Summary
Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.
Abstract
Hier presenteren we een workflow om de metabolische profielen te analyseren voor biologische monsters van belang, met inbegrip, cellen, serum of weefsel. Het monster wordt eerst gescheiden in polaire en niet-polaire fracties met een vloeistof-vloeistof fase-extractie, en gedeeltelijk gezuiverd downstream analyse te vergemakkelijken. Beide waterige (polaire metabolieten) en organische (niet-polaire metabolieten) fasen van de aanvankelijke extractie worden verwerkt tot een groot aantal metabolieten onderzoeken. Metabolieten worden gescheiden door verschillende vloeistofchromatografie methoden gebaseerd op hun partitie eigenschappen. In deze methode presenteren we microflow hoogperformante (UP) LC methoden, maar het protocol is schaalbaar tot hogere stromen en lagere drukken. Inleiding in de massaspectrometer kan via algemene of samengestelde geoptimaliseerde bron voorwaarden. Detectie van een breed scala van ionen wordt in volledige scan mode uitgevoerd in zowel positieve als negatieve wijze over een breed m / z assortiment met een hoge resolutie op een recent calibrated instrument. Label-free differentiële analyse wordt uitgevoerd op bioinformatica platforms. Toepassingen van deze aanpak zijn metabole route screening, de ontdekking van biomarkers en de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Introduction
Als gevolg van recente technologische ontwikkelingen op het gebied van HRMS, hebben ongerichte, hypothese-genererende metabolomics aanpak een haalbare aanpak worden voor de analyse van complexe monsters. 1 massaspectrometers staat 100000 resolutie vergemakkelijken routine lage deel per miljoen (ppm) nauwkeurigheid van massa's zijn op grote schaal te worden beschikbaar zijn van meerdere leveranciers. 2,3 Dit nauwkeurigheid van massa mogelijk maakt grotere specificiteit en het vertrouwen in een voorlopige toewijzing van de identiteit analyt, isotopische patroonherkenning, en adduct identificatie. 4 In combinatie met een geschikte extractiemethode en high-performance LC of UPLC, complexe mengsels kunnen worden geanalyseerd met extra specificiteit afgeleid van retentietijdgegevens. 5 UPLC bezit chromatografische grotere efficiëntie en maakt een grotere gevoeligheid, resolutie en analysetijd die een grotere dekking van de mogelijke metabolome. 6 De resulterende grote datasets kan worden geïntegreerd in elkevan meerdere differentiële analyse software en ontgonnen bruikbare patronen of individueel te bepalen analyten. 7,8,9,10,11 Vermeende treffers kan in eerste instantie worden geïdentificeerd met behulp van een combinatie van piek-detectie-algoritmen, accurate massa gebaseerde chemische formule voorspelling, fragmentatie voorspelling, en chemische zoeken in databanken. Deze aanpak maakt prioritering van doelstellingen voor tijdrovende volledige structurele identificatie of voor de ontwikkeling van gevoeliger en specifieker stabiele isotoop verdunning UPLC / geselecteerde of meerdere reactie bewaking / MS studies dat de huidige gouden standaard methoden voor het kwantificeren zijn. 12
De wisselende aard van de biologische monsters heeft geleid tot optimalisatie van extractie protocollen voor urine 13 cellen 14, 15 serum of weefsel 16. Dit protocoleigenschappen extracties voor cellen, serum en weefsel. In voorkomend geval, zijn commentaar en extra verwijzingen opgenomen voor aanpasgen van de procedure opname van stabiele isotopen pakken, of voor opname van bijzonder onstabiel metabolieten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Staalextractie uit cellen
- Voor een 10 cm plaat van cellen: verzamel 1,5 ml celsuspensie opgeheven in media in een pre-gelabelde 10 ml glazen centrifugebuis. Voor aanhangend lijnen, moeten cellen worden opgeheven met zachte schrapen in 1,5 ml van media op ijs bewaard Optioneel:. Als interne standaarden worden gebruikt, voeg een passende hoeveelheid bij deze stap.
Commentaar: Het doven van de cellulaire stofwisseling is cruciaal voor bepaalde metabolieten. Voor de analyse van tijdgevoelige metabolieten, moeten procedures zoals koude methanol extractie worden overwogen. 17 - Voeg 6 ml chloroform (CHCl3) / methanol (CH3OH) (02:01, v / v) aan elk van de 10 ml glazen buizen met de monsters. Stel de monsters in een shaker of meerdere vortexer op lage snelheid gedurende 30 minuten. Na het schudden worden de monsters gecentrifugeerd met een lage versnelling / vertraging omgeving aan 1935 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om de fasen volledig te scheiden.
