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Neuroscience

एक Published: May 17, 2013 doi: 10.3791/50435
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Robert Wood Johnson Medical School, University of Medicine and Dentistry of New Jersey

Summary

हम कृमि में amylopathies के पहलुओं का अध्ययन करने के तरीकों का वर्णन

Abstract

Amylopathy समय के साथ ऊतकों में amyloid बीटा के असामान्य संश्लेषण और संचय (Aβ) का वर्णन है कि एक शब्द है. Aβ अल्जाइमर रोग (ई.) की एक बानगी है और Lewy शरीर मनोभ्रंश, समावेशन शारीरिक Myositis और मस्तिष्क amyloid वाहिकारुग्णता 1-4 में पाया जाता है. Amylopathies उत्तरोत्तर समय के साथ विकसित करना. इस कारण से कम lifespans के साथ साधारण जीवों इन शर्तों की आणविक पहलुओं को स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं. यहाँ, हम कीड़ा Caenorhabditis एलिगेंस का उपयोग कर Aβ की मध्यस्थता neurodegeneration के अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है. इस प्रकार, हम वयस्क hermaphrodites की syncytial जननग्रन्थि में डीएनए एन्कोडिंग मानव Aβ 42 इंजेक्शन द्वारा ट्रांसजेनिक कीड़े का निर्माण. Transformant लाइनों एक mutagenesis के प्रेरित एकीकरण द्वारा स्थिर रहे हैं. कृमि उनके अंडे इकट्ठा करने और बोने से सिंक्रनाइज़ उम्र के हैं. Aβ 42 व्यक्त न्यूरॉन्स के समारोह (उपयुक्त व्यवहार assays में परीक्षण किया है कीमोटैक्सिस परखएस). भ्रूण से प्राप्त प्राथमिक neuronal संस्कृतियों व्यवहार डेटा के पूरक हैं और विरोधी apoptotic यौगिकों के neuroprotective प्रभाव का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जाता है.

Introduction

Amyloid बीटा (Aβ) β और γ secretases 1 से amyloid प्रोटीन अग्रदूत (एपीपी) के अनुक्रमिक दरार के बाद बनाई है कि 36-43 अमीनो एसिड की एक पेप्टाइड है. γ secretase Aβ पेप्टाइड सी टर्मिनल अंत प्रक्रियाओं और अपने चर लंबाई 5 के लिए जिम्मेदार है. Aβ का सबसे सामान्य रूप Aβ 40 और Aβ 42, और अधिक सामान्यतः इस तरह के विज्ञापन के रूप में 5 वैकृत शर्तों के जुड़े होने के बाद के हैं. उच्च सांद्रता Aβ फार्म β पत्र पर कि amyloid तंतु 6 के लिए फार्म का कुल. तंतु जमा न्यूरॉन्स आसपास बूढ़ा सजीले टुकड़े का मुख्य घटक हैं. सजीले टुकड़े और प्रसारण, गैर पट्टिका Aβ oligomers, दोनों Aβ के अंतर्निहित रोगजनक रूपों का गठन करने के लिए लगा रहे हैं.

न्यूरोनल amylopathies की प्रयोगशाला अध्ययन के समय के साथ कि इन शर्तों के प्रगति तथ्य से जटिल है. इसलिए, यह importan हैचूहों के साथ छोटे जीवन काल के लिए मॉडल पूरक आनुवंशिक विनयशील पशु विकसित करने के लिए टी. इन मॉडलों amylopathies-आमतौर सेलुलर और आणविक और उनकी सादगी के आधार पर, समस्या का सार पर कब्जा करने के लिए मदद के विशिष्ट पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कीड़ा Caenorhabditis एलिगेंस गिरता इस श्रेणी है. यह एक छोटे जीवन काल है, ~ 20 दिन और जीन अभिव्यक्ति, प्रोटीन की तस्करी, neuronal संपर्क, synaptogenesis, सेल संकेतन, और मौत के नियमन सहित इसके अलावा बुनियादी सेलुलर प्रक्रियाओं में स्तनधारी 7 के समान हैं. कीड़ा के अद्वितीय सुविधाओं शक्तिशाली आनुवंशिकी और स्वतंत्र रूप से संवहनी नुकसान की neuronal नुकसान का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है जो एक पोत प्रणाली की कमी शामिल है. दूसरी ओर, एक मस्तिष्क की कमी सी के उपयोग की सीमा neurodegeneration के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एलिगेंस. इसके अलावा, घावों की संरचनात्मक वितरण के प्रजनन और पहचान इस जीव में नहीं किया जा सकता. अन्य सीमाations जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल और जटिल व्यवहार और स्मृति समारोह की हानि दोनों में मतभेद का आकलन करने में कठिनाई शामिल हैं. यहाँ हम सी. उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन amylopathies की एलिगेंस मॉडल.

