Summary
Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.
Abstract
Kalp gelişimine sürüş olaylarının araştırılması için ve insanlarda miyokard hastalıklara yol açan moleküler mekanizmaların belirlenmesi amacıyla, fonksiyonel insan kardiyomiyositlerde (CMS) oluşturmak için birinci şarttır. Ilaç keşfi ve toksikoloji çalışmaları, bu hücrelerin kullanımı da insan kaynaklı hücreler üzerinde ön-klinik olarak geçerli olmak üzere kardiyak bozuklukların tedavisinde yeni moleküller sağlayan, yüksek ölçüde yararlı olacaktır. CMs olası kaynaklarının, uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri kolayca erişilebilir hasta doku doğrudan elde edilebilir gibi, en umut verici arasındadır ve vücudun 1 her hücre tipleri neden bir içsel kapasiteye sahip. Çeşitli yöntemler kimyasal olarak tanımlanmış protokoller 2,3 için klasik embriyoid organları (EBS) toplama yaklaşımı arasında değişen, CMs içine iPS hücreleri ayırt etmek için önerilmiştir. Bu yazıda bir EBS-tabanlı protokol teklif ve göstermek nasıl bu metodolojid verimli besleyici ücretsiz iPS hücrelerinden işlevsel CM-benzeri hücreler üretmek için kullanılabilir.
Introduction
Tarihsel olarak, insan gelişimi ve hastalık sürüş genetik ve moleküler mekanizmalar soruşturma genetiği değiştirilmiş hayvan modellerinin nesil dayanmaktadır. Ancak, çok sayıda insan fenotipleri başarıyla başlıca nedeni iki tür arasında var olan biyolojik farklılıkların, farelerde çoğaltılması için başarısız. Diğer taraftan, insan doku erişim sınırlı olabilir ve genellikle yeterli malzeme derinlemesine Deneysel çalışmalarda elde edilmesine izin yoktur. Kardiyovasküler biyoloji alanında bu sınırlamalar her iki muzdarip: insan kalbinin fizyolojisi fare bu önemli ölçüde farklı olduğu ve kalp dokusu önemli bir miktar sadece ölüm sonrası ya da kalp ameliyatı sırasında erişilebilir. Fonksiyonel insan CMs farklılaşması için en uygun kaynak bulmak bu nedenle kardiyovasküler biyoloji merkezi bir konu haline gelmiştir, ve çok çaba bu sorunu gidermek için yapılmıştır. Çeşitli hücre tipleri i, önerilmiştirncluding iskelet iskelet hücreleri yanında, yerel kardiyak kök hücreler, kemik iliği mononükleer hücreler, endotelyal ataları ve mezenkimal kök hücreler. Ancak, veri 4 tutarlı olmamıştır, bu hücreler kullanılarak elde edilmiştir.
Insan embriyonik kök hücreleri (ESC) türetilmesi ilk 5 ve Yamanaka ve Thomson 6,7 ile uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerin çığır açan keşfi daha sonra çözümler sunmak gibiydi: bu hücrelerin vermek için süresiz büyümeye yeteneği ve potansiyeline sahip CMs dahil olmak üzere üç germ her hücresi türevleri, yükselecek. IPS hücrelerinin kullanılması daha başka avantajları sunmaktadır: otolog yetişkin hücrelerinden türetilen, bunlar türetildiği tek tek ya da hasta ile aynı gen taşır. Bu nedenle, insan genetik hastalıklar ve gelişme mekanizmalarının incelenmesi kolaylaştırmak in vitro modeller gelişimini sağlar. Bu özelliği sayesinde ise, iPS hücreleri de o olabilirbağışıklık ret ve etik konular 8 ile ilgili vercome sorunları. EKH hala kök hücre biyolojisi alanında altın standart temsil etse de bu nedenlerden dolayı, araştırmacılar dünya çapında şu anda iPS hücresi teknolojisi karşı daha hareket ediyor.
iPS hücreleri, hemen konjenital kardiyovasküler bozukluklar da dahil olmak üzere, çeşitli koşullar 9,10 için, in vitro olarak insan hastalığı olan model için kullanılmaktadırlar. Son zamanlarda, iPS hücre hastalığı modelleme uygulaması monogenik kalp hastalıkları (örneğin uzun QT sendromları, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi) ve kalp kusurları karmaşık bir fenotip (yani Leopard ve Timothy sendromlar, dilate kardiyomiyopati) bir parçası olduğu patolojiler için yapılmıştır. Bu raporlar CMs ayrılırlar hastaya özgü iPS hücreleri in vivo hastalık olarak benzer fenotipik ve fonksiyonel özellikler gösterdiği doğruladı.
