Summary
Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler tarif
Abstract
Amylopathy zamanla dokularda amiloid beta anormal sentezi ve birikimi (Aβ) tanımlayan bir terimdir. Aβ Alzheimer hastalığı (AH) bir özelliğidir ve Lewy cismi demans, dahil vücut miyozit ve serebral amiloid anjiyopati 1-4 bulunur. Amylopathies giderek zamanla gelişir. Bu nedenle kısa ömürlü basit organizmaların bu koşulların moleküler yönlerini aydınlatmak için yardımcı olabilir. Burada, solucan Caenorhabditis elegans kullanarak Aβ-aracılı nörodejenerasyon incelemek için deneysel protokolleri tarif. Böylece, yetişkin çift cinsiyetli en sinsisyal gonadlar içine kodlayan DNA insan Aβ 42 enjekte edilerek transgenik solucanlar inşa. Transformant çizgiler Mutasyon-kaynaklı entegrasyonu ile stabilize edilir. Nematodlar yumurtalarını toplama ve ekim ile senkronize yaş vardır. Aβ 42 eksprese eden nöronların fonksiyonu (elverişli davranış tahlillerinde test edilir kemotaksi deneyis). Embriyolardan elde edilen primer nöronal kültürler davranışsal verileri tamamlamak için ve anti-apoptotik bileşiklerin nöro-koruyucu etkisini test etmek için kullanılır.
Introduction
Beta amiloid (Aβ) β ve γ secretases 1 ile amiloid ön-madde proteininin (APP) sıralı bölünme sonra oluşan 36-43 amino asitlik bir peptiddir. Γ sekretaz Aβ peptidin C-terminal ucu işler ve değişken uzunlukta 5 sorumludur. Aβ en yaygın formları Aβ 40 ve Aβ 42, daha yaygın olarak, AD 5 gibi patolojik durumları ile ilişkili olan ikinci bulunmaktadır. Yüksek konsantrasyonlarda Aβ formu β-yaprak azından amiloid fibriller 6 oluşturmak için agrega. Fibriller yatakları nöronları çevreleyen senil plaklar ana bileşenidir. Plaklar ve yayılabilir, olmayan plak Aβ oligomerler, hem Aβ altında yatan patojenik formları oluşturacağı düşünülmektedir.
Nöronal amylopathies Laboratuvar çalışma süresi ile bu bu koşullar ilerleme gerçeği ile karmaşık. Bu nedenle, importanfareler-kısa ömrü için model-tamamlayıcı genetik uysal hayvan geliştirmek için t. Bu modeller amylopathies-genellikle hücresel ve moleküler-ve basitliği sayesinde, sorunun özünü yakalamak için yardımcı belirli yönlerini aydınlatmak için kullanılabilir. Solucan Caenorhabditis elegans düşüyor bu kategorisidir. Bu kısa bir ömrü vardır, ~ 20 gün ve gen ifadesi, protein kaçakçılığı, nöronal bağlantı, sinaptogenez, hücre sinyalizasyon ve ölüm düzenlenmesi de dahil olmak üzere ek temel hücresel süreçleri memeli 7 benzer. Solucanın benzersiz özellikleri güçlü genetik ve bağımsız vasküler hasar nöronal hasarı incelemek için sağlayan bir damar sistemi, eksikliği içerir. Öte yandan, bir beyin eksikliği C kullanımını sınırlamaktadır nörodejenerasyon birçok açıdan eğitim için elegans. Buna ek olarak, lezyonların anatomik dağılımlarının üreme ve kimlik bu organizmada gerçekleştirilemez. Diğer sınırıations gen ekspresyon profilleri ve karmaşık davranış ve hafıza fonksiyon bozukluğu hem de farklılıkları değerlendirmek için zorluk içerir. Burada C oluşturmak için yöntemler tarif amylopathies bir elegans modelleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transgenik Worms İnşaatı
- Dönüşüm.
- Enjeksiyon pedleri hazırlayın. Bir cam lamel üzerine suda çözünmüş sıcak,% 2 agaroz, bir damla yerleştirin. Hızla açılan ikinci bir lamel yerleştirin ve hafifçe dokunun. Agaroz ayrı slayt lamelleri katılaşmış ve 80 ° C'de bir vakum fırın içinde lamel ped ° CO / N fırında sonra
- Pipetler çekin. Biz 1/0.5 mm filament ile OD / ID borosilikat kılcal çekmek için bir Sutter P-97 çektirme kullanın. Pipetler daha sonraki bir aşamada açık kırık kapalı ucu ile dövme.
