Summary
Vilkårlige metabolomikk gir en hypotese generere øyeblikksbilde av en metabolsk profil. Denne protokollen vil demonstrere ekstraksjon og analyse av metabolitter fra celler, serum eller vev. En rekke metabolitter blir kartlagt ved hjelp av væske-væske-fase ekstraksjon, microflow UltraPerformance væskekromatografi / høy-oppløsnings masse-spektrometri (UPLC-HRMS) koblet til differensial-analyse-programvare.
Abstract
Her presenterer vi en arbeidsflyt for å analysere de metabolske profilene for biologiske prøver av interesse, inkludert; celler, serum eller vev. Prøven blir først separert i polare og ikke-polare fraksjoner ved en væske-væske-fase ekstraksjon, og delvis renset for å lette genetisk analyse. Begge vandige (polare metabolitter) og organiske (ikke-polare metabolitter) faser ved den første ekstraksjon blir behandlet for å undersøke et bredere spekter av metabolitter. Metabolitter er atskilt med forskjellige væskekromatografi fremgangsmåter basert på deres skillevegger egenskaper. I denne metoden, presenterer vi microflow ultra-ytelse (UP) LC metoder, men protokollen er skalerbar til høyere strømmer og lavere trykk. Innføring i massespektrometer kan være gjennom enten generelle eller sammensatte optimaliserte kilde forhold. Påvisning av et bredt utvalg av ioner blir utført i fullt scan mode i både positiv og negativ modus over en bred m / z rekkevidde med høy oppløsning på en nylig calibrated instrument. Label-free differensial analysen er utført på bioinformatikk plattformer. Søknader med denne tilnærmingen er metabolismen screening, biomarkører, og narkotika utvikling.
Introduction
På grunn av de siste teknologiske fremskritt innen HRMS, har vilkårlige, hypotese-genererende metabolomics tilnærminger bli en mulig tilnærming til analyse av komplekse prøver. En massespektrometre stand til 100.000 oppløsning tilrettelegge rutine lave delen per million (ppm) masse nøyaktighet har blitt allment tilgjengelig fra flere leverandører. 2,3 Denne massen nøyaktighet gir større spesifisitet og tillit i en foreløpig tildeling av analytt identitet, isotopiske mønstergjenkjenning, og adduct identifikasjon. 4 Når dette kombineres med en passende ekstraksjonsmetode og høy ytelse LC eller UPLC, komplekse blandinger kan analyseres med ekstra spesifisitet avledet fra oppholdstid data. 5 UPLC besitter større kromatografisk effektivitet og gir større følsomhet, oppløsning og analyse tid på å lage en større dekning av metabolome mulig. 6 De resulterende store datasett kan integreres i ethvertav multippel differensial analyse programvare og minelagt for nyttige mønstre eller individuelle analytter av interesse. 7,8,9,10,11 Antatte treff kan først identifisert ved hjelp av en kombinasjon av peak algoritmer, nøyaktig mass basert kjemiske formelen prediksjon, fragmentering prediksjon, og stoffkartoteket søk. Denne tilnærmingen gjør prioritering av målene for tidkrevende komplett strukturell identifikasjon eller for utvikling av mer sensitiv og mer spesifikk stabile isotoper fortynning UPLC / valgte eller flere reaksjon overvåking / MS studier som er dagens gullstandard metoder for kvantifisering. 12
Det varierende innholdet av biologiske prøver har ført til optimalisering av ekstraksjonsmetoder for urin 13, 14-celler, 15 serum, vev eller 16.. Denne protokollen har ekstraksjoner for celler, serum og vev. Der det er hensiktsmessig, har kommentarer og ytterligere referanser er inkludert for modificasjoner av prosedyren for å ta inkludering av stabile isotoper, eller for inkludering av spesielt ustabile metabolitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Sample Utvinning fra Cells
- For en 10 cm plate av celler: samle 1,5 ml løftet cellesuspensjon i mediet i en pre-merket 10 ml glass sentrifugerør. For adherente linjer, bør cellene løftes med forsiktig skraping i 1,5 ml av mediet holdes på is. Valgfritt: Hvis interne standarder benyttes, tilsette en egnet alikvot på dette trinnet.
