Summary
Нецелевые метаболомика предоставляет гипотезы генерации снимок метаболический профиль. Этот протокол будет продемонстрировать выделения и анализа метаболитов из клетки, сыворотка, или ткани. Целый ряд метаболитов опрошенных с использованием жидкостной экстракции жидкой фазы, микропотока UltraPerformance жидкостной хроматографии / высокое разрешение масс-спектрометрии (UPLC-HRMS), соединенный с дифференциальным программного обеспечения для анализа.
Abstract
Здесь мы представляем рабочий процесс для анализа метаболических профилей для биологических образцов, представляющих интерес, включая, клетки, сыворотка, или ткани. Образец сначала разделяют на полярных и неполярных фракций путем жидкостно-жидкостной экстракции, и частично очищенный для облегчения ниже анализа. Обе водные (полярные метаболиты) и органические (неполярные метаболитов) фазы первоначальной экстракции обрабатываются для обследования широкого спектра метаболитов. Метаболиты отделены друг от различных методов жидкостной хроматографии на основе их свойств раздела. В этом методе, приведем микропотоке ультра-производительность (UP) LC методы, но протокол является масштабируемой более высоких потоков и низком давлении. Введение в масс-спектрометр может быть достигнуто путем общего или соединение оптимизированных условиях источника. Обнаружение широкого спектра ионов осуществляется в режиме полного сканирования как положительные, так и отрицательные режиме в широком м / з диапазон при высоком разрешении на недавно Calibrated инструмента. Без наклеек дифференциальный анализ осуществляется на платформах биоинформатики. Применение этого подхода включают метаболические пути скрининга, биомаркеров и разработки лекарственных препаратов.
Introduction
В связи с последними технологическими достижениями в области HRMS, нецелевого, гипотезу генерирующих метаболомика подходы стали осуществимый подход к анализу сложных образцов. 1 Масс-спектрометры, способные 100000 резолюцию облегчения рутинной нижней части на миллион (промилле) масса точности стали широко доступны от различных поставщиков. 2,3 Эта масса точность позволяет более конкретно и уверенность в проведении предварительных работ анализируемого идентичности, изотопного распознавания образов, и аддукт идентификации. 4 В сочетании с соответствующей процедурой добычи и высокопроизводительных LC или UPLC, сложных смесей могут быть проанализированы с дополнительной спецификой, полученные из данных времени удерживания. 5 UPLC обладает большей эффективностью и хроматографические обеспечивает большую чувствительность, разрешение и анализ времени, делая более широкий охват метаболом возможно. 6 Полученные больших объемов данных может быть интегрирован в любоймножественных программного обеспечения для анализа дифференциальных и добывают на полезную модель или отдельных интерес аналитов. 7,8,9,10,11 Предполагаемые хитов может быть первоначально определены с использованием комбинации пик алгоритмов обнаружения, точное предсказание на основе массы химической формулой, фрагментация предсказания, и химические поиска в базах данных. Такой подход позволяет приоритетных целей для трудоемких полной структурной идентификации или в целях развития более чувствительными и более конкретные стабильной изотопного разбавления UPLC / или несколько выбранных для мониторинга реакций / MS исследований, которые в настоящее время являются золотым стандартом методы количественной оценки. 12
Различной природы биологических образцов привело к оптимизации добычи протоколы для мочи 13, 14 клетки, сыворотка 15 или ткань 16. Этот протокол экстракции функции для клетки, сыворотка, и ткани. В случае необходимости, замечания и дополнительные ссылки были включены для модификацииных процедуру для решения включения стабильных изотопов, а также для включения особенно нестабильный метаболитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Экстракции образцов из клеток
- Для 10 см пластины клеток: собирают 1,5 мл клеточной суспензии поднимается в средствах массовой информации в предварительно меченных 10 мл центрифужную пробирку стекла. Для прилипшие линии, клетки должны быть сняты с нежным соскоб в 1,5 мл среды выдерживали на льду Необязательно. Если внутренний используются стандарты, добавляют соответствующие аликвоты на этом шаге.