- Enjeksiyon karışımı hazırlayın. Ul / 150 ng arasında nihai bir konsantrasyona kadar, ilgili DNA (yapı başına 20 ng / ml) artı boş plazmid DNA içeren enjeksiyon karışımı olun. Herhangi bir kirletici kaldırmak için enjeksiyon karışımı santrifüj. Kirletici dönüşüm verimliliği azaltmak için bu adım çok önemlidir. B yeni bir tüp en iyi 5 ul (enkaz ve diğer kirleticiler alt toplamak) transferE enjeksiyon kullanılır.
- Kılcallık tarafından enjeksiyon karışımı yükleyin. Pipet alt enjeksiyon karışımı batırılır. Tipik olarak 0.5 ul 100 solucanlar enjekte etmek için yeterlidir.
- Enjeksiyon pipet yükleyin. Mikromanipülatör sahibinin üzerine pipet yerleştirin ve agaroz pad üzerinde enkaz karşı bir bardak slayt veya alternatif olarak monte edilmiş bir kapak kayma kenarına ucu sürtünme tarafından açık ara. Bu çok büyük ipuçları zarar solucan gibi çok önemli bir adımdır ve çok küçük ipuçları kolay tıkanır. Kırık ucu kalitesi akış hızı en önemlisi şekil ve ile değerlendirilebilir. Akış hızı enjeksiyon basıncına tepki olarak halokarbon 700 bir damla yağ daldırılan açık ucundan akan kabarcıkların büyüklüğü ile değerlendirilebilir.
- Enjeksiyon pad solucanlar aktarın. Bir enjeksiyon pad üzerinde 700 halokarbon petrol bir damla koyun ve yağ (yeni başlayanlar için 1 veya 2) birçok solucanlar aktarın. Kadar ped üzerine solucanlar aşağı itmek için almak bir solucan kullanıny agaroz uygun. Worms aynı yöne bakacak şekilde ventral taraf ile satır odaklı olmalıdır. Solucan kafası dokunmaktan kaçının. Solucanlar ped uymak için başarısız birkaç denemeden sonra ise, yeni bir ped ile değiştirin veya agaroz kalınlığı ve / veya konsantrasyonu artırır.
- Solucan içine pipet takın. Sahne hareket ettirerek, pipet altında solucan yerleştirin. Sitoplazma birçok germ hücre çekirdekleri tarafından paylaşıldığı için gonadın merkezi bir çekirdek pipet yerleştirin. Bu birçok döl enjekte DNA teslim olasılığını artırır. Pipet solucan (~ 15 ° -25 ° açı) neredeyse paralel durmalıdır. Cilt basılana kadar dikey olarak solucan vücudunun aşağı pipet ucu itin. Sonra yavaşça ucu en ekleme ikna etmek için manipülatör dokunun. En iyi sonuç için her iki gonadlar enjekte.
- DNA çözüm enjekte edilir. Gonad şişer kadar pipet basınç uygulayın. Akışını durdurmak ve pipet kapalı solucan çekin. Taşıyın akışı için iğne Test vebir sonraki solucan ve tekrar enjeksiyon adımlar.
- Solucanlar kurtarmak: solucanlar kurtarma tampon bir damla (~ 10 ul) ekleyin ve solucanlar yüzme başlayana kadar kuluçkaya yatmaktadır. Çözüm çok M9 kadar solucan yüzme devam ve birkaç kez tekrar kadar M9 eşit miktarda ekleyin, bekleyin. Bireysel numaralı seribaşı plakaları için solucanlar aktarın.
- Entegrasyon.
- Taze bir tabak içine 40 sağlıklı, iyi beslenmiş, L4 solucanlar yerleştirin
- 40 dakika 4.000 rad ile γ-ışını ile saçmak. Taze, OP50 numaralı seribaşı plakaları (4 solucanlar / plaka) ışınlanmış solucanlar (P0) aktarın. Worms alternatif olarak 300 J / m 2 UV'lerinizi bir doz ile ışınlanmış olabilir.
- Bireysel plakalar her plaka 10-20 F1 transformantlar aktarmak, ilgili P0 kökenli levhalar etiket.
- Ayrı levhalar her F1 için 2-4 F2 transformantlar tek tek. Dönüşüm marker 100% iletimi için F3 döl kontrol edin. Tipik olarak, bir ışınlanmış solucan wil gelen döl% 1-3l bir entegrasyon olay var.
- Üç veya daha fazla bağımsız transformant hatları stokları olun.
2. Davranış Tahliller
- Yaş-senkronizasyon.
- Standart 10 cm NGM plakalar + OP50 E'de solucanlar büyütün gebe yetişkinlerin büyük bir nüfus kadar coli (3-5 gün) ulaşılır.
- 1 mi M9 tampon bunları süspansiyona, 50 ml Falcon tüpleri solucanları toplayın.