Ancak,kalp soy içine iPS hücreleri tetikleme etkinliğini artırmak için hala pek çok sorun vardır. Agrega oluşumu yoluyla insan EKH gelen CMs spontan nesil embriyoid organları (EBS) başarılı 17 kanıtlanmıştır çağırdı. Bu keşfinden beri, pek çok yöntem önerilmiştir. Birçok grup büyük ölçüde farklılaşma protokol verimliliği gelişmiş ve (Mummery bakınız, C., ve diğerleri., Mevcut tüm yöntemleri 3 kapsamlı bir inceleme için sirkülasyon Araştırma (2012) kimyasal olarak tanımlanmış ve hayvan-ürün içermeyen kültür reaktifler doğru taşındı .)
Bununla birlikte, EB toplama dayalı klasik yöntem hala en sık fonksiyonel çalışmalar yapmak ve hastalık mekanizmaları araştırmak için istihdam temsil eder. Bizim önerilen protokol kalp farklılaşma sürecini geliştirmek için gösterilmiştir, serum ve askorbik asit varlığında EBS içine iPS hücreleri, agregasyon ve kültür ve po alınmaktadır18,19 regüle edilebilen bu hücrelerin olgunlaşmasını etkileyebilir. Bu yazıda ayrıntılı olarak bu metodoloji üzerinden gidecek ve hastaya özgü iPS-türetilmiş CMs üretmek için besleyici-ücretsiz iPS hücre hatları nasıl kullanılacağını gösterecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. İnsan iPS Hücre Hatlarının Besleyici Bakım gerektirmez ve Pasajlanması
- Matrigel kaplı yemekler hazırlayın. Çözünme bir bir saat boyunca buz üzerinde insan ESC nitelikli Matris şişe ve 25 ml DMEM-F12 ortamı içinde seyreltin. Buz üzerinde her şeyi tutmak ve tüm plakaları ve tüpler önceden soğutulmuş olmasını sağlamak, her 35 mm levha (veya diğer yemekler kullanılması durumunda yüzey alanı başına eşdeğer miktarda) ile 1 ml ekleyin. Alüminyum folyo ile plakalar Kapak.
Not: Matrigel stok konsantrasyonları toplu göre farklılık gösterir. Seyreltme talimatları veri tablosunda gösterilir.
- Gece buz üzerinde plakaları tutmak ve ertesi gün buz kaldırmak. Tabaklar kullanmadan önce bir hafta için buzdolabında kadar tutulabilir.
- MTESR1 tam orta (veya Nutristem orta bir şişe çözülme) ve aşağıdaki tabloya göre H-ESM (insan ESC orta) hazırlayın.
H-ESM Nihai konsantrasyon 500 ml İÇİN Nakavt Serum Yedek (KSR) % 20. 100 mi GlutaMAX 100X 2 mM 5 mi MEM olmayan esansiyel amino asitler 0.1 mM 5 mi Penisilin-Streptomisin 100 U / mL - 0.1 mg / ml ' 5 mi 2-merkaptoetanol 0.1 mM 900 ul B27 Ek - Vitamina olmadan % 1 10 mi N2 desteği % 1 5 mi Nakavt DMEM - 370 ml
Hazır orta en fazla 2 hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Tam büyüme ortamı hazırlamak için, bazik FGF sadece befor ilave edilir20 ng / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda e beslenmesi.
Not: fare embriyonik fibroblastlar şartına H-ESM Komple iPS hücreleri yerine mTESR1 veya Nutristem bir kullanılabilir.