Комментарий: Тушение клеточный метаболизм имеет решающее значение для определенных метаболитов. Для анализа срочных метаболиты, такие процедуры, как холодного отжима метанола должны быть рассмотрены. 17 - Добавить 6 мл хлороформа (CHCl 3) / метанол (СН 3 ОН) (2:1, об / об) в каждой из 10 мл стеклянные пробирки, содержащие образцы. Установка образцов в шейкере или несколькими Вортекс на низкой скорости в течение 30 минут. После встряхивания, образцы центрифугировали при низком ускорения / замедления установки в 1935 х г в течение 10 мин при 4 ° С до полного разделения фаз.
Необязательный 3, удаление зубов может быть проведено с дихлорметане (CH 2 Cl 2) 18,12. - Использование длинной ножке пипетки Пастера перенести органический (внизу) слой на новый предварительно меченных 10 мл центрифужную пробирку стекла. Продолжайте 4.1.
- Передача верхнюю водную позже в чистую пластиковую 2 мл трубки Эппендорф. Выпаривают образца в атмосфере азота. Продолжайте 2.6.2 для обессоливания водной фазе или продолжать 4.1 для прямого анализа.
2. Экстракции образцов из сыворотки
- Передача 20 мкл сыворотки в пластиковый 2 мл трубки Эппендорф Дополнительно:. Если внутренние стандарты используются, добавьте соответствующую аликвотой на этот шаг.
- Добавить 190 мкл CH 3 OH и вихревые течение 10 сек.
- Добавить 380 мкл хлороформа 3 и вихрь в течение 10 сек.
- Добавить 120 мкл H 2 O, чтобы вызвать разделение фаз. Вихревые образцов в течение 10 сек и позволить, чтобы уравновесить при комнатной температуре в течение 10минута
- Центрифуга образцов при 8000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для разделения фаз.
- Передача нижнюю органическую фазу в чистую пластиковую 2 мл трубки Эппендорф. Продолжайте 4.1.
- Передача верхнюю водную позже в чистую пластиковую 2 мл трубки Эппендорф. Выпаривают образца в атмосфере азота.
- Повторное приостановить образца в 200 мкл H 2 O. Кислота или основание реагентов (0,1% уксусная кислота, муравьиная кислота или 0,1% гидроксида аммони), могут быть использованы для извлечения предпочтительно рН-чувствительные метаболитов. Обрабатывают ультразвуком в течение 20 мин на льду повторно приостанавливать образец полностью.
- Активируйте C18 спин колонок с 500 мкл CH 3 OH.
- Равновесие спин колонки с двумя промывками 500 мкл H 2 O, а затем загрузить образца. Если кислота / основание используются реагенты поддерживать эту концентрацию в промывания.
- Промыть 500 мкл H 2 O для обессоливания образца. Опять же, если кислота / основание реагенты используются поддерживать эту концентрацию в стиркешагов.
- Элюировать двумя объемами 200 мкл 80% CH 3 OH в H 2 O в предварительно меченных чистого 2 мл пробирку Эппендорфа. Опять же, если кислота / основание реагенты используются поддерживать эту концентрацию в промывания. Продолжайте 4.1.
3. Экстракции образцов из ткани
- В зависимости от ткани, использование в пределах 10-100 мг замороженной ткани. Добавить целого куска ткани на предварительно меченных 2 мл трубки низкой удержание Эппендорфа с 1 мл PBS (1 М, рН 6,8) в бане со льдом Дополнительно:. Если внутренний используются стандарты, добавить его в буфер, перед добавлением ткани.
- Однородный ткани во льду электрический шлифовальный станок ткани в течение 30 сек в каждом Эппендорф. Между образцов, очистить ткань дробилки в двух отдельных пробирках, содержащих CH 3 OH и H 2 O, соответственно.
- Передача гомогената ткани с пластиковой пипеткой в предварительно меченных 10 мл центрифужную пробирку стекла. После передачи, промыть каждую пробирку Эппендорф2x с 1 мл CH 3 OH и добавить промывок в гомогената ткани в стеклянных трубках.
- Добавить 4 мл CHCl 3 в каждой из 10 мл стакан пробирки, содержащие гомогената ткани и CH 3 OH стирок. Установка образцов в шейкере или несколькими Вортекс на низкой скорости в течение 30 минут.
