Summary
Imaging av cerebrovaskulär utveckling i larver zebrafisk beskrivs. Tekniker för att underlätta 3D-avbildning och ändra cerebrovaskulär utveckling med hjälp av kemiska behandlingar finns också.
Abstract
Zebrafisk är ett kraftfullt verktyg för att studera utvecklingsbiologi och patologi in vivo. Den lilla storleken och den relativa öppenheten i zebrafisk embryon gör dem särskilt användbara för visuell undersökning av processer såsom hjärta och kärl-utveckling. I flera nya studier transgen zebrafisk som uttrycker EGFP i vaskulära endotelceller har använts för att avbilda och analysera komplexa vaskulära nätverk i hjärnan och retina, med användning av konfokalmikroskopi. Beskrivningar finns för att förbereda, behandla och bild zebrafisk embryon som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP), och sedan generera omfattande 3D-renderingar av cerebrovaskulär systemet. Protocols inkludera behandling av embryon, konfokal avbildning, och fixeringsprotokoll som bevarar EGFP-fluorescens. Vidare är bra tips på att få bilder av cerebrovaskulära strukturer, till exempel avlägsnande av ögat utan att skada närliggande nervvävnad av hög kvalitet tillhandahålls. Potentiella fallgroparmed konfokal avbildning diskuteras, tillsammans med de åtgärder som krävs för att generera 3D-rekonstruktioner från konfokala bildstaplar med hjälp av fritt tillgänglig programvara med öppen källkod.
Introduction
Zebrafisk ger ett kraftfullt system för att studera utvecklingsbiologi, och den relativa öppenheten i deras embryon är mottaglig för imaging-baserade studier 1. Den zebrafisk har nu använts som modell för ryggradsdjur utveckling i årtionden. Benfiskar, inklusive zebrafisk, har en förenklad ryggradsdjur kärlsystemet som inte har någon rimlig homolog i ryggradslösa djur. Blodet pumpas från den främre kammaren i två kamrar hjärta genom gälar, där det är syresatt. Blod från gälarna konvergerar vid den dorsala aorta och passerar genom artärerna som gren i mindre och mindre fartyg når slutligen kapillärerna i vävnader orgel. Inom kapillärer syre frigöres och koldioxid absorberas. På den venösa sidan av kapillärer blod flödar in i större och större vener och slutligen dras in i bakre kammare i hjärtat, där cykeln upprepas.
En vuxen zebrafisk kan lägga 200 eller fler ägg i taget, och ONCe befruktade, utvecklar de snabbt 2. Inom en dag kroppsaxeln är väl utvecklad, inklusive muskler kontraktet och flytta embryot runt inne i chorionic membranet. Från 2-7 dagar efter befruktningen (DPF) de flesta kroppssystemen utvecklas, bland annat ögon och ett centralt nervsystem som kan samordna simma in mot mat eller borta från starkt ljus. Upp till 7 dpf embryon är tillräckligt små för att möjliggöra visualisering med mikroskopi. Transgena linjer som uttrycker fluorescerande proteiner kan avbildas med konfokal eller fluorescensmikroskopi. Confocal avbildning kan paras ihop med öppen källkod 3 för att skapa 3D-renderingar av kompletta kärlstrukturer i zebrafisk embryon som ger en systembiologi perspektiv av vaskulär utveckling. Berörs av förändringar i kärl-och cerebrovaskulär komplexitet studier kommer att gynnas av detta protokoll eftersom det möjliggör en systemnivå analys av vaskulära nätverk 4,5. En sammanställning av metoder och resurser gerd för att möjliggöra enkel antagande och av dessa tekniker för studier som kräver avbildning av vaskulära strukturer i embryonala zebrafisk. Kostnadseffektiviteten för zebrafisk som en djurmodell är att kombinera med nya avbildningstekniker för att tillhandahålla nya plattformar för att mäta de angiogena effekter av molekylära vägar i ryggradsdjur utveckling och homeostas.
Protocol
1. Zebrafish djurhållning, Embryo Generation, och behandling
- Genomför följande zebrafisk protokoll under ledning av en institutionell djurvård och användning kommittén (IACUC) och inom riktlinjerna för NIH eller andra reglerande organ / riktlinjer djurskötsel.