Facultatief CHCI3, kan extracties worden uitgevoerd met dichloormethaan (CH 2 Cl 2) 18,12. - Met behulp van een lange steel Pasteur pipet de organische (onderste) laag naar een nieuwe pre-gelabelde 10 ml glazen centrifugebuis. Doorgaan naar 4.1.
- Breng de bovenste waterige later in een schone plastic 2 ml Eppendorf buis. Damp het monster onder stikstofgas. Doorgaan naar 2.6.2 voor waterfase ontzouten of blijven 4.1 voor directe analyse.
2. Staalextractie van Serum
- Breng 20 ul van het serum in een plastic 2 ml Eppendorf buis Optioneel:. Als interne standaarden worden gebruikt, voeg een passende hoeveelheid bij deze stap.
- Voeg 190 ul van CH3OH en vortex gedurende 10 seconden.
- Voeg 380 ul van CHCI3 en vortex gedurende 10 seconden.
- Voeg 120 ui H2O fasescheiding induceren. Vortex de monsters gedurende 10 seconden om de temperatuur op kamertemperatuur gedurende 10min.
- Centrifugeer de monsters bij 8000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om de fasen te scheiden.
- Breng de onderste organische fase in een schone plastic 2 ml Eppendorf buis. Doorgaan naar 4.1.
- Breng de bovenste waterige later in een schone plastic 2 ml Eppendorf buis. Damp het monster onder stikstofgas.
- Resuspendeer de steekproef in 200 ul H 2 O. Zure of basische reagentia (0,1% azijnzuur, mierenzuur of 0,1% ammoniumhydroxide) worden gebruikt om bij voorkeur extraheren pH gevoelige metabolieten. Sonificeer 20 min op ijs om volledig opnieuw te schorten de steekproef.
- Activeer de C18 spinkolommen met 500 ul CH 3 OH.
- Equilibreer de spin kolom met twee wasbeurten van 500 pi H 2 O en laad het monster daarna. Als zuur / base reagens gebruikt houden deze concentratie in de wasstappen.
- Wassen met 500 ul H 2 O aan het monster ontzouten. Nogmaals, als zuur / base reagens gebruikt houden deze concentratie in de wasstappen.
- Elueer met twee volumes van 200 ul 80% CH3OH in H2O in een vooraf gemerkte clean 2 ml Eppendorf buisje. Nogmaals, als zuur / base reagens gebruikt houden deze concentratie in de wasstappen. Doorgaan naar 4.1.
3. Staalextractie van Tissue
- Afhankelijk van het weefsel, gebruikt tussen 10-100 mg van bevroren weefsel. Voeg het hele stuk weefsel met een vooraf gemerkte 2 ml Eppendorf buis vanaf retentie met 1 ml PBS (1 M, pH 6,8) in een ijsbad Optioneel:. Als interne standaarden worden gebruikt, toevoegen aan de buffer, voor het toevoegen het weefsel.
- Homogeniseren het weefsel in ijs met een elektrische weefsel slijpmachine voor 30 sec in elke Eppendorf. Tussen de monsters, reinig het weefsel molen in twee aparte buizen met CH 3 OH-en H 2 O, resp.
- Breng het weefsel homogenaat met een plastic pipet in een pre-gelabelde 10 ml glazen centrifugebuis. Na de overdracht, spoel elke Eppendorfbuis2x met 1 ml CH3OH en voeg de wassingen het weefsel homogenaat in de glazen buizen.
- Voeg 4 ml CHCI3 aan elk van de 10 ml glazen buizen met het weefsel homogenaat en CH3OH wasbeurten. Stel de monsters in een shaker of meerdere vortexer op lage snelheid gedurende 30 minuten.
- Na het schudden, centrifuge de monsters met een lage versnelling / vertraging instelling bij 1935 xg gedurende 10 min om de fasen volledig te scheiden Optioneel:. Om te voorkomen dat met behulp van chloroform, zijn extracties ontwikkeld met CH2 Cl 2.
- Met behulp van een lange steel Pasteur pipet de organische (onderste) laag naar een nieuwe pre-gelabelde 10 ml glazen centrifugebuis. Doorgaan naar 4.1.
- Met behulp van een lange steel Pasteur pipet de waterlaag naar een nieuwe pre-gelabelde 10 ml glazen centrifugebuis. Ga naar 2.6.2 voor ontzouten of blijven 4.1.