- После встряхивания, центрифуги образцов с низким ускорением / замедлением обстановке в 1935 мкг в течение 10 минут, чтобы полностью отделить фаз Дополнительно:. Чтобы избежать использования хлороформа, удаление зубов были разработаны с CH 2 Cl 2.
- Использование длинной ножке пипетки Пастера перенести органический (внизу) слой на новый предварительно меченных 10 мл центрифужную пробирку стекла. Продолжайте 4.1.
- Использование длинной ножке пипетки Пастера перенести водный слой на новый предварительно меченных 10 мл центрифужную пробирку стекла. К 2.6.2 для обессоливания или продолжать 4.1.
4. Re-подвески и фильтрации образцов для UPLC
- Выпаривают SAMPле в атмосфере азота.
- Развести образцы высушивали в соответствующий объем исходного раствора для требуемого UPLC метода (см. таблицу 1). 50-100 мкл обычно желательно ресуспендирования объема. Аккуратно вихревой и / или пипетки образца вверх и вниз, чтобы помочь в растворении веществ.
- Передача образца в 0,22 мкм нейлоновый фильтр трубки и спин со скоростью до 14000 мкг, пока образец полностью не проходит через фильтр (~ 5 мин). Убедитесь, что нет никаких видимых осадков, оставшихся в образце.
- Передача супернатант из отфильтрованного образца в предварительно меченных UPLC флакон с вставкой. Крышка ампулы, а затем щелкают флакон для удаления пузырьков из нижней части пузырек. Поместите образец в охлажденном автоматический пробоотборник (4-5 ° C).
5. UPLC установки
- Использование программного обеспечения для управления жидкостный хроматограф, создать перспективы для органического образца основаны от условий, перечисленных в
- Разрешить UPLC адекватно равновесие. Это должно включать в себя полный курс первичной растворителей перед установкой колонки, и следуя инструкциям производителя для уравновешивания объемов новый столбец (обычно 3-5 объема колонки). Ведет журнал отшатывающийся давления для диагностики проблем в будущем.
6. Настройка Масс-спектрометр
- С помощью управляющего программного обеспечения для высоких масс-спектрометра разрешение, создать положительный метод режиме с использованием условий, перечисленных в таблице 2. Затем с помощью тех же условиях, создать негативный метод режиме Дополнительно:. Если известный набор целевых аналитов отличаются высоким десятичногоересть, источник оптимизировать и оптика условиях с использованием тяжелой меченый аналог этих соединений, а также генерировать метод с использованием этих условиях.
- Очистите и калибровки прибора, создание стабильного распыления в спектрометр, и дать время для калибровочного раствора адекватно рассеивать от источника и оптики. Приемлемые стабильность распылитель должен дать 3-5% RSD интенсивности по меньшей мере, 100 сканирований с впрыском калибровочного раствора при той же скорости потока, как метод ЖХ используется.
- Настройка последовательности для всех образцов, установите соответствующий объем инъекции, и запустить пробел перед первым образцом. Если перенос или матричные эффекты между образцами подозреваемых, запустите адекватной заготовок / стирок. Образцы должны быть установлены в случайным образом с помощью генератора случайных числе и ключ, чтобы избежать любой партии эффектов, вносимых анализа.
Комментарий: Контроль качества образцов, включая стабильную стандартам изотопа или аналитических стандартов вероятные цели может бытьчрезвычайно ценный в устранении неполадок и обеспечения надежной, воспроизводимые и достоверные результаты. Технических повторных стандартного только образец последующим растворитель заготовка может быть использован для доступа отклонение интенсивности сигнала и времени удерживания, а также перенос на холостой ход. - Начало последовательности и периодически контролировать для проблем, включая колебания давления или потери интенсивности сигнала через перспективе. Если серьезные проблемы обнаруживаются, остановитесь в бегах, и повторите с 6,2.
7. Дифференциальный анализ
- Два рабочих процессов представлены для этого протокола. Во-первых, через сито 2.0, фирменного наименования без дифференциального анализа программного обеспечения, продаваемого по Thermo Fisher. Второй рабочий процесс Xcms через Интернет, свободную платформу через Scripps Research Institute. 11 Перед началом дифференциального анализа, вручную проверить ТЭП или смотреть на отфильтрованный хроматограммы для любого известного соединения в образце для обеспечения воспроизводимости работаети инъекции / UPLC / аэрозоль стабильности во всех образцах.