- Zebrafisk stammar som uttrycker fluorescerande proteiner i specifika vävnader, celler eller organ är tillgängliga från Zebrafish International Resource Center (Zirc). Till exempel, Tg (KDR: EGPF) s843 uttrycka EGFP i vaskulära endotelceller 6, som kan användas för att producera kompletta 3D-vaskulära strukturer som visas i detta protokoll. Andra linjer av transgena zebrafisk är tillgängliga från Zirc.
- Hus vuxna zebrafisk i ett lämpligt system för vattenbruk som övervakar pH, salthalt, temperatur, löst syre, ljus och andra miljöfaktorer 7. Sebrafisken visas här inhystes i ett Aquaneering Inc. systemet (San Diego, CA) vid 28,5 ° C med en 14 timmars LIGmörker-cykel ht/10 timme. Feed vuxen zebrafisk en balanserad kost av artemia och NRD 4/6 Fisk mat (Brine Shrimp Direkt, Ogden, Utah).
- Vuxna manliga och kvinnliga zebrafisk i fertil ålder bör hållas separat för att öka parning framgångsrika.
- Stimulera äggläggning och befruktning genom att placera honor (2-4) och män (4-6) tillsammans i en passande behållare som har en mask botten med hål som är tillräckligt stora för äggen att falla igenom, men för liten för de zebrafisk vuxna att passera . Ställ in parningar kvällen innan; Äggen läggs nära gryningen, oftast medan dagtid ljus cykel ökar långsamt i intensitet (gryningen). Kontrollera om det finns ägg i botten av parningsbehållaren var 15-30 minuter.
- Samla ägg med användning av ett nät sil och ren med E3-buffert (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4). För över äggen till 100 mm odlingsplattor fyllda med E3 buffert och förvara i en 28 ° C inkubator.
- Att studera kemikalier som förändrar cerebrovascular förgrening lägga till önskade kemiska koncentrationer. Exempelvis neovasular förgrening kan induceras med γ-sekretas-inhibitor (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butylester) solubiliserades i DMSO 4, med början 24 timmar efter befruktning (HPF). På den tiden-punkts embryon är fortfarande inom chorion, och många kemikalier kan passera genom den 8. Om ett behandlingstillstånd har neurala eller motoreffekter som kan försämra förmågan av embryon för att bryta sig loss från chorion, då embryon ska vara de-chorionated mellan 24 och 48 HPF, vilket kan göras med antingen pincett av pronas 2. Embryon som visas i bilderna som var dechorionated genom att försiktigt ta tag chorion med två vässade pincett och riva upp den.
- Om det behövs / önskas pigmentbildning kan inhiberas genom tillsats av 0,003% N-fenyltiokarbamid (PTU) till E3-buffert vid 24 HPF.
2. Confocal avbildning av Cerebrovascular Structder i Fixed Zebrafish embryon
- Offer embryon i 250 mg / L Tricaine metansulfonat, och därefter fixera dem genom nedsänkning i 2-4% paraformaldehyd över natten vid 4 ° C. Behållare med fluorescerande embryon bör slås in i folie. En gång fast, bör embryon förvaras i PBS vid 4 ° C tills avbildas - EGFP fluorescensintensiteten blir mindre löst efter ungefär en vecka, men morfologi (sett i ljusa fält) bevaras mycket längre.
- Förbered dig på att montera embryot genom att först ta bort ena ögat med hjälp av en vass volfram nål. Skär runt vävnaden som förbinder ögat först skär sedan av muskler, och slutligen upphör synnerven att förskjuta ögat. (Notera: Om avbildning båda sidor önskas ta bort båda ögonen.)
- När ögat tas bort, montera embryot på en coverglass med hjälp av en nedgång på 3% metylcellulosa. Orientera embryot så att sidan med den borttagna ögat är vänd mot coverglass och är så nära glaset som möjligt. Täck hela embryot med metyllcellulose att förhindra uttorkning under avbildning.
- Bild den monterade embryot omedelbart med ett inverterat konfokalmikroskop utrustad med en högkvalitativ 20x Plan Apo objektiv (numerisk apertur = 0,75 eller bättre). Denna konfiguration är att föredra att ett icke-inverterat mikroskop som skulle kräva sandwichande embryot mellan två glas hyvlar, och trycka embryot mot toppglaset.