4. Opwerveling en Filtratie van Monsters voor UPLC
- Damp het samples onder stikstofgas.
- Reconstitueren drooggedampt monsters in een geschikt volume van de uitgangsoplossing van de UPLC gewenste methode (zie tabel 1). 50-100 pi is meestal een wenselijke resuspenderen volume. Voorzichtig vortex en / of pipet het monster op en neer om te helpen bij het oplossen van de analyten.
- Breng het monster in een 0,22 urn nylon buis filter en centrifugeren op tot 14.000 xg totdat het monster volledig is gepasseerd door het filter (~ 5 minuten). Zorg ervoor dat er geen zichtbare neerslaat nog in de steekproef.
- Breng de bovenstaande van het gefilterde monster in een pre-gelabeld UPLC flacon met insert. Cap vial, en veeg het flesje om eventuele luchtbellen uit de onderkant van het monster flesje te verwijderen. Plaats het monster in de gekoelde autosampler (4-5 ° C).
5. UPLC Setup
- Met behulp van de besturingssoftware voor de vloeistofchromatograaf, maak een run voor de biologische steekproef gebaseerd off van de in genoemde voorwaarden
- Laat de UPLC om adequaat evenwicht. Dit moet onder meer een volledige priming van oplosmiddelen voordat u een kolom, en naar aanleiding van aanwijzingen van de fabrikant voor evenwicht volume van een nieuwe kolom (meestal 3-5 kolom volumes). Houden een logboek van het starten weer druk om eventuele toekomstige problemen.
6. Massaspectrometer Setup
- Met de besturingssoftware voor de hoge resolutie massaspectrometer, een positieve modus wordt gebruikt bij de in tabel 2 vermelde omstandigheden. Vervolgens met behulp van dezelfde voorwaarden, maak een negatieve modus methode Optioneel:. Als een reeks bekende doelanalyten zijn van hoge interest, optimaliseren bron en optiek zware omstandigheden met behulp van gelabelde analoog van deze verbindingen, en het genereren van een werkwijze met deze voorwaarden.
- Reinigen en kalibreren van het instrument, een stabiele spuiten in de spectrometer, en voldoende tijd voor de kalibratie-oplossing om adequaat te verdrijven uit de bron en optica. De stabiliteit van de spray moet geven van een 3-5% RSD van intensiteit over minstens 100 scans met een injectie van kalibratie-oplossing op hetzelfde debiet als de LC-methode wordt gebruikt.
- Stel de volgorde voor alle monsters, vaststellen van een passende injectie volume, en uitvoeren van een blanco voordat het eerste monster. Indien overdracht of matrix effecten tussen monsters worden verdacht, gerund adequate blanks / wasbeurten. Monsters moeten worden ingesteld in een gerandomiseerde wijze met behulp van een random number generator en een sleutel tot een batch effecten geïntroduceerd door analyse te vermijden.
Reactie: Kwaliteitscontrole monsters waaronder stabiele isotoop normen of analytische normen van waarschijnlijke doelwitten kunnen zijnuiterst waardevol in het oplossen van problemen en het garanderen van betrouwbare, reproduceerbare en betrouwbare resultaten. Een technische overgenomen van een standaard enkel monster gevolgd door een oplosmiddel blanco kan worden gebruikt om toegang deviatie van signaalintensiteit en retentietijd, alsmede overdracht in de blanco run. - Begin volgorde en periodiek te controleren op problemen, waaronder drukschommelingen, of het verlies van de signaalsterkte over de run. Indien ernstige problemen worden gedetecteerd, stopt de run, en herhaal van 6,2.
7. Differentiële analyse
- Twee workflows worden gepresenteerd voor dit protocol. De eerste is via ZEEF 2.0, merkgebonden label-free differentiële analyse software verkocht door Thermo Fisher. De tweede workflow is via XCMS Online, een gratis platform door Scripps Research Institute. 11 Voor het begin van differentiële analyse, handmatig de TICs controleren of kijk op gefilterd chromatogrammen voor enige bekende verbinding in het monster om reproduceerbaarheid van runs zorgenen injectie / UPLC / spuitnevel stabiliteit in alle monsters.
- ZEEF
- Breng het. Ruwe data bestanden van de massaspectrometer om de harde schijf van het werkstation waar ZEEF is geïnstalleerd. (Opmerking: lopen ZEEF met gegevens die zijn opgeslagen op een netwerk-of USB-poort aangesloten schijf is niet aan te raden omdat het de snelheid van de analyse kunnen beperken.)