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Protocol

1. ट्रांसजेनिक कीड़े का निर्माण

  1. परिवर्तन.
    1. इंजेक्शन पैड तैयार. एक गिलास coverslip पर पानी में भंग गर्म, 2% agarose की एक बूंद रखें. जल्दी छोड़ पर एक दूसरे coverslip जगह है और इसे हल्के ढंग से नल. Agarose के अलावा, स्लाइड coverslips जम, और 80 में एक निर्वात ओवन में coverslip पैड ° सीओ / एन सेंकना करने के बाद
    2. Pipettes खींचो. हम 1/0.5 मिमी रेशा साथ आयुध डिपो / आईडी borosilicate केशिकाओं खींचने के लिए एक Sutter पी 97 खींचने का उपयोग करें. Pipettes एक बाद में मंच पर खुले टूट गया है जो बंद टिप के साथ जाली हैं.
    3. इंजेक्शन मिश्रण तैयार करें. Μl / 150 एनजी के अंतिम एकाग्रता के लिए ब्याज की डीएनए (निर्माण प्रति 20 एनजी / μl) से अधिक खाली प्लाज्मिड डीएनए युक्त इंजेक्शन मिश्रण बनाओ. किसी भी दूषित पदार्थों को दूर करने के लिए इंजेक्शन मिश्रण अपकेंद्रित्र. दूषित पदार्थों परिवर्तन क्षमता को कम है क्योंकि यह कदम महत्वपूर्ण है. ख के लिए एक ताजा ट्यूब शीर्ष 5 μl (मलबे और अन्य contaminants तल में इकट्ठा) स्थानांतरणई इंजेक्शन में प्रयोग किया जाता है.
    4. कपिलैरिटि द्वारा इंजेक्शन मिश्रण लोड. पिपेट के नीचे इंजेक्शन मिश्रण में डूब जाता है. आमतौर पर 0.5 μl 100 कीड़े इंजेक्षन करने के लिए पर्याप्त हैं.
    5. इंजेक्शन पिपेट लोड. Micromanipulator के धारक पर पिपेट डालें और agarose पैड पर मलबे के खिलाफ एक गिलास स्लाइड पर या वैकल्पिक रूप से मुहिम शुरू की एक कवर पर्ची के किनारे के खिलाफ अपने टिप रगड़ से यह खुला तोड़. यह बहुत बड़ी सुझावों क्षति कृमि के रूप में एक महत्वपूर्ण कदम है और बहुत छोटे सुझावों को आसानी से भरा हुआ है. टूटी हुई टिप की गुणवत्ता प्रवाह की दर से सबसे महत्वपूर्ण आकार और से आंका जा सकता है. प्रवाह की दर एक इंजेक्शन के दबाव के जवाब में हेलोकार्बन 700 तेल की एक बूंद में डूबे खुले सिरे से बह बुलबुले के आकार के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.
    6. इंजेक्शन पैड को कीड़े स्थानांतरण. एक इंजेक्शन पैड पर 700 हेलोकार्बन तेल की एक बूंद प्लेस और तेल के लिए (शुरुआती के लिए 1 या 2) कई कीड़े हस्तांतरण. जब तक पैड पर कीड़े नीचे पुश करने के लिए लेने के लिए एक कीड़ा का प्रयोग करेंवाई agarose का पालन करें. कीड़े एक ही दिशा का सामना करना पड़ उदर पक्षों के साथ पंक्तियों में उन्मुख होना चाहिए. कीड़ा के सिर को छूने से बचें. कीड़े पैड का पालन करने में असफल कई प्रयासों के बाद, तो एक ताजा पैड के साथ बदलें या agarose मोटाई और / या एकाग्रता में वृद्धि.
    7. कृमि में पिपेट डालें. मंच ले जाकर, पिपेट तहत कीड़ा स्थिति. इसके कोशिका द्रव्य कई रोगाणु सेल नाभिक द्वारा साझा किया जाता है क्योंकि जननद के केंद्रीय कोर में पिपेट स्थिति. यह कई संतान को इंजेक्शन डीएनए वितरित करने के लिए संभावना बढ़ जाती है. पिपेट कीड़ा (~ 15 ° -25 डिग्री कोण) के लिए लगभग समानांतर झूठ चाहिए. त्वचा उदास है जब तक खड़ी कीड़ा शरीर नीचे पिपेट की नोक पुश. फिर धीरे टिप की प्रविष्टि को उत्पन्न करने के लिए जोड़तोड़ पर नल. अच्छे परिणाम के लिए दोनों जननग्रन्थि इंजेक्षन.
    8. डीएनए समाधान इंजेक्षन. जननद पहुँच जाती है जब तक पिपेट लिए दबाव लागू करें. प्रवाह बंद करो और पिपेट बंद कीड़ा खींच. चाल तो प्रवाह के लिए सुई का परीक्षण औरअगले कीड़ा और दोहराने इंजेक्शन कदम के लिए.
    9. कीड़े की वसूली: कीड़े पर वसूली बफर की एक बूंद (~ 10 μl) जोड़ें और कीड़े तैराकी शुरू तक सेते हैं. समाधान ज्यादातर M9 है जब तक कीड़े तैराकी फिर से शुरू करने और कई बार दोहराने जब तक M9 के एक बराबर मात्रा में जोड़ें, रुको. व्यक्तिगत वरीयता प्राप्त प्लेटें कीड़े हस्तांतरण.
  2. एकता.
    1. एक ताजा थाली में 40 स्वस्थ, परिपुष्ट, L4 कीड़े रखें
    2. 40 मिनट के लिए 4,000 rads साथ γ-किरण के साथ चमकाना. ताजा, OP50 वरीयता प्राप्त प्लेट (4 कीड़े / प्लेट) में विकिरणित कीड़े (P0) स्थानांतरण. कीड़े वैकल्पिक रूप से 300 जम्मू / 2 मीटर उव्स की एक खुराक के साथ विकिरणित किया जा सकता है.
    3. व्यक्तिगत प्लेटों को एक थाली 10-20 एफ 1 transformants स्थानांतरण, इसी P0 के मूल के साथ प्लेटें लेबल.
    4. अलग प्लेटों के लिए प्रत्येक F1 के लिए 2-4 F2 transformants के बाहर बना. परिवर्तन मार्कर की 100% प्रसारण के लिए F3 संतान की जाँच करें. आमतौर पर, एक विकिरणित कीड़ा wil से संतान की 1-3%मैं एक एकीकरण घटना है.
    5. तीन या अधिक स्वतंत्र transformant लाइनों के शेयर करें.

