных изображений цереброваскулярных структур, таких как удаление глаза, не повреждая самой близкой нервной ткани предоставляются. Потенциальные ловушкис конфокальной микроскопии обсуждаются вместе с шагов, необходимых для создания 3D-реконструкций из конфокальной стеков изображение, используя свободно доступное программное обеспечение с открытым исходным кодом.
Introduction
Данио рерио обеспечить мощную систему для изучения биологии развития, а относительная прозрачность их эмбрионов поддается визуализации на основе исследований 1. Данио теперь используется в качестве модели для развития позвоночных на протяжении десятилетий. Костистых рыб, в том числе у рыбок данио, имеют упрощенную позвоночных сосудистую систему, которая не имеет разумного гомолог в беспозвоночных. Кровь проходит от передней камере двухкамерного сердца через жабры, где она кислородом. Кровь из жабр сходится в спинной аорты и проходит через артерии, которые разветвляются на все меньшие и меньшие суда, в конечном итоге капилляров в тканях органов. В капилляров кислорода высвобождается и диоксид углерода поглощается. На венозной стороне капилляров кровь поступает в больших и больших венах и, наконец, обращается в заднюю камеру сердца, где цикл повторяется.
Взрослый данио могут заложить 200 или больше яиц за один раз, и ОНКэ оплодотворена, они развиваются быстро 2. В течение одного дня ось тела хорошо развита, в том числе мышц, что контракт и двигаться эмбрион вокруг внутри хорионического мембраны. От 2-7 дней после оплодотворения (DPF) большинство систем организма развивать, в том числе глаз и центральной нервной системы, которые могут координат плавание к еде или от яркого света. До 7 эмбрионы DPF достаточно малы, чтобы позволить для визуализации с микроскопии. Трансгенные линии, которые выражают флуоресцентные белки могут быть отображены с конфокальной или флуоресцентной микроскопии. Конфокальной визуализации может работать в паре с открытым исходным кодом программного обеспечения 3 для создания 3D визуализации комплектных сосудистых структур у эмбрионов данио рерио, которые обеспечивают биологии систем перспективу развития сосудов. Исследования связанные с изменениями в сосудистой и цереброваскулярной сложности получат выгоду от этого протокола, так как позволяет для анализа уровня системы сосудистых сетей 4,5. Обобщения методов и ресурсов обеспечитьг, что обеспечивает удобство принятия и из этих методов для исследований, требующих визуализации сосудистых структур в эмбриональном рыбок данио. Экономическая эффективность рыбок данио в качестве животной модели является объединение с новыми технологиями обработки изображений, чтобы обеспечить новые платформы с помощью которых можно оценить развитие кровеносных сосудов эффекты молекулярных путей в развитии позвоночных и гомеостаза.
Protocol
1. Данио рерио земледелия, эмбрионов поколения, и лечение
- Провести следующие данио протоколов под руководством институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) и в рамках руководящих принципов по уходу за животными время НИЗ или других регулирующих органов / руководящих принципов.
- Данио рерио штаммы, которые выражают флуоресцентные белки в конкретных тканей, клеток или органов, имеются на данио рерио Международного ресурсного центра (Zirc). Например, Tg (KDR: EGPF) s843 выразить EGFP в эндотелиальных клетках сосудов 6, которые могут быть использованы для получения полных 3D сосудистые структуры, как показано в данном протоколе. Другие линии трансгенных данио доступны Zirc.
- Дом взрослых данио в соответствующей системе аквакультуры, которая контролирует рН, соленость, температура, растворенный кислород, свет, и других факторов окружающей среды 7. Данио показано здесь были размещены в системе Aquaneering Инк (San Diego, CA) в 28,5 ° С с 14-часовой LIGht/10 часов темноты. Поток взрослых данио сбалансированный рацион артемии и NRD 4/6 для рыб (артемии Прямая, Огден, штат Юта).
- Самец и самка взрослые данио племенного возраста должны быть размещены отдельно, чтобы увеличить спаривания успешным.