Kommentar: Quenching av cellenes stoffskifte er avgjørende for visse metabolitter. For analyse av tidsfølsomme metabolitter, bør prosedyrer som for eksempel kald metanol ekstraksjon vurderes. 17. - Tilsett 6 ml kloroform (CHCl 3) / metanol (CH3OH) (2:1, v / v) til hver av de 10 ml glassrør som inneholder prøvene. Sett prøvene i en shaker eller multi-vortex på lav hastighet i 30 min. Etter risting, blir prøvene sentrifugert med en lav akselerasjon / retardasjon innstilling ved 1935 xg i 10 min ved 4 ° C for å fullstendig separere fasene.
Valgfritt 3, kan ekstraksjon utføres med diklormetan (CH 2 Cl 2) 18,12. - Ved hjelp av en lang stamme Pasteur pipette, overføre den organiske (nederst) laget til en ny pre-merket 10 ml glass sentrifugerøret. Fortsett til 4.1.
- Overfør den øvre vandige senere i en ren plast-2 ml Eppendorf-rør. Fordamp prøven under nitrogen gass. Fortsett til 2.6.2 for vandige fasen avsalting eller fortsette til 4.1 for direkte analyse.
2. Sample Utvinning fra Serum
- Overfør 20 pl av serum i et plast-2 ml Eppendorf-rør. Valgfritt: Hvis interne standarder benyttes, tilsette en egnet alikvot på dette trinnet.
- Legg 190 mL av CH3OH og virvle i 10 sek.
- Legg 380 mL av CHCl 3 og vortex i 10 sek.
- Legg 120 mL H 2 O for å indusere fase separasjon. Vortex prøvene i 10 sek og la til stabilisering ved RT i 10min.
- Sentrifuger prøvene ved 8000 xg i 10 min ved 4 ° C for å separere fasene.
- Overfør den nedre organiske fase inn i en ren plast-2 ml Eppendorf-rør. Fortsett til 4.1.
- Overfør den øvre vandige senere i en ren plast-2 ml Eppendorf-rør. Fordamp prøven under nitrogen gass.
- Re-suspendere prøven i 200 mL H 2 O. Syre eller base reagenser (0,1% eddiksyre, maursyre eller 0,1% ammoniumhydroksyd) kan brukes for å trekke ut fortrinnsvis med pH-følsomme metabolitter. Sonicate for 20 min på isen for å re-suspendere prøven helt.
- Aktiver C18 spin kolonner med 500 ul CH 3 OH.
- Stabilisere den spin kolonne med to vasker av 500 mL H 2 O og deretter laste prøven. Hvis syre / base reagenser brukes opprettholde denne konsentrasjonen i vask trinn.
- Vask med 500 mL H 2 O for å avsalte prøven. Igjen, hvis syre / base reagensene brukes opprettholde denne konsentrasjonen i vasktrinn.
- Eluer med to volumer av 200 ul 80% CH3OH i H2O til en pre-merket ren 2 ml Eppendorf-rør. Igjen, hvis syre / base reagensene brukes opprettholde denne konsentrasjon i vasketrinnet. Fortsett til 4.1.
3. Sample Utvinning fra Tissue
- Avhengig av vev, bruk mellom 10-100 mg av frosset vev. Tilsett helt stykke vevet til en pre-merket 2 ml lav retensjon Eppendorf rør med 1 ml PBS (1 M, pH 6,8) i et isbad. Valgfritt: Hvis interne standarder benyttes, legge den inn i bufferet, før tilsetning vevet.
- Homogeniser vev i isen med en elektrisk tissue grinder i 30 sekunder i hver Eppendorf. Mellom prøvene, rengjøre vev jeksel i to separate rør som inneholder CH 3 OH-og H 2 O, henholdsvis.
- Overfør vev homogenat med en plastpipette inn i en pre-merket 10 ml glass sentrifugerør. Etter overføringen, skyll hver Eppendorf tube2x med 1 ml CH3OH og tilsett vaskinger til vevs-homogenat i glass-rør.
- Tilsett 4 ml CHCl 3 til hver av de 10 ml glassrør inneholdende vev homogenat og CH3OH vaskinger. Sett prøvene i en shaker eller multi-vortex på lav hastighet i 30 min.
- Etter risting, sentrifuger prøvene med lav akselerasjon / retardasjon innstilling på 1935 xg i 10 min å fullstendig skille fasene. Valgfritt: Hvis du vil unngå å bruke kloroform, har utdrag blitt utviklet med CH 2 Cl 2.