- SIEVE
- Перенесите файл. Файлов исходных данных из масс-спектрометра на жестком диске рабочей станции, где установлен сито. (Примечание: работает сито с данными, хранящимися на сетевом или USB порт, подключенный диск не рекомендуется, поскольку это может ограничить скорость анализа.)
- Открытое решето, и начать новый эксперимент.
- Загрузите соответствующий файлов в сито.
- Назначение групп сравнения и выбрать один файл справки, чтобы SIEVE для формирования параметров для анализа.
- Следуйте инструкциям и настроить любые параметры в соответствии с требованиями каждого отдельного эксперимента. Часто бывает целесообразно начать с строгим параметрам, а затем вернуться и ослабьте параметры более щедрой настройки может удлинить время анализа.
- Загрузите правильный список аддукт для положительного или отрицательного в режиме параметров.
- Xcms Интернет
- Конвертация файловв приемлемый формат для Xcms Интернет. В нашем случае, мы преобразовать в формат mzXML. +19
- Открытое Xcms Интернет и создания рабочих.
- Загрузить и назовите наборов данных. Только два набора данных (например, контроль против лечения) можно загружать также Xcms автономный ограничено голова к голове сравнения.
- Выберите нужные установки из выпадающего списка. Предварительно заполненные параметры доступны для различных установок приборов, и они могут быть дополнительно модифицированы для экспериментальных потребностей. В нашем случае, мы используем ВЭЖХ-Orbi2 настройки.
- Отправить и подтвердить работу.
- Анализ данных
- Для сито и Xcms списка кадров и особенности, соответственно, будет заполняться только анализ завершен. Убедитесь, что выравнивание LC перекрывает любые достопримечательностью пиков. Если любой из трасс невыровненное LC показать большое отклонение в основополагающих пики это может указывать на проблемы с образцом.
Дополнительно: Для сито, если внутренние стандарты используются, найдитесоответствующей группы пика и нормализовать к выбранному кадру. Для Xcms он-лайн, нормализация может быть сделано в виде электронной таблицы после экспорта. - Участок данных коэффициента вариации (КВ) в течение как выборочной совокупности (например, контрольные образцы). Любой больших значений CV может указывать на проблему с одним или более образца. Сортировка списка на основе желаемых признаков (например, значение р <0,05, кратное изменение> 1,5, низкое стандартное отклонение в группе и т.д.).
- Исследуйте каждый пик пик соответствующую ориентацию в разных группах, пик интеграции, гауссовский пик формы, интенсивность сигнала, изотопов, а аддукт назначение.
- Экспорт данных в соответствии с пожеланиями для дальнейшего анализа или генерировать целевой массы списки для подтверждения и MS N экспериментов.
- Для сито и Xcms списка кадров и особенности, соответственно, будет заполняться только анализ завершен. Убедитесь, что выравнивание LC перекрывает любые достопримечательностью пиков. Если любой из трасс невыровненное LC показать большое отклонение в основополагающих пики это может указывать на проблемы с образцом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Приведенные результаты показывают, выбранные данные из 6-часового лечения SH-SY5Y клеток глиобластомы с пестицидами и митохондриального комплекса I ингибитор ротенон. Для краткости только органическую фазу положительные данные режима представлен. Образцы были обработаны и проанализированы, как описано выше (рис. 1, таблица 1, таблица 2) и наносили на двух платформах дифференциального анализа для наклеек количественное, сито и Xcms онлайн. Несмотря на большое количество хитов (рис. 2, рисунок 3) можно определить по двум программам используется для дифференциального анализа этих особенностей являются артефактами вероятно, плохо интегрированные пики, и другие особенности аналитическую ценность сомнительна. Об этом можно судить путем скрининга хиты для соответствующей интенсивности сигнала, низкий различия между образцами той же группы, фоновые уровни, и хорошие формы хроматографического пика (рис. 3).