- Стимулировать яйценоскость и оплодотворение путем размещения самок (2-4) и самцов (4-6) вместе в брачный контейнера, который имеет дно сетки с отверстиями, достаточно большими для яйца попадают через, но слишком мало для рыбок данио взрослых пройти . Настройка вязки накануне вечером; Яйца откладываются на рассвете, как правило, в то время как днем световой цикл медленно увеличивается в интенсивности (рассвет). Проверка на яйца в нижней части контейнера сопрягаемой каждые 15-30 минут.
- Собирайте яйца, используя фильтр сетки и чистым с E3 буфера (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2, 0,33 мМ MgSO 4). Передача яйца до 100 мм пластин культуры, заполненных буфера E3 и хранить в инкубаторе 28 ° C.
- Для изучения химических веществ, которые изменяют CERebrovascular ветвления добавить желаемые химические концентрации. Например neovasular разветвление может быть индуцирована с γ-секретазы ингибитора (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-аланил)]-S-phenylglycinet-бутиловый эфир) растворяли в ДМСО 4, начиная 24 часов после оплодотворения (ФВЧ). В то время точкой эмбрионов все еще в пределах хориона, и многие химические вещества могут проходить через него 8. Если состояние обращение имеет нервные или моторные эффекты, которые могут повлиять на способность эмбрионов вырваться из хориона, то эмбрионы должны быть де-chorionated между 24 и 48 часов после оплодотворения, которые можно сделать либо с пинцетом проназы 2. Эмбрионы, показанные в изображениях, предоставленных были dechorionated, осторожно забрал хориона с двумя заостренными пинцетом и разрывая его открытым.
- При необходимости / желании, образование пигмента может быть ингибирован добавлением 0,003% N-фенилтиомочевины (ПТУ) в буфер E3 на 24 часов после оплодотворения.
2. Конфокальной микроскопии цереброваскулярных StructОЭС в основной эмбрионов рыбок данио
- Жертвоприношение эмбрионов в 250 мг / л Tricaine метансульфонат, а затем исправить их путем погружения в 2 - 4% параформальдегида в течение ночи при 4 ° С. Контейнеры с люминесцентными эмбрионов следует завернуть в фольгу. После фиксированной, эмбрионы должны храниться в PBS при 4 ° С, пока не изображается - интенсивность флуоресценции EGFP становится менее решена примерно через неделю, но морфология (если смотреть в светлом поле) сохраняется намного дольше.
- Подготовка для установки эмбрион сначала удалением один глаз, используя заостренную вольфрамовой иглы. Вырезать вокруг ткани, соединяющей глаза сначала обрежьте мышцы, и, наконец, сократить зрительный нерв сместить глаз. (Примечание: Если визуализации обеих сторон желательно удалить оба глаза.)
- После того, как глаз удаляется, крепления эмбрион на покровного стекла с использованием каплю 3% метилцеллюлозы. Сориентируйте эмбрион так, чтобы сторона со снятой глаза сталкивается с покровного стекла и как можно ближе к стеклу, как это возможно. Покройте всю эмбриона с метилlcellulose чтобы предотвратить высыхание во время съемки.
- Изображение установлен эмбриона сразу с использованием инвертированного конфокальной микроскопии, оснащенный высококачественным 20x План Апо цели (числовая апертура = 0,75 или лучше). Эта конфигурация является предпочтительным по сравнению с не-инвертированного микроскопа, который потребовал бы сэндвич эмбрион между двумя стеклянными плоскостями, а нажатие эмбрион на верхнюю стекла.
- Сбор оптических ломтиками в 1 мкм с шагом, используя настройки диафрагмы средний или большой. Более крупные шаги 2,5 мкм также могут быть использованы, но это может быть более трудным для определения пространственного порядок более мелких объектов. Небольшие отверстия производят четкое деталь, но чем дольше сканирует необходимые может отбелить EGFP, а также ограничить глубину изображения в эмбрион, что может быть достигнуто. Конфокальной микроскопии позволяет для работы с изображениями о на полпути через эмбриона.
- Если визуализация всей рыбы желательно, удалить оба глаза с самого начала (см. примечание в пункте 3.2), поверните эмбрион после Imaginг одной стороны и повторите шаги 2,3 - 2,5 для противоположной стороны.