- Ved hjelp av en lang stamme Pasteur pipette, overføre den organiske (nederst) laget til en ny pre-merket 10 ml glass sentrifugerøret. Fortsett til 4.1.
- Ved hjelp av en lang stamme Pasteur-pipette, overføres det vandige lag i et nytt pre-merket 10 ml glass sentrifugerør. Gå til 2.6.2 for avsalting eller fortsette til 4,1.
4. Re-fjæring og filtrering av prøver for UPLC
- Fordampe samples under nitrogen gass.
- Rekonstituere tørket ned prøvene i et passende volum av utgangsoppløsningen for ønsket UPLC-metoden (se tabell 1). 50-100 pl er vanligvis en ønskelig resuspensjon volum. Forsiktig vortex-og / eller pipette kan prøven opp og ned for å hjelpe til med å løse opp analytter.
- Overfør prøven i et 0,22 um filter og nylon rør sentrifugering ved opp til 14 000 xg til prøven helt har passert gjennom filteret (~ 5 min). Pass på at det ikke er noen synlige utfellinger igjen i prøven.
- Overfør supernatanten av den filtrerte prøven inn i en pre-labeled UPLC ampulle med innsats. Cap ampulle og knips mot ampullen for å fjerne eventuelle bobler fra bunnen av prøven ampullen. Plasser prøven i kjølt autosampler (4-5 ° C).
5. UPLC Setup
- Bruke programvare for den væskekromatograf, lage en kjøre for det organiske prøven basert off av de forholdene som er nevnt i
- La UPLC til tilstrekkelig likevekt. Dette bør inkludere en full grunning av løsemidler før du fester en kolonne, og følge produsentens anvisninger for likevekt volumet av en ny kolonne (vanligvis 3-5 kolonnevolumer). Vedlikeholde en logg over starter tilbake press for å bidra til å diagnostisere fremtidige problemer.
6. Massespektrometer Setup
- Ved hjelp av kontrollprogramvaren for den høye oppløsning massespektrometer, skape en positiv modus metode ved anvendelse av betingelsene angitt i tabell 2.. Deretter bruker de samme forhold, skape en negativ modus metode. Valgfritt: Hvis et kjent sett av målet analytter er av høy interest, optimalisere kilde og optikk forhold ved hjelp av den tunge merket analog av disse forbindelsene, og generere en fremgangsmåte ved hjelp av disse forhold.
- Rengjør og kalibrere instrumentet, etablere et stabilt spray inn i spektrometer, og gi tid for kalibrering løsning til tilstrekkelig forsvinne fra kilden og optikk. Akseptabel stabilitet av spray bør gi en 3-5% RSD av intensitet over minst 100 skanninger med injeksjon av kalibrerings-løsning ved den samme strømningshastighet som den LC metode som brukes.
- Sett opp sekvensen for alle prøvene, sette passende injeksjon volum, og kjøre en tom før den første prøven. Hvis carryover eller matrix effekter mellom prøvene er mistenkt, kjøre tilstrekkelige blanks / vasker. Prøver bør settes opp i en randomisert måte ved hjelp av en tilfeldig nummer generator og en nøkkel for å unngå eventuelle batch effekter introdusert av analysen.
Kommentar: Kvalitet kontrollprøver inkludert stabile isotopen standarder eller analytiske standarder på sannsynlige mål kan væresvært verdifull i feilsøking og sikre pålitelige, reproduserbare, og gyldige resultater. En teknisk replikat av en standard eneste prøven fulgt av en oppløsningsmiddel-blindprøve kan brukes for å tilgang til avvik av signal intensitet og retensjonstid, samt overføring i det tomme løp. - Begynn sekvens og overvåke jevne mellomrom for problemer, inkludert trykkvariasjoner eller tap av signal intensitet over kjøringen. Dersom det oppstår alvorlige problemer blir oppdaget, stoppe kjøringen, og gjenta fra 6.2.
7. Differential Analysis
- To arbeidsflyt presenteres for denne protokollen. Den første er gjennom SIEVE 2.0, proprietær label-free differensial analyse programvare som selges av Thermo Fisher. Den andre arbeidsflyten er gjennom XCMS Online, en gratis plattform gjennom Scripps Research Institute. 11. Før du begynner differensial analyse, manuelt sjekke tics eller se på filtrerte chromatograms for noen kjent forbindelse i utvalget for å sikre reproduserbarhet av løyperog injeksjon / UPLC / spray stabilitet gjennom alle prøvene.