Чтобы продемонстрировать downstreутра подтверждение начальной хиты, мы выделяем функцию с массой, соответствующей нашему лечению соединением ротенон в 3 промилле (рис. 3, рисунок 4). Мы подтверждаем, личность этого аналита с UPLC-HR/tandem масс-спектрометрии (MS / MS) нашего образца и чистого соединения (рис. 5). Мы также определить дифференциально обильные функция уменьшена в ротенон обработанной группы, предварительно определены как D-пантетин путем поиска по базе данных точных масс (рис. 3).
Рисунок 1. Общие экспериментальные Наброски для подготовки и анализа проб на Microspray UPLC-СУП. Общий план подготовки проб, в том числе введение дополнительных внутренних стандартов и белкового или липидного / анализа содержания белка. Разделение фаз, жидкостная хроматография и анализ различных юн мод в масс-спектрометр описаны.
Таблица 1. UPLC условия. Общие и соединения оптимизированный UPLC условиях. Для органической фазы 1, постоянной скорости потока 1,8 мкл / мин с помощью воды nanoACQUITY C18 BEH130 колонке хранится в нагреватель при 35 ° С был использован. Растворитель А: 99,5% water/0.5% ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислоты, растворитель В: 98% ацетонитрил / 2% воды с 0,1% муравьиной кислоты для органической фазы 2, постоянной скорости потока 3,4 мкл / мин через колонку Acentis экспресс-C8 хранится в нагреватель при 35 ° С был использован. Растворитель А: 40% water/20% ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислоты и 10 мМ формиата аммония, растворитель В: 90% isopropanol/10% ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислоты и 10 мМ формиат аммония для водной фазы, постоянной скорости потока 1,2 μ л / мин через воды nanoACQUITY C18 BEH130 колонке хранится в нагреватель при 35 ° С был использован. Растворитель A: 95% воды / 5% метанола с 0,1% гидроксида аммония, растворитель В: 95% метанол / 5% воды с 0,1% гидроксида аммония.
Рисунок 2. Зеркало земля, созданные с Xcms. Зеркала график, показывающий дифференциально обильные функции, как обнаружены и количественно через Xcms онлайн из органической фазы режиме положительного UPLC-MS анализа. Каждая точка представляет собой явное "особенность". Зеленые точки функции более обильные (больше интегрированной области) в контрольной, в то время как красные точки, более богатые в лечении. Увеличение размера точка указывает ростом величины кратное изменение между группами, и интенсивность цвета указывает на уменьшение р-значение с увеличением насыщенности цвета.
Рисунок 3. Аналит Пикс. Хроматограммы показывает органическую фазу положительного иона режиме UPLC-MS анализа.) С поправкой (ровно) Всего ионного тока (TIC) от SIEVE 2.0. Б), извлекаемые ионная хроматограмма для функции предварительно определены как D-пантетин через Xcms. C ) извлеченного ионного хроматограмм для функции как впоследствии выяснилось, ротенон от сита. D) XIC для функции как впоследствии выяснилось, ротенон от SIEVE нормированы на TIC. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
PG "/>
Рисунок 4. . Данных Результаты поиска хиты для баз данных) База данных человека метаболом ( http://www.hmdb.ca ) и В) ChemSpider / KEGG (через сито) (ChemSpider только и может быть также использован - http://www.chemspider.com ) с помощью точного определения массы для признаков, показанных на рис 3B, 3C, 3D и соответствующие ионы м / з 555,2516 и 395,1481 основан на выявлении этих ионов [МН] + видов. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 5. HR / MS / MS Structural подтверждения. Подтверждение идентификации особенность соответствующий ион 395.1481 м / з с временем удерживания 23,22 мин, как ротеноном на основе UPLC-MS/MS сравнении с коммерческим стандартом с), аналогичные времени удерживания и B), те же м / з (395.1481, ~ 0 млн ошибка) с почти идентичными фрагментации. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
| Масс-спектрометрия Параметр | Установка | Комментировать |
| Источник | ESI | Michrom CaptiveSpray |
| Ионной модели | Положительный или отрицательный | |
| Метод длина | Переменный (~ 40-60 мин) | |
| Разрешение | 60,000-100,000 | |
| Спрей (кВ) | 1,75 | |
| Труба Объектив (V) | 130 | Целевое соединение Зависимые |
| Капиллярная температура (° C) | 250 | Может сократить жизнь распылительного наконечника |