3. 3D Реконструкция эмбриональных данио рерио Cerebrovasculature
- Используйте распределение Фиджи 3 из открытым исходным кодом ImageJ (http://fiji.sc), оптимизированный для 3D визуализации, бесплатно, и совместимый с ПК, Mac и Linux компьютеров.
- Импорт конфокальные стеки в Фиджи, перейдя в Плагины> локусов> BioFormats Импортер 9 затем выберите конфокальной файл, например name.ids для Nikon стеков (рис. 2а). Выберите Вид стек с режимом HyperStack, Цвет: оттенки серого, проверить авто-масштабирования, проверьте расколоть каналов.
- Эти выборы откроют четыре отдельных канала панелей; для EGFP только один будет необходимо, как правило, третий один вниз. Закройте все три панели (красный, синий и альфа) оставив 16-битное изображение с длинным именем последующим С = 1 (рис. 2а).
- Отрегулируйте порог путем сканирования если изображение с помощью прокрутки таб по дну, чтобы найти кусочек, который имеет область или интересующую структуру, затем перейдите к Image> Adjust> Threshold (рис. 2С).
- На панели, которое появляется, сдвиньте верхнюю панель (уровень черного) слева так, чтобы структура можно увидеть вполне хорошо за фоновом режиме, и оставить нижнюю слайд (уровень белого), где это (рис. 2D). Выберите B & W, выберите темный фон. Не Выбрать Вычислить порог для каждого изображения, если различные регулировки не требуются для каждого среза, выберите Черный фон. Этот процесс создает новый 8-битное изображение.
- ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Порог не может быть отменено или сохранены в ImageJ, поэтому конфокальной стек придется быть перезагружен после каждого изменения необходимо. Запишите номера и попробуйте различные настройки, пока желаемый результат не будет достигнут.
- К Плагины> 3D Viewer> Threshold 0, Ресэмплирование фактор 1 (лучший) или 2 (хорошее), снимите красные и синие коробки цвета, чтобы сделать зеленый выход 3D - в противном случае он шLL получения белого рендеринг - выберите Применить (не авто) (рис. 2Е).
- Поверните, спин и увеличения 3D-изображения с помощью мыши и кнопок управления (рис. 2F).
- Сохранить неподвижных изображений в любой точке с помощью параметра захвата в меню. Размер окна изображения на экране диктует пиксельные размеры изображения, полученные таким образом, если изображение высокого разрешения желательно сделать окно больше, перетаскивая правый нижний угол.
- Создать спиннинг 3D фильм, выбрав Вид> Record 360 град вращение (рис. 2G). Вращение по умолчанию 2 градуса в шаге, но он может быть изменен на 5 градусов, например, что создаст значительно меньшие размеры файлов, но может добавить подергивание в анимации.
- Сохраните файл в одном из нескольких доступных форматов для последующего просмотра с медиа-плееров, загрузки в Интернет или использования в PowerPoint презентаций. С открытым исходным кодом медиа-плеер, VLC ( HTTP :/ / www.videolan.org / VLC / index.html), бесплатно и обрабатывает эти видео очень хорошо.
Representative Results
3D реконструкция сосудистых структур обеспечивает всесторонний и визуально интересный перспективу данио развития. Рисунках методы 1 и 2 показывают, как они обычно делается. Рисунок 3 показывает несколько углов сосудистых структур в 6 DPF эмбрионов рыбок данио, что выражается EGFP в эндотелиальных клетках. С твердой зеленого или белого цвета, это может быть трудно оценить интенсивность сигнала; псевдо-раскраска обеспечить интенсивность изображения из справочной стола и позволяет лучше восприятие глубины, когда структуры перекрываются. Пример псевдо-цветного 3D-изображения сосудистой в 6 денье данио предоставляется на рисунке 4. Флуоресценции визуализации живых эмбрионов может быть использован для изучения физиологических характеристик, которые включают глаз и движения тела, и сердечная деятельность. 3 и 4 показать репрезентативные результаты, полученные с помощью этих методов, при помощи трансгенных данио линию описано. Разрешение изображений зависит от микроскопических характеристик, но яркость сигнала EGFP достаточно высокое качество изображения с большинством коммерческих систем. Реконструкция и предоставление 3D представлений является последовательной и варианты в пределах данного программного обеспечения с открытым исходным кодом обеспечивают стабильно хорошие результаты.