- SIEVE
- Overfør. Rådatafilene fra massespektrometer til harddisken på arbeidsstasjonen der SIEVE er installert. (Merk: kjører SIEVE med data som er lagret på et nettverk eller USB-port tilkoblet stasjonen er ikke tilrådelig som det kan begrense hastigheten på analysen.)
- Åpen SIEVE, og begynne et nytt eksperiment.
- Laste de nødvendige filene inn SIEVE.
- Tildele sammenlikningsgrupper og velg en eneste referanse filen slik at SIEVE å generere parametrene for analyse.
- Følg instruksjonene og justere alle parametre per krav ethvert individ eksperiment. Det er ofte lurt å starte med strenge parametere og deretter gå tilbake og løsne parametrene som flere sjenerøse innstillinger kan forlenge analysen tid.
- Legg riktig adduct liste for positiv eller negativ modus i parametrene.
- XCMS Online
- Konverter filertil et akseptabelt format for XCMS Online. I vårt tilfelle, konverterer vi å mzXML format. 19.
- Åpne XCMS Online, og Opprett Job.
- Last opp og navngi datasett. Bare to datasett (f.eks Control vs Treatment) kan lastes opp som XCMS frittstående er begrenset til head-to-head sammenligninger.
- Velg ønskede innstillinger fra nedtrekkslisten. Pre-befolkede parametere er tilgjengelig for ulike instrumentering oppsett, og disse kan endres ytterligere for eksperimentelle behov. I vårt tilfelle, bruker vi HPLC-Orbi2 innstillinger.
- Send inn og bekreft jobb.
- Data Analysis
- For sil og XCMS en liste av rammer og funksjoner, henholdsvis, vil bli fylt når analysen er fullført. Kontroller at LC justering overlegg eventuelle landemerke topper. Hvis noen av de unaligned LC går viser store avvik i landemerke topper dette kan indikere et problem med prøven.
Valgfritt: For SIEVE, hvis interne standarder blir brukt, finnden tilsvarende topp-gruppen og normaliseres til den valgte rammen. For XCMS On-line, kan normalisering gjøres i et regneark etter eksport. - Plotte dataene ved variasjonskoeffisienten (CV) i løpet av en lignende populasjonsutvalg (f.eks kontrollprøver). Noen store CV verdier kan indikere et problem med en eller flere utvalg. Sortere listen basert på ønskede egenskaper (f.eks p-verdi <0,05, Fold Endre> 1,5, lavt standardavvik i en gruppe, etc).
- Undersøke hver topp for riktig peak justering på tvers av grupper, peak integrasjon, Gaussian topp form, signal intensitet, isotoper, og adduct oppdrag.
- Eksportere data som ønsket for videre analyse eller for å generere målrettede masse lister for bekreftelse og MS n eksperimenter.
- For sil og XCMS en liste av rammer og funksjoner, henholdsvis, vil bli fylt når analysen er fullført. Kontroller at LC justering overlegg eventuelle landemerke topper. Hvis noen av de unaligned LC går viser store avvik i landemerke topper dette kan indikere et problem med prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene som presenteres viser utvalgte data fra en 6-timers behandling av SH-SY5Y glioblastoma celler med plantevernmidler og mitokondrie-komplekset Jeg inhibitor rotenon. For korthets skyld blir bare den organiske fase positive virkemåte data presentert. Prøvene ble behandlet og analysert som beskrevet ovenfor (figur 1, tabell 1, 2 Table) og lastet opp på to differensialanalyse plattformer for label-free kvantifisering, sil og XCMS online. Selv om et stort antall treff (figur 2, figur 3) er identifisert av de to programmene som brukes for differensial analyse disse funksjonene inkluderer sannsynlige gjenstander, dårlig integrerte topper, og andre funksjoner av tvilsom analytisk verdi. Dette kan bli dømt ved screening treff for riktig signal intensitet, lav variasjon mellom prøver av samme gruppe, bakgrunn nivåer, og gode kromatografiske peak figurer (figur 3).