| Капиллярные напряжение (V) | 50 | Целевое соединение Зависимые |
| Тип данных | Центроида | (Для профиля данных, см. Обсуждение) |
Таблица 2. MS Настройки. Общие и оптимизации настроек соединения масс-спектрометр, используемый для LTQ XL-Orbitrap с Advance Michrom Thermo плен источника ESI спрея.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нецелевые метаболомика предлагает мощный инструмент для исследования или эндогенных ксенобиотиков биотрансформациях, или захвата метаболический профиль из образца интерес. Выход техники весы с разрешением и чувствительностью от технологии, используемой для разделения и анализа образца, способность иметь дело с большими наборами данных генерируется, а также возможность добывать набора данных за полезную информацию (например, поиска по базе данных точной массы). В последнее время это была облегчена благодаря прогрессу в масс-спектрометров высокого разрешения и высокой или ультра-жидкостной хроматографии. Программное обеспечение дифференциальный анализ обратилась анализ узкое место, и может выполнить обнаружение пика регулировки для сохранения временных сдвигов, фильтрации и статистический анализ с высокой пропускной способностью. 20,21,22 Выбор надлежащей трубопровод информатике должно включать соображения в отношении данных centroiding алгоритмов Обнаружение пиков, пик интеграции, alignmenт, возможность интеграции MS / MS данные и способности иметь дело с изотопами или аддукты. 23 Выбор соответствующих баз данных Cheminformatics также должны быть рассмотрены. 24,25,26,27 сегодняшней неадекватности какой-либо определенной базы данных идентификации соединений, всесторонне и интегрировать точные данные массы, MS / MS данные или данные LC остается главной проблемой в этой области.
Рабочий процесс представленные здесь интегрирует жидкостно-жидкостной экстракции, микро-поток жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии высокого разрешения с двумя различными дифференциального анализа программных платформ продемонстрирована в лечении модели культуры клеток. Кроме того, добыча протоколы перечислены для сыворотки крови и ткани, так как они могут служить полезным образцов для подобного анализа.
Хотя любой метод, используемый для нецелевых метаболомика должен быть оптимизирован для повторяемость, стабильность UPLC условий, а источник стабильности, некоторые вариации неизбежно. Оба сито и Xcms аллоW коррекции для сохранения временной сдвиг, но особое внимание следует уделять обеспечению того, параметры, установленные в эксперименте адекватны исправить вариации. Кроме того, стабильный изотоп помечены внутренний стандарт (ы) может быть легко интегрирован в эту процедуру для уменьшения искажений и между образцом изменение вызвано различием в образце экстракции или ЖХ-МС анализа. 12 Как и во всех чувствительных ЖХ-МС методологии, важно использовать реагенты высокой чистоты, и убедитесь, что пробоподготовки удаляет нежелательные твердые частицы или совокупности. Артефакты могут быть получены путем нормальное изменение в загрязнений и может быть желательно, чтобы подтвердить, что предполагаемый хитов на самом деле не вездесущий загрязнений процесса экстракции или анализа.
Наконец, хотя метод помечен как "нецелевой" или "объективной" метаболомике это частичное неправильным. Характер извлечения, разделения и анализа будет способствовать метаболитов с определенным характеристикамтики, включая стабильность при добыче, взаимодействие со стационарной и мобильной фазы при разделении и ионизации в источнике масс-спектрометра. 28,29,30 В зависимости от доступного оборудования, эта процедура может быть адаптирован к различным экстракций расхода, давления LC , ионные источники, или масс-спектрометры. Таким образом, мы включили ноты в процедуре определенных условий могут быть оптимизированы на основе общих знаний или внутренних стандартов представитель класса молекул, представляющих интерес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы признаем поддержке грантов NIH P30ES013508 и 5T32GM008076. Мы также благодарим Thermo Scientific для доступа к SIEVE 2.0 и доктора. Евгений Ciccimaro и Марк Сандерс Thermo Scientific за полезные обсуждения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O'Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