Рисунок 1. Удаление глаз. А) Фиксированная 3 DPF эмбрион с необходимостью вольфрама расположены рядом с глазом. Ткань обвести глаза от этой позиции. B) Глаз выпадает и лежащие в их основе глазные мышцы и зрительного нерва обрезаются. Пустая глазница обозначается пунктирным кругом. С) То же эмбрион перевернулся и монтируется с метил-целлюлозы, с неповрежденной глаза вверх. hres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Шаг за шагом 3D реконструкции конфокальной стека изображения. А) Открыть файл (4104.1.ids) загружается в Фиджи с помощью плагинов> локусов> Bioformat выбрать. B) После нахождения кусочек с интересующей области, настройка пороговой величины выбран, как показано. C) Порог доводят до 214, используя вершины выбран слайдер и применять. D) 3D-просмотра, называется, как показано. Е) Реконструкция 3D показан из рыбок данио с глазом неповрежденной, для ориентации. F) изображение было увеличенной и вращается. G) A 360 градусов вращения кино производится, как показано. res.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Перспективы от 3D-реконструкции. А) медиальная перспектива 6 DPF эмбриона изображаемого с 10-кратным цели, рот находится справа, а не жабры внутри рта. Б) Боковая того же эмбриона, примечание плавник петля в середине. C) То же эмбрион полученную с 20-кратным цели, медиальная перспектива, примечание разрешение жаберных. D) Боковая перспектива 20x объективной визуализации. Плавник на правом краю панели. Е) Антеро-медиальная вид 20x объективной визуализации, примечание жабры внутри рта. F) Живот того же эмбриона изображаемого с 20x объективной, руководитель его вправо. Примечание сосудистую на желточного мешка в правом нижнем углу.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Различия интенсивности в 6 DPF эмбриона. Изображение реконструкции 6 DPF с помощью псевдо-Look-Up-стол для интенсивности сигнала. Рот, мозг, жабры и желток мешок помечены для ориентации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Фильм реконструированного сосудистой системы в 4 DPF рыбок данио. Рыба был сфотографирован на 2,5 мкм. Изображения былиот визуализации одну половину эмбриона. Сравните сосудистые структуры со структурами в GSI-обработанной рыбок данио, предусмотренных на рисунке 6. Обратите внимание на низкую плотность кровеносных сосудов в голове и большие жабры. (См. "Zfish_spin.avi" дополнительный файл под Загрузки)
Рисунок 6. 3D фильм сосудистой системы в GSI-обработанной эмбриона на 4 денье. Рыба был сфотографирован на 2,5 мкм до с латеральнее средней линии. Сравните сосудистые структуры с контролем 4 DPF рыбы, показанной на рисунке 5. Выгнутой спине и меньший размер типичны у эмбрионов, обработанных этим химическим веществом. (См. "GSI-treated_4dpf_fish.avi" дополнительный файл под Загрузки)
Discussion
Методы, описанные здесь обеспечить основу для визуальных исследований сосудистой системы в развивающихся данио. Живые экземпляры могут быть использованы для оценки физиологических параметров, таких как частота сердечных сокращений и ударного объема сердца, в то время как фиксированные образцы можно использовать для конфокальной микроскопии высокого разрешения. Дрозофилы и С. Элеганс позволяют визуализаацию, но данио являются позвоночные и обеспечивают полезную модель для позвоночных тканей, в том числе эндотелиальных системы клеток сосудов подкладке. Эти исследования могут включать значительные трансгенных линий и геномные ресурсы от данио-исследовательского сообщества. 3D-реконструкция и предоставление конфокальной изображений из эмбрионального рыбок данио, как описано здесь, позволяют для биологии систем подхода к сосудистой разветвления и плотности кровеносных сосудов, что невозможно в больших животных моделях, таких как крысы и мыши. Кроме того, как амниоты данио развиваться в изменяемой среды (E3 буфер), где можно легко добавить грhemicals которые ингибируют определенные ферменты или другие процессы, которые влияют на развитие сосудов. Концентрация и сроки химической поставки может быть изменен, что позволяет исследователю условия для тонкой настройки обработки.