For å demonstrere downstream bekreftelse av innledende treff, isolerer vi et trekk med en masse svarende til vår behandlingsmiddelet rotenon innen 3 ppm (figur 3, figur 4). Vi bekrefter identiteten til denne analytten med UPLC-HR/tandem massespektrometri (MS / MS) i vårt utvalg og den rene sammensatte (figur 5). Vi har også identifisere et differensielt rikelig funksjon redusert i rotenon behandlede gruppen, forsøksvis identifisert som D-pantethine ved nøyaktig masse databasesøk (figur 3).
Figur 1. Generell Experimental Outline for prøveopparbeidelse og analyse av Microspray UPLC-HRMS. En generell oversikt over prøveopparbeidelse, inkludert den valgfrie innføring av interne standarder og protein eller lipid / protein innholdsanalyse. Faseseparasjon væske-kromatografi, og analyse av forskjellig ion moduser i massespektrometer er skissert.
Tabell 1. UPLC betingelser. Generelle og sammensatte optimaliserte UPLC forhold. For organisk fase 1, konstant mengde 1,8 mL / min gjennom en Waters nanoACQUITY C18 BEH130 kolonne holdt i en ovn ved 35 ° C ble brukt. Løsemiddel A: 99,5% water/0.5% acetonitril med 0,1% maursyre, Løsningsmiddel B: 98% acetonitril / 2% vann med 0,1% maursyre For organiske fase 2, konstant strømningshastighet på 3,4 mL / min gjennom Acentis Express C8 kolonne holdt i en ovn ved 35 ° C ble benyttet. Løsemiddel A: 40% water/20% acetonitril med 0,1% maursyre og 10 mM ammoniumformiat, Løsningsmiddel B: 90% isopropanol/10% acetonitril med 0,1% maursyre og 10 mM ammoniumformiat for den vandige fase, konstant strømningshastighet på 1,2 μ l / min gjennom en Waters C18 nanoACQUITY BEH130 kolonne holdt i en ovn ved 35 ° C ble benyttet. Løsemiddel A: 95% vann / 5% metanol med 0,1% ammoniumhydroksid, Løsningsmiddel B: 95% metanol / 5% vann med 0,1% ammoniumhydroksyd.
Figur 2. Mirror Plot generert med XCMS. Et speil plott som viser forskjellig rikelig med funksjoner som oppdaget og kvantifisert gjennom XCMS nettet fra den organiske fasen positiv modus UPLC-MS analyse. Hver prikk representerer en distinkt "-funksjon." Grønne prikker er funksjoner mer rikelig (større integrert område) i kontrollgruppen, mens røde prikker er mer rikelig i behandlingen. Økende størrelse av dot indikerer økende størrelsen av foldendring mellom gruppene, og intensiteten av fargen indikerer en avtagende p-verdi med økende metning av farge.
Figur 3. Analyttvarianter Peaks. Kromatogrammene viser den organiske fasen positiv ion modus UPLC-MS analyse. A) Korrigert (justert) Total ion strøm (TIC) fra SIEVE 2.0. B) hentet Ion Kromatogram for funksjonen forsøksvis identifisert som D-pantethine gjennom XCMS. C ) hentet Ion Kromatogram for funksjonen senere identifisert som rotenon fra SIEVE. D) XIC for funksjonen senere identifisert som rotenon fra SIEVE normalisert til TIC. Klikk her for å se større figur .
pg "/>
Figur 4. . Database Søkeresultater Database treff for A) Menneskelig Metabolome Database ( http://www.hmdb.ca ) og B) ChemSpider / KEGG (via SIEVE) (ChemSpider alene kan også være ansatt - http://www.chemspider.com ) ved hjelp av nøyaktige massen bestemmelser for de funksjonene som er vist i figur 3B, 3C og 3D tilsvarer ioner av m / z 555,2516 og 395,1481 basert på identifisering av disse ionene som [MH] + arter. Klikk her for å se større figur .
Figur 5. HR / MS / MS Structural bekreftelse. Bekreftelse av identifikasjon av funksjonen tilsvarer ion ved 395.1481 m / z med en retensjonstid på 23,22 minutter som rotenon basert på UPLC-MS/MS sammenligning med en kommersiell standard med A) lik oppholdstid og B) de samme m / z (395.1481, ~ 0 ppm feil) med nesten identisk fragmentering. Klikk her for å se større figur .