- Pasajlanmasını da öncesinde 30 dakika ile 2 saat boyunca 37 ° C'de bir inkübatör kaplı plakalar yerleştirin.
- Hücreleri izdiham ulaşmamış olsa bile, yaklaşık her 5 gün geçişli olmalıdır. Koloniler dokunmadan edilmemelidir.
- Dispase, 1 ml (1 mg / ml, PBS içinde 10 mg / ml stok erimesi) büyüme ortamı ile değiştirin.
- Çekti cam Pasteur pipetler ile alanları ayırt çıkarın. Çıkarılmalıdır Alanı kolonilerin merkezi bir krater benzeri veya kistik yapıları içerir, ve hücreler haline gelmiştir her alanda koloniler ayrılır ve düzleştirilmiş ve dışa doğru göç gibi görünmektedir.
- Koloni sınırları parlak olur ve (genellikle 5-7 dakika civarında) ayırmak için başlayana kadar bir kültürü kaputu altında 37 ° C'de inkübe edin. Discard dispase. 1 ml H-ESM ile yıkayın ve atın.
- 1 ml H-ESM olarak, hasat koloniler bir hücre kaldırıcı (kazıyıcı spatula gibi) kullanımı ve 15 ml Eppendorf tüp toplamak. 1 ml H-ESM ile durulayın ve tüp ekleyin. 4 dakika 1000 RCF Spin ve süpernatant kaldırmak.
- 1 ml önceden ısıtılmış büyüme ortamı (ya da mTESR1 veya Nutristem) içinde süspanse pelet. Çok fazla kümeleri kesiliyor kaçının - ve aşağı yukarı pipetle az 6-8x daha. Kaç hücre kaplama olması ve 1:5 2 tabak için örneğin gereksiz hücreleri (genellikle 1:4 ile 1:5 seyreltme), kaldırmalısınız belirleyin, 600 ul kaldırmak, daha sonra 1.6 ml taze orta ekleyin.
- Plakalardan Matrigel çıkarın. Yeri hücreleri plaka üzerinde eşit dağıtarak, damla damla. Bu hücreler merkezine doğru hareket etmesine neden olacak gibi, aşırı tüp sallayarak kaçının.
- Plaka arasında 1 mi, orta ve bölme ile tüp yıkayın. Her plaka nihai hacim 1.5 ml -2 olmalıdır.
- Pasajlanması gün sonra hariç, her gün orta değiştirin. Her ne kadaren fazla 2-3 gün pluripotency veya farklılaşma potansiyel etkilemeden son pasaj geçtiyse orta her gün değiştirmek için ideal bir, bu arada bir kez her iki günde bir frekansta değiştirilebilir.
- Hücre hattı dondurulabilir ise, 2 ml pipet ve yerine 1 ml / dondurarak saklamaya uygun vialler ile 1-2 ml mFreSR dondurma ortamı içinde yerine yeniden askıya. -80 Bir cryobox yer şişeleri ° C ve 3-4 gün içinde sıvı azot transfer.
Not: iPS hücreleri, Manual of mikrodiseksiyon bir stereo mikroskop altında gerçekleştirilmelidir. Bu ısıtılmış bir yüzey alanı üzerinde tutulurken, bir stereomikroskop ile entegre bir in vitro fertilizasyon (IVF), iş istasyonu (örneğin KSystem bir IVF Workstation) steril koşullar altında hücrelerin manipülasyonuna olanak sağlar. Bu mevcut değilse, bir stereo düzenli bir laminar akış başlığı altında hareket ettirilebilir.
2. Embriyoid Organları Toplama ve Kardiyak induction
- Aşağıdaki tabloya göre EBM-20 ortamı hazırlayın.