- Open ZEEF, en beginnen aan een nieuw experiment.
- Laad het juiste bestanden in ZEEF.
- Toewijzen vergelijkingsgroepen en selecteer een referentiebestand om ZEEF om de parameters voor analyse te genereren.
- Volg de aanwijzingen en eventuele parameters per eisen van elk individueel experiment aan te passen. Het is vaak raadzaam om te beginnen met strenge parameters en ga dan terug en draai de parameters als guller instellingen kunnen analyse te verlengen.
- Laad de juiste adduct lijst voor positieve of negatieve wijze in de parameters.
- XCMS Online
- Bestanden converterenin een aanvaardbaar formaat voor XCMS Online. In ons geval, zetten we op formaat mzXML. 19
- Open XCMS Online, en Job maken.
- Upload en noem datasets. Slechts twee datasets (bv. controle versus behandeling) kunnen worden geladen als XCMS stand-alone beperkt tot head-to-head vergelijkingen.
- Selecteer de gewenste instellingen uit de lijst drop-down. Vooraf ingevulde parameters zijn beschikbaar voor verschillende instrumenten opstellingen, en deze kunnen verder worden aangepast voor experimentele behoeften. In ons geval gebruiken we de HPLC-Orbi2 instellingen.
- Indienen en bevestig baan.
- Data Analysis
- Voor ZEEF en XCMS een lijst met frames en functies, respectievelijk zal worden bevolkt zodra de analyse is voltooid. Zorg ervoor dat de LC uitlijning overlapt elke landmark pieken. Als een van de niet aangepaste LC runs blijkt grote afwijking in landmark pieken kan dit een probleem zijn met het monster aan te geven.
Optioneel: Voor ZEEF, als interne standaarden worden gebruikt, te lokaliserende corresponderende maximale groep en normaliseren om het geselecteerde kader. Voor XCMS On-line, kan normalisatie worden gedaan in een spreadsheet na uitvoer. - Plot de gegevens door variatiecoëfficiënt (CV) binnen een als steekproef populatie (bv. controlemonsters). Elke grote CV-waarden mogelijk een probleem met een of meer sample aan te geven. Sorteer de lijst op basis van gewenste eigenschappen (bijvoorbeeld p-waarde <0,05, Fold Change> 1.5, lage standaardafwijking binnen een groep, enz.).
- Onderzoekt elke piek voor een passende piek afstemming tussen groepen, peak integratie, Gaussische piek vorm, intensiteit van het signaal, isotopen, en adduct opdracht.
- Exporteren van gegevens naar wens voor verdere analyse of om gerichte massa lijsten voor bevestiging en MS n experimenten genereren.
- Voor ZEEF en XCMS een lijst met frames en functies, respectievelijk zal worden bevolkt zodra de analyse is voltooid. Zorg ervoor dat de LC uitlijning overlapt elke landmark pieken. Als een van de niet aangepaste LC runs blijkt grote afwijking in landmark pieken kan dit een probleem zijn met het monster aan te geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gepresenteerde resultaten tonen geselecteerde gegevens uit een 6-uur behandeling van SH-SY5Y glioblastoma cellen met het bestrijdingsmiddel en mitochondriaal complex I remmer rotenone. Kortheidshalve wordt alleen de organische fase positieve modus gepresenteerde gegevens. De monsters werden verwerkt en geanalyseerd zoals hierboven beschreven (Figuur 1, Tabel 1, Tabel 2) en aangebracht op twee differentiële analyseplatforms voor label-free kwantificering ZEEF en XCMS online. Hoewel een groot aantal hits (Figuur 2, Figuur 3) worden geïdentificeerd door de twee programma's gebruikt voor differentiële analyse van deze functies zijn waarschijnlijk artefacten, slecht geïntegreerde pieken, en andere kenmerken van twijfelachtige analytische waarde. Dit kan worden beoordeeld door het screenen van de treffers voor juiste intensiteit van het signaal, lage variatie tussen de monsters van dezelfde groep, achtergrond niveaus en goede chromatografiepiek vormen (Figuur 3).
Om de downstre demonstrerenOns bevestiging van initiële hits isoleren we een functie met een massa die overeenkomt met onze behandeling verbinding rotenon binnen 3 ppm (Figuur 3, Figuur 4). Wij bevestigen de identiteit van deze analyt met UPLC-HR/tandem massaspectrometrie (MS / MS) van onze steekproef en de zuivere verbinding (figuur 5). Wij identificeren ook een differentieel overvloedige functie verlaagd in het rotenone behandelde groep, voorlopig geïdentificeerd als D-pantethine door accurate massa zoeken in databanken (Figuur 3).