2. व्यवहार assays

  1. आयु तुल्यकालन.
    1. मानक 10 सेमी एन जी एम प्लेटों + OP50 ई. में कीड़े हो जाना गर्भवती वयस्कों की एक बड़ी आबादी तक कोलाई (3-5 दिन) तक पहुँच जाता है.
    2. 1 मिलीलीटर M9 बफर में उन्हें निलंबित करके 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में कीड़े लीजिए.
    3. 3 मिनट के लिए 450 XG पर 5 मिलीलीटर M9 बफर और अपकेंद्रित्र जोड़ें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें. 3-4x दोहराएँ.
    4. पिछले centrifugation के अंत में, सतह पर तैरनेवाला हटाने और pelleted कीड़े को बुनियादी hypochlorite समाधान (0.5 एम NaOH, हौसले से मिश्रित 1% हाइपोक्लोराइट) के 10 संस्करणों में जोड़ें. ~ 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं. सेल प्रतिक्रिया एक coverslip पर सेल प्रतिक्रिया की एक बूंद रखकर और एक खुर्दबीन के नीचे कीड़े की जांच से नजर रखी जा सकती है. कीड़े की लगभग 80% टूट रहे हैं जब प्रतिक्रिया बंद कर दिया जाना चाहिए.
    5. एडिन से सेल प्रतिक्रिया बंद करोबाँझ अंडे बफर के छ ही मात्रा.
    6. 5 मिनट के लिए 450 XG पर centrifugation द्वारा अंडे (और शवों) लीजिए.
    7. बाँझ अंडा बफर 2-3x के साथ अंडे धो लें.
    8. M9 बफर और बीज उन्हें मानक एन जी एम प्लेटों पर अंडे ओ / एन सेते हैं.
  2. Chemotaxis परख.
    1. अगर मोटे तौर पर 0.5x0.5x0.5 सेमी के कई टुकड़े को तैयार है. हम एक 10 सेमी थाली में अगर जमा और हम वहाँ से अगर हिस्सा काटा.
    2. 2 घंटे के लिए वांछित attractant (संतृप्त, लगभग संतृप्त सांद्रता में) युक्त समाधान में अगर हिस्सा लेना. ठेठ attractants लाइसिन (0.5 एम), बायोटिन (0.2 एम) कर रहे हैं.
    3. एक परीक्षण स्थल के स्थान और एक नियंत्रण स्थान (चित्रा 1 ए) के रूप में चिह्नित किया गया है, जिसमें एक 10 सेमी परीक्षण थाली में एक अगर हिस्सा जमा. संतुलन और एक ढाल ओ / एन (चित्रा 1 बी) के गठन की अनुमति दें. एक ही प्रयोग के लिए 5 प्लेटों की तैयारी.
    4. पहले प्रयोग 20 मिमी नेन 3 (anest के 10 μl जोड़नेप्रत्येक स्थान के लिए) hetic.
    5. प्लेट के केंद्र में 20 साल की उम्र सिंक्रनाइज़ कीड़े रखें. 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली प्लेस
    6. 1 घंटे के बाद, परीक्षण / नियंत्रण स्थानों पर पशुओं की गिनती और पालन के रूप में कीमोटैक्सिस सूचकांक (सीआई) गणना: 1 समीकरण एन, एन परीक्षण और एन CNT., पशुओं की कुल संख्या, परीक्षण स्थल में पशुओं की संख्या और नियंत्रण स्थान में पशुओं की संख्या से संकेत मिलता है.