| Massespektrometri Parameter | Innstilling | Kommentar |
| Source | ESI | Michrom CaptiveSpray |
| Ion Model | Positiv eller negativ | |
| Metode Lengde | Variabel (~ 40-60 min) | |
| Oppløsning | 60,000-100,000 | |
| Spray (kV) | 1,75 | |
| Tube Lens (V) | 130 | Target Compound Avhengig |
| Kapillær Temperatur (° C) | 250 | Kan forkorte livet av dysen |
| Kapillær Spenning (V) | 50 | Target Compound Avhengig |
| Datatype | Tyngdepunktet | (For Profil data, se diskusjon) |
Tabell 2. MS innstillinger. Generelle og sammensatte optimalisert massespektrometer innstillinger brukes til LTQ XL-Orbitrap med en Michrom Thermo Advance fange spray ESI kilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vilkårlige metabolomikk tilbyr et kraftig verktøy for å undersøke endogene eller xenobiotic biotransformasjoner, eller fange en metabolsk profil fra et utvalg av interesse. Utgangen av teknikken skalaer med oppløsning og sensitivitet av teknologien som brukes for å separere og analysere prøven, evnen til å håndtere de store datasett som genereres, og evnen til å utvinne datasett for nyttig informasjon (f.eks nøyaktig masse databasesøk). Nylig har dette vært tilrettelagt av fremskritt i høy oppløsning massespektrometre, og høy eller ultra-væskekromatografi. Differential analyse programvare har adressert analyse flaskehals, og kan oppnå toppdeteksjon justering for oppholdstid skift, filtrering, og statistisk analyse med høy gjennomstrømming. 20,21,22 Valg av riktig informatikk rørledningen bør inneholde betraktninger som til data centroiding algoritmer, spissregistrering, peak integrasjon, alignment, evne til å integrere MS / MS data, og evne til å håndtere isotoper eller addukter. 23. Valg av riktige cheminformatics databaser bør også vurderes. 24,25,26,27 Den nåværende utilstrekkelighet av en bestemt database til omfattende identifisere forbindelser og integrere nøyaktige masse data, MS / MS data, eller LC data er fortsatt et stort problem i feltet.
Arbeidsflyten presenteres her integrerer væske-væske ekstraksjon, mikro-flow væske-kromatografi, og høyoppløselig massespektrometri med to forskjellige differensial analyse software plattformer vist i en cellekultur behandling modell. I tillegg er ekstraksjonsmetoder oppført for serum og vev, da disse kan tjene som nyttige prøver for tilsvarende analyse.
Selv om enhver metode som brukes for vilkårlige metabolomics skal være optimalisert for repeterbarhet, stabile UPLC forhold, og kilde stabilitet, er noe variasjon uunngåelig. Både SIEVE og XCMS allow korreksjon for oppbevaring time shift, men spesiell oppmerksomhet bør rettes for å sikre at de parameterne som er angitt i forsøket er tilstrekkelig til å rette variasjon. Også, kan stabile isotoper merket intern standard (s) lett kan integreres i denne prosedyren for å redusere artefakter og inter-sample variasjon forårsaket av forskjeller i utvalget utdrag eller LC-MS analyse. 12. Som med all sensitiv LC-MS metode, er det avgjørende å bruke høy renhet reagenser, og sørge for at prøveopparbeidelse fjerner uønsket partikler eller samlet. Artifakter kan genereres av den normale variasjon i forurensninger, og det kan være ønskelig å bekrefte at putative treff i virkeligheten ikke allestedsnærværende forurensninger ved ekstraksjon eller analyseprosessen.
Til slutt, selv om fremgangsmåten er merket som "uønskede" eller "objektiv" metabolomikk, er dette en delvis villedende. Naturen av avstamning, separasjon, og analysen vil favorisere metabolitter med visse kjennetegntics inkludert stabilitet under utvinning, samspill med stasjonære og mobile faser i løpet av separasjon, og ionisering ved kilden til massespektrometer. 28,29,30 Avhengig av tilgjengelige instrumenter, kan denne prosedyren tilpasses forskjellige utdrag, gjennomstrømning, LC press , ionekilder eller massespektrometre. Derfor har vi tatt notater i prosedyren hvor visse vilkår kan optimaliseres basert på generell kunnskap eller interne standarder representant for en klasse av molekyler av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner støtte fra NIH tilskudd P30ES013508 og 5T32GM008076. Vi takker også Thermo Scientific for tilgang til SIEVE 2.0 og Drs. Eugene Ciccimaro og Mark Sanders av Thermo Scientific for nyttige diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O'Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