EBM-20 Nihai konsantrasyon 500 ml İÇİN Fetal Bovine Serum (kökeni Güney Amerika) % 20. 100 mi MEM gerekli olmayan amino asitler 0.1 mM 5 mi Penisilin - Streptomisin 100U/ml - 0.1 mg / ml ' 5 mi GlutaMAX 100X 0.1 mM 5 mi 2-merkaptoetanol 50um 450 ul DMEM/F12 - 385 ml
Güney Amerika kökenli FBS kullanımı farklılaşma verim belirlemek için önemlidir: serumun türleri diğer iş etkileyebilirfarklılaşma. 50 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar tam EBM-20, eklentinin askorbik asit (AA) hazırlanması. Tam büyüme ortamında en fazla bir hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir. - Hasat iPS koloniler olarak (adımları 1,6-1,9) yukarıda açıklanan.
- 2 ml pipet ile 1 ml EBM-20 yavaşça tekrar. Çok fazla kümeleri kesiliyor kaçının - stereomicroscope altında koloniler büyüklüğü kontrol, en fazla 2-3x daha aşağı yukarı pipet ve. 1:1 oranında ultra-düşük ek plakalar üzerinde plakası (35 mm yemek için örneğin, bir 6-plaka iyi 1 kullanın). 1 ml EBM-20 ile tüp durulayın ve plaka ekleyin.
Not: kolonilerin boyutu verimlilik ve kalp indüksiyon zamanlaması kontrol farklılaşma etkiler. Homojen boyutlu EBS Agregasyon farklılaşması sırasında gözlenen değişkenliği azaltmak için gösterilmiştir.
- 3. günde, yeniden önlemek için bir mikroskop kullanılarak EBM-20 kez değiştirmekEBS moval. Plaka kenar yakın pipet ve orta kaldırmak tutun.
- 7. günde, anahtar EBS% 0.1 jelatin ve daha önce 30 dakika boyunca 37 ° C'de yerleştirilir ile kaplı plakalar için. Gerekirse, jelatin bir hücre kültürü kaputu altında çıkarıldı ve plakalar bırakılabilir O / N 35 mm tabak başına 35-40 EBS ekleyin.
- Haftada iki kez alanları ve değişim EBM-20 yenerek için EBS kontrol edin. Stereomicroscope altında onlar lokalizasyonu kolaylaştırmak için, dayak alanları çanak kapağının üstünde bulunan nerede işaretleyin. Taahhüt alanlarda yaklaşık 10-20 gün sonra görünmelidir.
- Spontan kasılma olduğu bölgelerde, görünür (yerine% 2 FBS ile, EBM-20 olarak hazırlamak) EBM-2 orta geçiş ve bunları 3. bölümde aşağıda açıklanan izole. Zaman
- Dayak ve dayak alanlar daha fazla deneyler için gerekli olan kadar haftada iki kez orta değiştirmek için diğer alanlarda kontrol etmek için devam edin.
Not: farklılaşma sürecinin Verimliliği oldukça bağımlıdırçeşitli faktörler, hangi en kritik kalp farklılaşma indüklemek için kullanılan özel hücre hatları ve serum olan toplu. En yüksek verimlilik elde etmek için, cardiomyogenic potansiyeli ve serum çeşitli partiler için testi hücre hatları.
3. Alanları İzolasyon ve Kültür Dayak
- Coat 12 oyuklu plakalar (4 cm2 alan) ya da 5 ug / cm 2 fibronektin ile söz konusu plakalar (12 oyuklu plakalar içerisine oyuk başına 300 ul toplam) tamamen tüm yüzeyini kaplamak için yeterli hacimde PBS içinde seyreltilmiştir. Hücre kültürü kaputu ortaya tutmak ve kurumasını bekleyin. Plakalar 4 de sarılmış ve saklanabilir ° CO / N.
- Gerektiğinde bir bardak kullanarak alanı yenerek kaldırmak, Pasteur pipeti ve neşter çekti. 1 ml'lik bir pipet ile fibronektin-kaplı plakalara transfer.
- 1 ml EBM-2 ekleyin.
- Hücreler çıkarıldı alanları gösterir ve orta değiştirmek için plaka çapraz. Diğer alanlarda b başlayabilir olarak plakalar, 1 aya kadar saklanabilirdaha sonra yemek.
Not: Daha küçük yenerek kümeleri gerekli ise küçük parçalar halinde tatili kadar, stereomicroscope altında birkaç kez aşağı Eksplante alanı pipet ve. Bu birkaç dayak hücreleri (film 3) kümeleri ile sonuçlanacaktır.