Figuur 1. Algemene Experimentele Outline voor Sample Voorbereiding en analyse door Microspray UPLC-HRMS. Een algemeen overzicht van monstervoorbereiding, inclusief de facultatieve invoering van de interne normen en eiwit of lipide / eiwitgehalte analyse. Fasescheiding vloeistofchromatografie en analyse met verschillende ion modes in de massaspectrometer worden geschetst.
Tabel 1. UPLC Voorwaarden. Algemene en samengestelde geoptimaliseerde UPLC voorwaarden. Voor organische fase 1, constante stroomsnelheid van 1,8 ul / min door een Waters C18 nanoACQUITY BEH130 kolom bewaard in een verwarming bij 35 ° C werd toegepast. Oplosmiddel A: 99.5% water/0.5% acetonitril met 0,1% mierenzuur, Oplosmiddel B: 98% acetonitril / 2% water met 0,1% mierenzuur Voor organische fase 2, constant debiet van 3,4 pl / min via een Acentis Express C8 kolom bewaard in een verwarming bij 35 ° C werd toegepast. Oplosmiddel A: 40% water/20% acetonitril met 0,1% mierenzuur en 10 mM ammoniumformiaat, Oplosmiddel B: 90% isopropanol/10% acetonitril met 0,1% mierenzuur en 10 mM ammoniumformiaat Voor de waterige fase constant debiet 1.2 μ l / min door een Waters C18 nanoACQUITY BEH130 kolom bewaard in een verwarming bij 35 ° C werd toegepast. Oplosmiddel A: 95% water / 5% methanol met 0,1% ammoniumhydroxide, Oplosmiddel B: 95% methanol / 5% water met 0,1% ammoniumhydroxide.
Figuur 2. Spiegel Plot Generated met XCMS. Een spiegel plot toont differentieel overvloedige functies zoals gedetecteerd en gekwantificeerd door middel XCMS online bij de organische fase positieve modus UPLC-MS analyse. Elke stip vertegenwoordigt een duidelijke 'functie. " Groene stippen zijn functies overvloediger (groter geïntegreerd gebied) in de controlegroep, terwijl rode stippen zijn meer aanwezig in de behandeling. Toenemende grootte van de stip geeft toenemende omvang van de vouw verandering tussen de groepen, en de intensiteit van de kleur geeft een afnemende p-waarde met toenemende verzadiging van kleur.
Figuur 3. Analyte Peaks. Chromatogrammen toont de organische fase positieve ionmodus UPLC-MS analyse. A) Gecorrigeerde (geharmoniseerde) Totale ionenstroom (TIC) van ZEEF 2.0. B) Geëxtraheerde ionenchromatogram voor de functie voorlopig geïdentificeerd als D-pantethine door XCMS. C ) Geëxtraheerde ionenchromatogram voor de functie die later geïdentificeerd als rotenone uit ZEEF. D) XIC voor de functie die later geïdentificeerd als rotenone van ZEEF genormaliseerd tot TIC. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
pg "/>
Figuur 4. . Database Search Results Database treffers voor A) Human metabolome Database ( http://www.hmdb.ca ) en B) Farmacotherapeutisch Kompas / KEGG (via ZEEF) (Farmacotherapeutisch Kompas alleen kan ook worden gebruikt - http://www.chemspider.com ) met nauwkeurige massa bepalingen voor de functies getoond in figuren 3B, 3C en 3D overeenkomt met de ionen met m / z 555,2516 en 395,1481 gebaseerd op de identificatie van deze ionen [MH] + species. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 5. HR / MS / MS Structural Bevestiging. Bevestiging van de identificatie van de functie die overeenkomt met het ion bij 395.1481 m / z met een retentietijd van 23,22 min als rotenone gebaseerd op UPLC-MS/MS vergelijking met een commerciële standaard met A) vergelijkbare retentietijd en B) dezelfde m / z (395.1481, ~ 0 ppm fout) met bijna identieke fragmentatie. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
| Massaspectrometrie Parameter | Instellen | Commentaar |
| Bron | ESI | Michrom CaptiveSpray |
| Ion Model | Positief of negatief | |
| Methode Lengte | Variabele (~ 40-60 min) | |
| Resolutie | 60.000-100.000 | |
| Spray (kV) | 1.75 | |
| Buis Lens (V) | 130 | Target Verbinding Dependent |
| Capillaire Temperatuur (° C) | 250 | Kan de levensduur van de spuittip verkorten |
| Capillaire Voltage (V) | 50 | Target Verbinding Dependent |
| Gegevens | Zwaartepunt | (Voor profiel data, zie Overleg) |