- Samla optiska skivor i steg om 1 ^ m med en medelstor eller stor bländarinställning. Större steg om 2,5 | im kan också användas, men det kan vara svårare att bestämma den rumsliga ordningen på mindre föremål. Små öppningar producera skarpare detalj, men de längre avsökningar som krävs kan bleka EGFP och också begränsa djupet av avbildning i embryot som kan uppnås. Ett konfokalmikroskop möjliggör avbildning ungefär halvvägs genom ett embryo.
- Om avbildning av hela fisken önskas, ta bort båda ögonen från början (se not i steg 3.2), vrid embryot efter imaging en sida och upprepa steg från 2,3 till 2,5 för den motsatta sidan.
3. 3D Rekonstruktion av embryonala Zebrafish Cerebrovasculature
- Använd Fiji distributionen 3 av öppen källkod ImageJ (http://fiji.sc), som är optimerad för 3D-renderingar, kostnadsfritt, och kompatibel med PC, Mac och Linux-datorer.
- Importera konfokala högar till Fiji genom att gå till Plugins> Loci> BioFormats Importör 9 välj sedan konfokala filen, t.ex. name.ids för Nikon stackar (Figur 2A). Välj Visa stack med Hypers, färgläge: gråskala, kolla autoskala, kolla delade kanaler.
- Dessa val kommer att öppna fyra separata kanalpaneler; för EGFP bara en kommer att behövas, vanligtvis den tredje ned. Stäng de övriga tre paneler (röd, blå och alfa) lämnar 16-bitars bild med ett långt namn följt av C = 1 (Figur 2A).
- Justera tröskelvärdet genom att skanna om bilden med hjälp av rullnings TAb längs botten för att hitta ett segment som har regionen eller struktur av intresse, sedan gå till Image> Adjust> Tröskel (figur 2C).
- I panelen som kommer upp, skjut det översta fältet (svarta nivå) till vänster så att strukturen syns ganska väl över bakgrunden, och lämnar den nedre slide (vit nivå) där det är (figur 2D). Välj B & W, välj mörk bakgrund. Välj inte räkna Tröskel för varje bild om inte andra justeringar krävs för varje skiva, väljer svart bakgrund. Denna process skapar en ny 8-bitars bild.
- VARNING: Tröskeln kan inte ångras eller sparas i ImageJ, så konfokala stacken måste laddas om varje gång en förändring behövs. Skriv ner siffrorna och prova olika inställningar tills önskat resultat uppnås.
- Gå till Plugins> 3D Viewer> Tröskel 0, sampla faktor 1 (bäst) eller 2 (bra), avmarkera de röda och blå färgrutorna för att göra en grön 3D-utgång - annars will producera en vit rendering - välj Apply (ej automatisk) (Figur 2E).
- Rotera, snurra och zooma 3D-bilden med hjälp av mus och tangentbord kontroller (Figur 2F).
- Spara stillbilder när som helst genom att använda fångst i menyn. Storleken på bilden ruta på skärmen dikterar pixeldimensioner av bilden som produceras så om en högupplöst bild önskas göra lådan större genom att dra i nedre högra hörnet.
- Skapa en snurrande 3D-film genom att välja Visa> Spela 360 ° rotation (figur 2G). Rotations standard 2 grader per steg, men det kan ändras till 5 grader till exempel som kommer att skapa mycket mindre filstorlekar, men kan lägga ryckighet i animeringen.
- Spara filen i ett av flera tillgängliga format för senare visning med mediaspelare, ladda upp till Internet, eller använda i PowerPoint-presentationer. Den öppen källkod mediaspelare, VLC ( http :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), är gratis och hanterar dessa filmer mycket bra.
Representative Results
3D-rekonstruktion av vaskulära strukturer ger en heltäckande och visuellt intressant perspektiv av zebrafisk utveckling. Figurerna 1 och 2 visar metoder som de vanligtvis gjort. Figur 3 visar flera vinklar av vaskulära strukturer i en 6 dpf zebrafisk embryo som uttryckte EGFP i endotelceller. Med en solid grön eller vit färg kan det vara svårt att uppskatta signalintensitet; pseudo-färgning ger bildintensitet från en uppslagningsbordet och tillåter bättre djupseende när strukturerna överlappar varandra. Ett exempel på en pseudo-färgade 3D-bild av kärlsystemet i en 6 dpf zebrafisk tillhandahålls i figur 4. Fluorescens avbildning av levande embryon kan användas för att studera fysiologiska egenskaper som inkluderar ögon-och kroppsrörelse, och hjärtverksamhet. Figurer 3 och 4 visar representativa resultat som erhållits med dessa metoder, med användning av den transgena zebrafisk linje beskrivas. Imaging upplösning beror på mikroskop egenskaper, men ljusstyrkan på EGFP signalen är tillräcklig för bra bildkvalitet med de flesta kommersiella system. Återuppbyggnad och rendering av 3D-representationer är konsekvent och alternativ inom detta program med öppen källkod ger genomgående bra resultat.