- Analizler için hazır olana kadar haftada iki kez orta değiştirin.
Not: Bu protokol elde kardiyomiyositleri fetal gibi morfolojik ve fonksiyonel özelliklere sahip, bir yetişkin-benzeri fenotip doğru olgunlaşmasını daha bu hücreleri ayırt etmek için kültür süresi artırılarak elde edilebilir.
4. Tek Dayak Hücreleri İzolasyon ve Analiz
- Coat 2 odacıklı slaytlar (4 cm 2 alan) ya da tüm kültür yüzeyini kapsayacak şekilde yeterli PBS içinde seyreltilmiş 5 mg / cm 2 fibronektin ile diğer uygun destekler. Bir cam destek kullanılırsa, laminin ve fibronektin ile kat (5 ug / cm '> 2 adet) destek.
- Bölüm 3 plakalardan Pasteur pipeti / neşter ile alanı yenerek çıkarın.
- 1 ml'lik bir pipet, inkübasyon sırasında bir kez çalkalama tüpü 500 ul kolajenaz II (Mg, Ca ile PBS içinde 480 U / ml) ve 37 dakika inkübe 15 ° C içeren 15 ml'lik bir tüpe transfer hücrelerin kullanılması.
- 200 ul pipet ile yukarı ve aşağı pipetle. Herhangi kümeleri kalırsa, taze kollajenaz II aktarmak ve adım 4.3 tekrarlayın.
- Hiçbir büyük kümeleri bırakılır kadar adım 4.4 tekrarlayın.
- 3 ml EBM-2 (yok AA) ile kollajenaz inaktive eder. Diğer tüpler hazır olana kadar tüp daha sonra ateşli bir rafa başlık altında bırakılabilir. 4 dakika 1000 RCF santrifüj.
- Süspanse pelet 1 ml% 0.25 5 dakika boyunca 37 ° C 'de tripsin / EDTA (1X PBS içinde% 0.5' lik stok solüsyonlarından seyreltilmiş) ile inkübe edin. Aynı ilk örnekten sindirimler kesirler birleştirin.
- 4 ml EBM-2 (yok AA) ile tripsin inaktive eder. Daha t hiç bir 2.5 ml şırınga bir 18G iğne ile hücre geçmekhan 7x. 4 dakika 1000 RCF santrifüj.
- Tekrar süspansiyon hücre pelet başına iyi ve plaka 1 ml EBM-2. Hücreler 2-3 gün sonra kaplama fonksiyonel ve morfolojik analiz için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çalışmalarımızda biz birkaç iPS hücre hatları CMs oluşturulan. Bu hatlar, başlangıçta bir MEF besleyici tabaka üzerinde oluşturulan ama şimdi tanımlanmış bir ortam (mTESR1 ya da Nutristem) kullanılarak Matrigel yerleştirildi. Çeşitli tahliller, morfolojik özellikleri, pluripotent hücreler tipik markırlerinin (OKT-4, SSEA4 ve TRA1-60) ve bunların genomuna stabilite (Şekil 1) bakımı doğrulamak için kullanıldı.
Kalp soy içine indüksiyon EBS ve serum ve AA (Şekil 2A ve 2B) belirli bir tip varlığında kültürüne iPS hücreleri toplama tetikledi. Sözleşme alanlar (Şekil 2C ve Film 1) Kullanılan hücre hattı bağlı olarak, toplam% 20-35 temsil etmektedir. Taahhüt enzimatik sindirim (Film 2) bu bölgelerden izole CMs tipik kardiyomiyosit yapısal proteinleri (kardiyak troponin, ve alph ifadebir,-sarkomerik aktin,) α ve β miyozin ağır zincirleri, gap junction protein (konneksin-43), ve büyük iyon kanalları (Şekil 2D-2F). Bu hücrelerin elektrofizyolojik analizi atriyal düğüm, ve ventriküler profillerinin (veri ve arkadaşları, SG, Priori, gösterilmemiştir., J. Clin. Yatırım., Basın, 14,15,20 Adet) ile hücreleri oluşan heterojen bir nüfus ortaya.