3. प्राथमिक भ्रूण सेल संस्कृति

  1. उम्र तुल्यकालन में वर्णित के रूप में कीड़े lyse.
  2. 5 मिनट के लिए 450 XG पर बाँझ अंडा बफर और अपकेंद्रित्र के समान मात्रा जोड़कर सेल प्रतिक्रिया बंद करो. धीरे pelleted अंडे खोना नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा तैरनेवाला त्यागें. 2-3x दोहराएँ या तैरनेवाला स्पष्ट है जब तक.
  3. Pelleted अंडे (और शवों Resuspend) 2 मिलीलीटर बाँझ अंडे बफर में और अंडे बफर में बाँझ 60% sucrose के 2 मिलीलीटर जोड़ें. अंडे पूरी तरह से हाथ से या vortexing द्वारा (वे centrifugation के तहत फार्म clumps करते हैं) resuspended हैं जब तक इस घोल मिलाएं.
  4. 15 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र.
  5. ध्यान से एक बाँझ ट्यूब सतह पर तैरनेवाला (अंडे युक्त) हस्तांतरण. शवों और सेल के उत्पादों द्वारा अन्य शामिल हैं जो गोली त्यागें.
  6. अंडा बफर में अंडे resuspending और 5 मिनट के लिए XG 450 पर centrifuging द्वारा अवशिष्ट सूक्रोज निकालें. धीरे इकट्ठा करने और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 3x दोहराएँ.
  7. एक लामिना हुड के तहत अनावश्यक कार्य को पचाने के लिए आरटी पर 1 यू / एमएल chitinase युक्त बाँझ अंडे बफर में pelleted अंडे resuspend. 30 मिनट की प्रतिक्रिया (एक औंधा सेल संस्कृति खुर्दबीन के नीचे) पर नजर रखने के लिए शुरू करने के बाद. Chitinase के प्रत्येक बैच एक अलग गतिविधि है. आमतौर पर पाचन 1 घंटे में पूरा हो गया है.
  8. मोटे तौर पर 70-80% अनावश्यक कार्य chitinase मुख्यमंत्री-15 जोड़ (एल 15 सेल संस्कृति मेड से पचा रहे हैंium 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन) युक्त. एक 27 गेज के साथ एक सिरिंज का उपयोग कोशिकाओं को अलग कर देना. बरकरार भ्रूण को निकालने के लिए फिल्टर एक 5.0 माइक्रोन, कोशिकाओं और लार्वा के clumps साथ सेल निलंबन फ़िल्टर.
  9. गोली 450 पर centrifugation द्वारा अलग सेल निलंबन के 15 मिनट के लिए XG. सतह पर तैरनेवाला निकालें और मुख्यमंत्री-15 सेल संस्कृति माध्यम में गोली resuspend.
  10. . कांच कवर पर प्लेट अलग कोशिकाओं पहले पानी नोट में भंग मूंगफली लेक्टिन (0.1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ लेपित निकल जाता है: कोशिकाओं को अलग करने के क्रम में सब्सट्रेट का पालन करना होगा.
  11. कोशिकाओं को अधिक से अधिक 2 सप्ताह के लिए हवा में आर टी (16-20 डिग्री सेल्सियस) पर बनाए रखा जा सकता है.