Figur 1. Bort Eye. A) En fast 3 dpf embryo med en volfram behov placerad intill ögat. Vävnad skärs runt ögonen från denna position. B) Ögat är faller ut och de underliggande okulär muskler och synnerven skärs. Den tomma ögonhålan indikeras med streckad cirkel. C) Samma embryo vänds och monteras med metyl-cellulosa, med det oskadade ögat uppåt. hres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Steg-för-steg-3D-rekonstruktion av en konfokala bildstapel. A) Öppna fil (4104.1.ids) laddade i Fiji genom att använda insticksprogram> LOCI> Bioformat att välja. B) Efter att ha hittat en skiva med det intressanta området, är tröskeljustering valts som visas. C) Tröskel justeras till 214 med hjälp toppen reglaget och tillämpa väljs. D) 3D-vyn kallas som visas. E) 3D rekonstruktion visas i en zebrafisk med ögat intakt, för orientering. F) Bilden har zoomat och roteras. G) En 360 graders rotation film är tillverkad såsom visas. res.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Perspektiv från 3D-rekonstruktion. A) Medial perspektiv 6 dpf embryo avbildas med 10x objektiv, är mun till höger, inte gälar inuti munnen. B) Lateral av samma embryo, är noterar fin en slinga i mitten. C) Samma embryo avbildas med 20x objektiv, mediala perspektiv, not gill upplösning. D) Lateral perspektiv 20x objektiv avbildning. Fenan är på den högra kanten av panelen. E) Antero-mediala bild av 20x objektiv avbildning, antecknings gälar inuti munnen. F) Buken av samma embryo avbildas med en 20x objektiv, huvudet åt höger. Observera kärl på gulesäcken längst ner till höger.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Intensitet skillnader i 6 dpf embryo. Bild av en 6 dpf rekonstruktion med hjälp av en pseudo look-up-tabell för signalstyrka. Mun, hjärna, gälar och gulesäcken är märkta för orientering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Film på rekonstruerade kärlsystemet i en 4 DPF zebrafisk. Fisken avbildades på 2,5 um. Bilderna varfrån att avbilda en halv av embryot. Jämför vaskulära strukturer med strukturer i en GSI-behandlad zebrafisk som anges i figur 6. Notera den lägre täthet av blodkärl i huvudet och större gälar. (Se "Zfish_spin.avi" kompletterande fil under Downloads)
Figur 6. 3D-film av kärlsystemet i en GSI-behandlad embryo vid 4 dpf. Fisken avbildades vid 2,5 um igenom i sidled till mittlinjen. Jämför vaskulära strukturer med kontroll 4 dpf fisk visas i figur 5. Den välvda ryggen och mindre storlek är typiska i embryon som behandlats med denna kemikalie. (Se "GSI-treated_4dpf_fish.avi" kompletterande fil under Downloads)
Discussion
De metoder som beskrivs här ger en grund för visuella studier av kärlsystemet utveckla zebrafisk. Levande exemplar kan användas för att bedöma fysiologiska parametrar såsom hjärtfrekvens och hjärtslagvolymen, medan fasta prover kan användas för hög upplösning konfokala avbildning. Drosophila och C. elegans möjliggöra hela kroppen avbildning, men zebrafisk är vertebrater och ger en användbar modell för ryggradsdjur vävnader, inklusive en endotelcell-fodrade kärlsystemet. Dessa studier kan innehålla betydande transgena linjerna och genresurser från zebrafisk forskarsamhället. 3D-rekonstruktion och rendering av konfokala bilder från embryonala zebrafisk, som beskrivs här, möjliggör en systembiologisk metod för kärl förgrening och blodkärlstätheten som inte är möjligt med större djurmodeller såsom råttor och möss. Vidare, som amnioternas zebrafisk utvecklas i en modifierbara miljö (E3-buffert), där man kan enkelt lägga till chemicals som hämmar specifika enzymer eller andra processer som påverkar vaskulär utveckling. Koncentrationen och tidpunkten för kemisk leverans kan ändras, gör det möjligt för forskare att finjustera behandlingsförhållanden.