Şekil 1. Besleyici-ücretsiz iPS hücreleri bakım Matrigel yetişen iPS koloniler faz-parlak kenarları ve belirgin nükleol ile, insan ESC benzeri morfoloji korumak) pluripotency. AB etkilemez. CD) doğru transkripsiyon faktörü OCT-4 ifade iPS hücreleri gösteren İmmünofloresan analizleri (C)ve TRA1'dir-60 yüzey antijeni (ölçek çubukları: 50 um) tanımlanmaktadır. (D) (E) Cytofluorimetric analizi Tipik yüzey Pluripotency antijenleri (SSEA-4 ve TRA1'dir-60) ifadesini teyit etmiştir. Yolluk strateji sol dağılım ile gösterilir. (F) Matrigel yetiştirilen iPS hücreleri Temsilcisi karyotip analizi. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Fonksiyonel iPS-türetilmiş CMs farklılaşma. Farklılaşma protokol A) şematik. Daralmanın bir alan B) iPS hücrelerinden araya embriyoid organları. C) Temsil. D) RT-PCR gösterisiSCN5A - sodyum kanal, voltaj bağımlı, tip V, alfa alt birimi,, KCNQ1 - potasyum voltaj kalsiyum kanal, voltaj bağımlı, alfa 1A alt birimi - iPS-türetilmiş yenerek kümeleri (CACNA1A bazı kalp-spesifik iyon kanalları ifade ing geçişli kanal, alt ailesi gibi KQT, üye 1) ve miyozin ağır zincir (MHC-a ve MHC-b) 'de oluşur. Fetal kalp hücreleri cDNA, bir pozitif kontrol olarak kullanıldı ise herhangi bir ifade, iPS hücreleri belirlenmesini edildi. Gösteren tek CMs yapısal protein α-sarkomerik aktin, kardiyak troponin I (TNNI) ve kalp-özel kavşak konneksin 43 (CNX-43) ifade iPS-türetilmiş. HGPRT temizlik gen olarak kullanılmıştır. EF) immünofloresan boyaması Ölçek çubukları: 50 mikron. Görüntüler Axiovision Zeiss floresan ters bir mikroskop kullanılarak elde ve ImageJ ile analiz edilmiştir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
<strong> Film 1. IPS hücrelerinden elde edilen alan sözleşme. filmi görmek için buraya tıklayın.
Film 2. Bir müteahhitlik alanının enzimatik sindirim elde edilen tek müteahhitlik iPS-türetilmiş CMs,. filmi görmek için buraya tıklayın.
Film 3. Kısmi mekanik diseksiyon ile elde edilen küçük taahhüt küme,. filmi görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pluripotent kök hücreler hatları arasında düşük verimlilik ve yüksek değişkenliği ile de olsa, CMs kendiliğinden ayırt potansiyeline sahiptir. Yeni indüksiyon yöntemlerinin geliştirilmesi bu nedenle sürecinin verimliliğini artırmak ve daha tanımlı protokoller doğru hareket odaklanmıştır. Bununla birlikte, bu yeni farklılaşma yöntemlerin en ayrıntılı kültür koşulları, zamanlama ve reaktif konsantrasyonu iyi kontrol ve pahalı sitokinler ve büyüme faktörleri ile tedavi gerektiren, oldukça karmaşıktır. Ayrıca çeşitli iPS hücre hatları, endojen sitokin sinyal seviyeleri açısından farklılıklar zor genelde her bir hücre hattı için uygun seviyelere ayarlanabilir olmalıdır Sitokin konsantrasyonları, standardize etmek için işlenir.
Elde edilen iPS-türetilmiş CMs olgunlaşması da hastalık modelleme ve ilaç keşfi uygulamalar için iPS hücrelerinin kalp farklılaşma çalışırken dikkate alınması gereken önemli bir yönü temsil eder. Diferansiyeinsan EKH ve iPS hücrelerinin iyon genellikle tamamen olgun bir yapısı olmadan bir fetal fenotip yani ile CMs yol açmaktadır. Tek katlı yaklaşım kullanılır, bu özellikle doğrudur, ve bunun sonucu olarak, bu, üretim yükselterek ve belirli kalp projenitör nüfus 2,3 izole etmek için daha uygundur.