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Representative Results

हमारे प्रोटोकॉल के साथ हम neuronal समारोह 8 पर मानव Aβ 42 oligomer के प्रभाव का अध्ययन. एक टुकड़ा एन्कोडिंग मानव Aβ 42 और आग वेक्टर pPD50.52 की कृत्रिम संकेत पेप्टाइड अनुक्रम कोडन सिरों पर एक SMA 1 प्रतिबंध endonuclease साइट शुरू की है कि प्राइमरों का उपयोग निर्माण PCL12 9 से परिलक्षित किया गया था. टुकड़ा तो अद्वितीय Sma 1 साइट 10 के बीच pPD95.75 आग वेक्टर में एक 2481-बीपी FLP-6 प्रमोटर अनुक्रम युक्त निर्माण में डाला गया था. प्रोटोकॉल 1 में वर्णित परिवर्तन तकनीकों का प्रयोग हम एएसई न्यूरॉन्स (FDX (ses25) तनाव) 8 में Aβ 42 व्यक्त ट्रांसजेनिक कीड़ा निर्माण किया. सकारात्मक transformants चिह्नित करने के लिए हम विशेष रूप से एएसई अधिकार (ASER) न्यूरॉन 11 में GFP अभिव्यक्ति ड्राइव जो पी gcy -5 :: GFP संवाददाता इस्तेमाल किया. सूखी agarose उनके पानी को अवशोषित क्योंकि कीड़े पैड से चिपके रहते हैं. इसलिए यह cru हैसामाजिक जानवरों इंजेक्शन पैड पर रखा और अन्यथा वे सूखना और मर जाएगा, क्योंकि अपेक्षाकृत जल्दी इंजेक्ट कर रहे हैं. एक संक्रामक extrachromosomal सरणी वहन करती है कि F1 संतान का प्रतिशत भिन्न हो सकते हैं. विशिष्ट मूल्यों 3-7% रेंज में हैं. यह DNAs एक दूसरे के साथ मुताबिक़ पुनर्संयोजन गुजरना क्योंकि इंजेक्शन मिश्रण (1.1.3) ट्रांसजेनिक डीएनए (आमतौर पर खाली सदिश) के साथ गैर एन्कोडिंग डीएनए बंटवारे अनुक्रम अनुरूपता होता है कि महत्वपूर्ण है. Transgene की overexpression एक समस्या है हालांकि, अगर इंजेक्शन मिश्रण 50-100 एनजी / Sca 1 के साथ पचा जीनोमिक डीएनए के μl के साथ पूरक होना चाहिए. एएसई न्यूरॉन्स ऐसे बायोटिन के रूप में पानी में घुलनशील attractants का पता लगाने और इसलिए उनके कार्य व्यवहार assays (कीमोटैक्सिस परख, प्रोटोकॉल 2 और आंकड़े 1 ए और 1 बी) 12 में मूल्यांकन किया जा सकता है. एक ठेठ प्रयोग में, हम पी gcy -5 व्यक्त सात दिन पुरानी कीड़े :: GFP अकेले (DA1262 तनाव) या Aβ 42 (FDX (ses25)) के साथ के लिए परीक्षण कियाबायोटिन को कीमोटैक्सिस. युवा कीड़े (3-4 दिन पुराना) में Aβ 42 अभिव्यक्ति का प्रभाव मामूली है, लेकिन पहले से ही पहचाने जा रहे हैं (कीमोटैक्सिस सूचकांक में ~ 10% कमी, रेफरी देखें. 8). इस प्रयोग के प्रतिनिधि परिणाम आंकड़े 1 सी और 1 डी में दिखाया जाता है. हाल DA1262 कीड़े, पास attractant के स्थान (चित्रा 1C) में पाया जाता है, या कर रहे थे. इसके विपरीत करके Aβ 42 व्यक्त केवल कुछ कीड़े attractant के स्थान (चित्रा -1) मिल सकता है. हम क्रमशः DA1262 और FDX (ses25), के लिए बायोटिन 0.68 के लिए एक कीमोटैक्सिस सूचकांक ± 0.09 और 0.12 प्राप्त 5 परीक्षण प्लेटें / जीनोटाइप में वितरित 100 पशुओं / जीनोटाइप ± 0.04 परीक्षण किया. सक्रिय कीड़े व्यक्तिगत रूप से उठाया और परीक्षण प्लेट के केंद्र के लिए हस्तांतरित किया गया. यह करने के लिए न केवल जल्दी से महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी नहीं तो वे कई मिनट के लिए निष्क्रिय रहते हैं और attractant के ट्रैक करने के लिए विफल हो सकता है क्योंकि धीरे कीड़े हस्तांतरण. प्रयोग के अंत में हम पर नजर रखने के कीड़े एक सुझावउनके रास्ते को देखकर ctivity. केवल कुछ पटरियों दिखाई दे रहे हैं, तो हम आम तौर पर थाली त्यागें.