1. Изменения и устранение неисправностей
Модификации этой системы может включать трансгенных линий, которые экспрессируют данио EGFP или другие флуоресцентные белки в различных ткань, орган или области определенных шаблонов 10. Кроме того, анализ неоваскулярных изменений в сетчатке данио был недавно опубликован 5. Проблемы с пигментацией у пожилых эмбрионов и взрослых данио могут быть компенсированы путем скрещивания с трансгенных линий, которые не производят масштабные пигменты или сетчатки пигмента. Проблемы с уменьшенной флуоресценции обычно в результате ненадлежащих условий фиксации. Параформальдегид (4%) в течение 1 дня является оптимальным, но сильные фиксаторы, такие как глютаральдегидом, осмия или алкоголя, можетуничтожить флуоресценцию EGFP. После фиксации эмбрионы должны храниться в PBS при 4 ° С и всегда защищен от прямого солнечного света.
2. Ограничения этого метода
Качество и разрешение 3D визуализации, произведенных с этим протоколом зависит от качества изображений, генерируемых. Проникновение света через этих эмбрионов ограничена середине сагиттальной плоскости с помощью стандартного конфокальной микроскопии. Этот аспект визуализации ограничивает глубину изображения в старых эмбрионов и взрослых, но более продвинутые системы многофотонное микроскопия позволяет для работы с изображениями на больших глубинах.
3. Значение по отношению к существующим методам
Этот протокол обеспечивает подход к анализу сетей кровеносных сосудов на уровне систем, которые могут включать целую животное. Ранее представления таких данных часто полагались на серии изображений, изложенных вместе, но 3D-рендеринга обеспечивает лучшее разрешение пространственного отнонекоторых соотношениях участие.
4. Будущие приложения
Новые разработки в области визуализации и обработки тканей обеспечит много новых приложений для этих методов, которые могут включать делая старые эмбрионов или взрослых прозрачный 11-14. Повышение транспарентности значительно увеличит проникновения в ткани с помощью конфокальной и многофотонных лазеров. Кроме того, как скорость камеры и фотоэлектронных умножителей увеличить вскоре можно будет производить 3D визуализации рыбы в режиме реального времени, обеспечивая 4-е измерение анализа.
5. Критические шаги
Важным шагом в этом протоколе является подготовка для работы с изображениями, которая включает надлежащую фиксацию. Изображений должно быть сделано как можно скорее после фиксации с высоким качеством целей, которые имеют лучшие цифровые отверстия имеющиеся. Разрешение зависит от системы формирования изображения используется, поэтому высокое качество системы в целом лучше. Создание 3D визуализации является большой объем памятитак новые, высокого класса компьютеров с большим объемом оперативной памяти и хороших графических процессоров рекомендуется.
Система визуального биологии описано здесь была оптимизирована для трансгенных данио, которые выражают EGFP в эндотелиальных клетках сосудов, хотя эти методы могут быть адаптированы к трансгенных эмбрионов, которые выражают GFP, или другие флуоресцентные белки, в популяциях нейронов, мышц, желез или любое количество другие клетки. Главное преимущество в работе с этой системы является возможность изучать то, что происходит во всем эмбриона в любое время в течение этого периода развития, в фиксированных и / или живых животных.
Disclosures
Там нет ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Авторы благодарят прошлые и нынешние члены наших лабораториях, которые помогли разработать эти методы. Частичное финансирование предоставляется DE грантом Калифорнийского института регенеративной медицины / CIRM (RN1-00538).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4 °C | |
| E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
| Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
| GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
| 24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
| Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipettes | |
| Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
| NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
| Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
| Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
| Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |
References
- Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , University of Oregon Press. (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-β plays a conserved role in angiogenesis. PLoS ONE. 7, (2012).
- Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. Amyloid-β increases capillary bed density in the adult zebrafish retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo. Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Opitz, R., et al. Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development. Dev Biol. 372, 203-216 (2012).
- Gleave, J. A., et al. Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging. Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy. Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. 68, e4272 (2012).