1. Ändringar och felsökning
Modifieringar av detta system kan införliva transgena linjer av zebrafisk som uttrycker EGFP eller andra fluorescerande proteiner i en variation av vävnad, organ eller regionspecifika mönster 10. Vidare har analys av neovaskulära förändringar i zebrafisk näthinnan nyligen publicerats 5. Problem med pigmentering i äldre embryon och vuxna zebrafisk kan kompenseras genom att korsa med transgena linjer som inte producerar skal pigment eller retinal pigment. Problem med minskad fluorescens resulterar vanligtvis från olämpliga fixeringsförhållanden. Paraformaldehyd (4%) under en dag är optimal, men starkare fixativ, såsom glutaraldehyd, osmiumtetroxid eller alkohol, fårförstöra EGFP fluorescens. Efter fixering, bör embryon förvaras i PBS vid 4 ° C och alltid skyddas från direkt solljus.
2. Begränsningar av denna teknik
Kvaliteten och upplösning 3D-renderingar produceras med detta protokoll är beroende av kvaliteten på bilderna som genereras. Ljuspenetrering genom dessa embryon är begränsad till sagitalplan med en vanlig konfokalmikroskop. Denna aspekt av bildbehandling begränsar djupet av bildbehandling i äldre embryon och vuxna, men mer avancerade multi-foton mikroskopi system möjliggör avbildning på större djup.
3. Betydelse med avseende på befintliga metoder
Detta protokoll ger en metod för analys av blodkärlsnätverk på systemnivå som kan innehålla en hel djur. Tidigare representationer av sådana uppgifter förlitat ofta på bildserie som ut tillsammans, men 3D-rendering ger bättre upplösning på den rumsliga förhållandetioner inblandad.
4. Framtida applikationer
Ny utveckling inom bildbehandling och vävnadsbehandling kommer att ge många nya applikationer för dessa metoder som kan inkludera att göra äldre embryon eller vuxna transparent 11-14. Ökad öppenhet kommer att öka vävnadspenetration genom konfokala och multifoton lasrar. Vidare, eftersom hastigheten på kameror och fotomultiplikatorrör ökar kan det snart vara möjligt att producera 3D-renderingar av fisk i realtid, vilket ger en 4: e dimension analys.
5. Kritiska steg
Ett kritiskt steg i detta protokoll är förberedelse för avbildning, vilket inkluderar ordentlig fixering. Undersökningen bör göras så snart som möjligt efter fixering med hög kvalitetsmålen som har de bästa numeriska öppningar tillgängliga. Upplösning beror på avbildningssystem som används, så högkvalitativa system är i allmänhet bättre. Generera 3D-renderingar är minneskrävandeför så nyare, high-end datorer med en stor mängd minne och goda grafikprocessorer rekommenderas.
Den visuella biologi systemet som beskrivs här har optimerats för transgena zebrafisk som uttrycker EGFP i vaskulära endotelceller, även om dessa metoder kan anpassas till transgena embryon som uttrycker GFP, eller andra fluorescerande proteiner, i populationer av nervceller, muskler, körtlar eller valfritt antal andra celler. Den stora fördelen av att arbeta med detta system är möjligheten att studera vad som händer i hela embryot när som helst under denna utvecklingsperiod, i fasta och / eller levande djur.
Disclosures
Det finns inget att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar tidigare och nuvarande medlemmar i våra laboratorier som hjälpt till att utveckla dessa tekniker. Partiell finansiering till DE genom ett anslag från California Institute för regenerativ medicin / CIRM (RN1-00.538).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4 °C | |
| E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
| Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
| GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
| 24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
| Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipettes | |
| Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
| NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
| Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
| Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
| Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |
References
- Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , University of Oregon Press. (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-β plays a conserved role in angiogenesis. PLoS ONE. 7, (2012).
- Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. Amyloid-β increases capillary bed density in the adult zebrafish retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo. Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Opitz, R., et al. Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development. Dev Biol. 372, 203-216 (2012).
- Gleave, J. A., et al. Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging. Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy. Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. 68, e4272 (2012).