FDX (ses25) कीड़े की ASER न्यूरॉन्स में GFP प्रतिदीप्ति (नहीं दिखाया गया है) के जीवन के पहले ग्यारह दिनों के भीतर गायब हो जाता है. इस वजह से इन कोशिकाओं Aβ 42 की उपस्थिति के कारण apoptosis से गुजरना है कि पता चलता है. इसलिए हम निर्धारित किया है कि क्या इस तरह के रूप apoptosis की एक व्यापक स्पेक्ट्रम अवरोध कस्पासे अवरोध एन (2 Quinolyl) valyl-aspartyl-(2,6-difluorophenoxy) मिथाइल कीटोंन (क्यू वी डी-Oph) 13 ASER कोशिकाओं के नुकसान को रोकने सकता है . यह अंत करने के लिए हम प्रोटोकॉल 3 में वर्णित के रूप में तैयार किया गया है, जो भ्रूण 14 से सुसंस्कृत प्राथमिक ASER न्यूरॉन्स कार्यरत हैं. एक युवा (4 दिन पुराना) FDX (ses25) संस्कृति में न्यूरॉन्स की छवियों के साथ कीड़ा में एक ASER न्यूरॉन की छवियों प्रतिनिधि आंकड़े 2A सी में दिखाए जाते हैं. संवर्धित ASER कोशिकाओं (चित्रा 2 डी) अल्पकालिक थे. 0.3 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ उम्मीद की ऊष्मायन के रूप में क्यू वी डी-Oph हौसले, दैनिक ग पूरक ompletely फ्लोरोसेंट ASER न्यूरॉन्स की हानि बंद कर दिया. संस्कृति में प्राथमिक न्यूरॉन्स के साथ काम कर रहे हैं यह एक उपयुक्त सेल घनत्व को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. यह पैरामीटर मुख्य रूप से अंडे निकालने के लिए किया कीड़े की संख्या पर निर्भर करता है. हम एक मानक hemocytometer के साथ सेल घनत्व को मापने और सेल संस्कृति से सेल संस्कृति को निरंतर सेल घनत्व को बनाए रखने के लिए विशेष रूप से ध्यान रखना. ऐसे लोगों के रूप में औषधीय प्रयोगों यहाँ वर्णित के लिए हम चार मिला हुआ 10 सेमी प्लेटें कटाई से प्राप्त हुई थी जो ~ 200000 कोशिकाओं / 2 सेमी के साथ काम किया. कोशिकाओं को एक 24 अच्छी तरह से थाली के 12 कुओं में चढ़ाया गया. इष्टतम परिणामों के लिए यह है कि वे फार्म clumps करते हैं बोने से पहले भ्रूण कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. हम एक 27 गेज सुई और आर्य लोग वापस निलंबन महाप्राण और आगे समय की एक जोड़ी के साथ एक सिरिंज का उपयोग करें. यह आम तौर पर कोशिकाओं (विशेष रूप से शुरुआत में हम एक माइक्रोस्कोप के तहत निलंबन की जांच करने का सुझाव देते हैं) की सबसे अलग कर देना करने के लिए पर्याप्त है.