Bu senaryoda, hala yaygın hastalık modelleme amaçlı kullanılan "klasik" EBS toplama yöntemi, daha iyi deneysel ihtiyaçlarına uygun gibi görünüyor. Bu yöntem, basit, ekonomik, kolay uygulanabilir, ve tüm hatları için uygundur. Ek büyüme faktörleri veya sitokinler, için ya da sık sık çok iyi iPS hücreleri tarafından tolere edilmez tek hücreli sindirim için gerek yoktur, aynı zamanda, onlar ROCK inhibitörleri 21 ile ek tedavi gerektirir. Ayrıca, EBS içine toplama bir 3 boyutlu ortamda ve para sağlayan EBS ile, bir pluripotent hücrenin doğal gelişim süreci benzerfizyolojik şartlara daha benzer crine sinyalleri. Ayrıca, AA ilave iPS hücrelerinin kalp farklılaşma geliştirmek için sürekli olarak gösterilmiştir, ve aynı zamanda, yapısal ve işlevsel 18,19 olgunlaşmasını artırmak için. , Serum en uygun toplu seçimi ile birlikte, iPS kendi kardiyojenik potansiyel dayalı hücre hatları seçimi daha CM nesil verimliliğini artırabilir.
Son olarak, burada önerilen yöntem, aynı zamanda fare besleyici hücreleri, fare hücreleri bulaşma olasılığını ortadan kaldırır ve aynı zamanda daha pasajlanmasını iPS hücre ve EBS oluşumu için teknik işlemleri basitleştirir gerekmeyen avantajına sahiptir. Bu yöntem pek çok avantaj bahşeder ve gelecekteki kardiyovasküler rejeneratif tıp uygulamalarına yol açarak, önce teknikleri üzerinde önemli bir gelişme teşkil etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklama yok mali çıkarlarının.
Acknowledgments
BS Milan-Bicocca Yaz Öğrenci Araştırma Eğitim Programı Üniversitesi tarafından desteklenmiştir, araştırma Sağlık ve İtalyan Bakanlığı Eğitim, Üniversite ve GC için Araştırma ve Fondazione Humanitas, İtalyan Bakanlığı fonlarından desteklenen, biz eleştirel okumak için Michael VG Latronico teşekkür el yazması.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| Human ESC-qualified Matrix | BD Biosciences | 354277 | Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C . |
| Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution | Sigma | F0896-2MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| PBS (no Mg and Ca), 10X | Lonza | BE17-515F | |
| PBS (with Mg and Ca), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
| Dispase II, neutral protease, grade II | Roche | 4942078001 | Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca) |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Sigma | T3924 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | 4176 | Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C |
| F–tal Bovine Serum (origin South America) | Invitrogen | 10270-106 | Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C |
| PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
| MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
| N2 supplement, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
| 2-mercapt–thanol | Invitrogen | 31350-010 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma | G1890-100G | Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week |
| Nutristem hESC XF | Stemgent from Biological Industries | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week. |
| mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X) |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Becton Dickinson | 353001 | |
| Cell scraper | Corning Incorporated | 3008 | |
| 12-well plates | Becton Dickinson | 353043 | |
| Permanox 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
| Glass 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
| 6-well plates, ultra-low-attachment surface | Corning Incorporated | 3471 | |
| 18G needle | Becton Dickinson | 304622 | |
| Glass pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| 2.5 ml syringe | Becton Dickinson | 300188 | |
| Equipments | |||
| IVF Workstation | KSystem, by Nikon | ||
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | ||
References
- Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function. Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132, 537-543 (2008).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Yamanaka, S. A fresh look at iPS cells. Cell. 137, 13-17 (2009).
- Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders. Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2012).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).
- Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471, 230-234 (2011).
- Itzhaki, I., et al. Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells. Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).
- Cao, N., et al. Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells. Cell Research. 22, 219-236 (2012).
- Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107, 1912-1916 (2003).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