Tabel 2. MS-instellingen. Algemeen en compound geoptimaliseerd massaspectrometer instellingen gebruikt voor het LTQ XL-Orbitrap met een Michrom Thermo Advance captive spuiten ESI bron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ongerichte metabolomics biedt een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van endogene of lichaamsvreemde biotransformaties, of het vastleggen van een metabool profiel van een steekproef van belang. De uitgang van de techniek schalen met de resolutie en de gevoeligheid van de gebruikte te scheiden en analyseren van het monster, het vermogen om te gaan met de grote datasets gegenereerd technologie, en de mogelijkheid om de dataset voor nuttige informatie (bv. accurate massa zoeken in databanken) delven. Onlangs, werd dit vergemakkelijkt door de vooruitgang in hoge resolutie massaspectrometers en high-of ultra-HPLC. Differentiële analyse software is gericht analyse bottleneck, en kan piekdetectie correctie voor retentietijd verschuivingen, filteren en statistische analyse met hoge doorvoer. 20,21,22 Selectie van de juiste informatica pijplijn bereiken moet ook overwegingen betreffende data centroiding algoritmen, piekdetectie, piek-integratie, alignment, het vermogen om MS / MS gegevens te integreren, en het vermogen om te gaan met isotopen of adducten. 23 De keuze van geschikte cheminformatica databases moet ook worden overwogen. 24,25,26,27 De huidige ontoereikendheid van een bepaalde database om uitvoerig verbindingen te identificeren en te integreren accurate massa gegevens, MS / MS data, of LC data blijft een groot probleem in het veld.
De workflow hier gepresenteerde integreert vloeistof-vloeistof extractie, micro-stroom vloeistof chromatografie, en hoge resolutie massaspectrometrie met twee verschillende differentiële analyse software platforms aangetoond in een celcultuur behandeling model. Daarnaast worden extractieprotocollen vermeld voor serum en weefsel, omdat deze kunnen dienen als nuttige monsters voor soortgelijke analyse.
Hoewel elke methode die wordt gebruikt voor het ongerichte metabolomics moet worden geoptimaliseerd voor herhaalbaarheid, stabiele UPLC voorwaarden, en de bron stabiliteit, wat variatie is onvermijdelijk. Zowel ZEEF en XCMS allow correctie voor retentietijd shift, maar bijzondere aandacht moet worden besteed om ervoor te zorgen dat de in het experiment parameters voldoende zijn om de variatie te corrigeren. Ook kan stabiele isotoop gemerkte interne standaard (s) eenvoudig worden geïntegreerd in deze procedure aan artefacten en inter-sample variatie wordt veroorzaakt door verschillen in de steekproef extracties of LC-MS-analyse te verminderen. 12 Zoals bij alle gevoelige LC-MS methode, is het cruciaal om reagentia van hoge zuiverheid te gebruiken, en ervoor zorgen dat de monstervoorbereiding verwijdert ongewenste deeltjes of aggregaat. Artefacten kunnen worden gegenereerd door de normale variatie van verontreinigingen, en kan het wenselijk zijn om te bevestigen dat vermeende treffers in feite niet overal verontreinigingen van de extractie of analyseproces.
Tenslotte, alhoewel de werkwijze wordt aangeduid als "irrelevante" of "onpartijdige 'metabolomics, dit is een deel verkeerde benaming. De aard van de winning, de scheiding en analyse zal metabolieten bevoordelen met bepaalde kenmerkentics zoals stabiliteit tijdens de extractie interactie met stationaire en mobiele fasen tijdens scheiding en ionisatie bij de bron van de massaspectrometer. 28,29,30 Afhankelijk van de beschikbare instrumentatie, kan deze procedure worden aangepast aan verschillende extracties, debieten, drukken LC , ionenbronnen, of massaspectrometers. Daarom hebben we ook noten in de procedure in bepaalde omstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd op basis van algemene kennis of interne standaarden vertegenwoordiger van een klasse van moleculen van interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen de steun van NIH beurzen P30ES013508 en 5T32GM008076. We danken ook Thermo Scientific voor de toegang tot ZEEF 2.0 en Drs. Eugene Ciccimaro en Mark Sanders van Thermo Scientific voor nuttige discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O'Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