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चित्रा 1. Chemotaxis परख. ए प्रतिनिधि कीमोटैक्सिस थाली. Attractant (बायोटिन) और नियंत्रण धब्बे एक खोखला और एक भरा चक्र के साथ चिह्नित हैं. बी बायोटिन की एक ढाल की स्थापना के लिए प्रयोग किया जाता अगर एक 0.5 सेमी व्यास टुकड़ा के साथ भरी हुई एक कीमोटैक्सिस थाली. अगर की टुकड़ा attractant के स्थान के आसपास कीड़े का एक गिलास पाश्चर पिपेट. सी. प्रतिनिधि वितरण के ऊपर की ओर का उपयोग कर एक 10 सेमी की थाली से काट दिया गया. इस उदाहरण में DA1262 कीड़े के बहुमत FDX (ses25) कीड़े के लिए सी. के रूप में attractant के स्रोत (बायोटिन). डी. स्थानीयकरण करने में सक्षम थे. ये बायोटिन असंवेदनशील कीड़े थाली के चारों ओर एक बिखरे वितरण का प्रदर्शन किया और केवल कुछ attractant के स्थान के पास पाया गया.

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चित्रा 2. सी. की संस्कृति एलिगेंस भ्रूण कोशिकाओं. ए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि (बाएं चित्र) और उज्ज्वल प्रकाश (सही चित्र) एक FDX (ses25) ट्रांसजेनिक कीड़ा सिर से ली गई है. यह कीड़ा gcy -5 प्रमोटर द्वारा संचालित ASER न्यूरॉन में GFP व्यक्त करता है. FDX (ses25) भ्रूण कोशिकाओं की एक संस्कृति के बी उज्ज्वल प्रकाश छवि. स्केल बार 5 माइक्रोन है. एक सुसंस्कृत FDX (ses25) ASER न्यूरॉन सी. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि. छवियाँ एक डिजिटल कैमरे से लैस एक ओलिंप BX61 खुर्दबीन के साथ ले जाया गया. डी. प्रतिनिधि प्रयोग सुसंस्कृत, उम्र सिंक्रनाइज़, ASER न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता का परीक्षण. कोशिकाओं में बनाए रखा DA1262 भ्रूण (खोखला हलकों) या FDX (ses25) भ्रूण से प्राप्त किया गया अभाव / 300 एनजी / एमएल क्यू वी डी-Oph (खोखला और भरे चौराहों, क्रमशः) की उपस्थिति. GFP प्रतिदीप्ति के लापता होने के एक न्यूरॉन की व्यवहार्यता का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया था. पूर्वperiment ~ 300 फ्लोरोसेंट ASER न्यूरॉन्स के साथ शुरू कर दिया. व्यवहार्यता 100 * (1 दिन में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या से विभाजित दिन एक्स पर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या) के रूप में गणना की गई. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

यहाँ हम सी. का उपयोग amylopathies के सेलुलर और आणविक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक संयुक्त दृष्टिकोण का वर्णन एलिगेंस. इस दृष्टिकोण के लाभ में शामिल हैं: 1.) कम लागत C.elegans कमरे के तापमान पर, जीवाणु के साथ वरीयता प्राप्त सामान्य पेट्री डिश में बनाए रखा है. 2) शक्तिशाली आनुवंशिकी. ट्रांसजेनिक जानवर कुछ महीनों में प्राप्त की और प्रमोटर दृश्यों की एक विस्तृत सरणी विशिष्ट न्यूरॉन्स में वांछित जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए उपलब्ध किया जा सकता है. 3) सरल, अच्छी तरह से विशेषता, तंत्रिका तंत्र. सी. एलिगेंस एक उल्लेखनीय सरल तंत्रिका तंत्र (302 न्यूरॉन्स) के पास. इस सादगी सेल वंश, प्रत्येक न्यूरॉन की विशेष समारोह / भूमिका और उसके synaptic कनेक्शन सहित कीड़ा तंत्रिका तंत्र की व्यापक लक्षण वर्णन करना चाहता है. सी. की सीमाएं एलिगेंस ऐसे immunohistochemistry के मानक के रूप में जैव रासायनिक तकनीक के इस्तेमाल और Neu insulates जो एक मोटी त्वचा (छल्ली) hinders जो कोशिकाओं के छोटे आकार में शामिलRons बाहरी वातावरण के रूप में. इसलिए, औषधीय दृष्टिकोण सी में सीमित प्रभावकारिता का हो सकता है प्राथमिक कोशिकाओं की एलिगेंस. संस्कृति आंशिक रूप से इस समस्या को सुधारने के लिए एक वैध रणनीति का प्रतिनिधित्व करते हैं.

इन प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम कीड़े की बड़ी मात्रा के साथ शुरू करने और अंडे, भ्रूण आदि खोना नहीं करने के क्रम में तैयारियों की निगरानी में शामिल हैं. यह भी इंजेक्शन के दौरान पशुओं को संभालने के लिए सीखने के लिए महत्वपूर्ण है. एक बड़े पिपेट साथ उन्हें छिद्रण या बहुत ज्यादा डीएनए मिश्रण इंजेक्शन लगाने से भी लंबे समय से agarose पैड में कीड़े रखते हुए अचल उन्हें नुकसान पहुंचा सकता है. परिवर्तन दक्षता, reproducibility और transgene अभिव्यक्ति भिन्न हो सकते हैं. क्षमता इंजेक्शन मिश्रण की पवित्रता और इसकी संरचना (गैर कोडन डीएनए की उपस्थिति) से संबंधित है. Extrachromosomal सरणियों जानवर से जानवर को बदलती हैं इसलिए यह transgene प्रति 2-3 कम से कम, स्वतंत्र लाइनों की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है. दूसरी ओर, के अलावा पचमिश्रण करने के लिए जीनोमिक डीएनए अधिक अभिव्यक्ति ट्रांसजेनिक कम करने के लिए एक वैध रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है. Chemotaxis assays अपेक्षाकृत परेशानी से मुक्त हैं. हालांकि यह गलत परिणामों से बचने के क्रम में एकाग्रता ढाल में स्थिरता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. एक पाश्चर साथ उन्हें काट पिपेट और संतुलन समय निरंतर बनाए रखने के लिए उदाहरण के लिए आकार उसी की अगर के टुकड़े का उपयोग करें. यदि कोई हो, एक कपास झाड़ू के साथ अतिरिक्त समाधान निकालने.

अंत में, यहाँ हम एक सरल, आनुवंशिक विनयशील जीव amylopathies की आणविक पहलुओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक उदाहरण प्रदान करते हैं. एक ही प्रयोगात्मक तकनीक अन्य neuronal प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए और रोग के नए पशु मॉडल की पीढ़ी के लिए लागू किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water Bring to 975 ml
Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer 25 ml of 1M stock
2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320
Lysine Sigma-Aldrich L5501
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sucrose Sigma-Aldrich S0389

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References

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Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

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