- 3 dakika boyunca 450 x g, 5 ml M9 tampon ve santrifüj ekleyin. Süpernatant atın. 3-4x tekrarlayın.
- Son santrifüj sonunda, süpernatan kaldırmak ve pelet solucanlar temel hipoklorit çözeltisi (0.5 M NaOH ve taze karışık% 1 hipoklorit), 10 hacim ekleyin. ~ 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Lizis Reaksiyon bir lamel üzerine parçalama reaksiyonu bir damla yerleştirme ve bir mikroskop altında incelenmesi ile solucanlar izlenebilir. Solucanların yaklaşık% 80 kırıldığı zaman, reaksiyon durdurulmalıdır.
- Eklenti tarafından parçalama reaksiyonu durdurmaksteril yumurta tampon g aynı hacimde.
- 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ile yumurta (ve karkas) toplayın.
- Steril yumurta tampon 2-3x ile yumurta yıkayın.
- M9 tampon ve tohum onları standart NGM plakalar üzerinde yumurta O / N inkübe edin.
- Kemotaksis testi.
- Agar kabaca 0.5x0.5x0.5 cm birkaç adet hazırlayın. Biz 10 cm plaka agar yatırmak ve biz oradan agar parçalar kesti.
- 2 saat boyunca arzu edilen cezbedici (doyurur civarındaki doyurulması konsantrasyonlarda) ihtiva eden bir çözelti içinde, agar parça bekletin. Tipik Cezbedici lisin (0.5 M), biyotin (0.2 M) 'dir.
- Bir test spot yerini ve kontrol nokta (Şekil 1A) işaretlenmiş edildiği bir 10 cm testi plaka bir agar yığın Depozito. Dengeleme ve degrade O / N (Şekil 1B) oluşumunu sağlar. Tek bir deneme için 5 tabak hazırlayın.
- Önce deneme 20 mM NaN 3 (Anest 10 ul ekleyinHer noktaya) infographie.
- Plakasının merkezinde 20 yaş senkronize solucanlar yerleştirin. 20 ° C'de inkübatör plaka koyun
- 1 saat sonra, test / kontrol noktaları üzerinde hayvanların sayısı ve aşağıdaki gibi kemotaksis indeksi (CI) hesaplanır:
N, N-testi ve N Mrk., hayvanların toplam sayısı, test yerinde hayvan sayısı ve kontrol nokta hayvanların sayısını göstermektedir burada.
N, N-testi ve N Mrk., hayvanların toplam sayısı, test yerinde hayvan sayısı ve kontrol nokta hayvanların sayısını göstermektedir burada. 3. Temel embriyonik Hücre Kültürü
- Yaşa senkronizasyon açıklandığı gibi solucanlar eritilir.
- 5 dakika boyunca 450 x g hızında steril yumurta tampon ve santrifüj ile aynı hacim ekleyerek parçalama reaksiyonu durdurun. Yavaşça pelet yumurta kaybetmemek için dikkatli olmak süpernatant atın. 2-3x tekrarlayın veya süpernatant açıktır kadar.
- Pelet yumurta (ve karkas tekrar süspansiyon) 2 ml steril yumurta tamponu içinde ve yumurta tamponu içinde steril% 60 sukroz, 2 ml ekleyin. Yumurta tamamen elle veya vorteks (onlar santrifüj altında kümeleri oluşturmak eğilimi gibi) yeniden süspanse kadar bu çözüm karıştırın.
- 15 dakika 450 x g'de santrifüj.
- Dikkatli bir şekilde steril tüpe süpernatant (yumurta içeren) aktarın. Karkas ve parçalama yan ürünleri diğer içeren pelet atın.
- Yumurta tamponunda yeniden süspansiyon haline getirilmesini yumurta ve 5 dakika boyunca 450 xg santrifüj kalıntı sukroz çıkarın. Yavaşça toplamak ve süpernatant atın. 3x tekrarlayın.
- Bir laminer başlık altında yumurta kabuğu sindirmek için oda sıcaklığında 1 U / ml kitinaz içeren steril yumurta tampon pelet yumurta tekrar süspansiyon. 30 dakika bu durumda reaksiyon (ters bir hücre kültürü mikroskop altında) izlemek için başlatmak. Çitinaz Her parti, biraz farklı bir aktiviteye sahiptir. Genellikle sindirim 1 saat içinde tamamlanır.
- Yaklaşık% 70-80 yumurta kabuğu kitinaz CM-15 eklenti (L-15 hücre kültürü med sindirilir zamaniyum,% 10 fetal sığır serumu, 50 U / ml penisilin ve 50 ug / ml streptomisin) 'tür. Bir 27 göstergesi ile bir şırınga kullanarak hücreleri ayırmak. Sağlam embriyolar kaldırmak için filtre 5.0 mikron, hücre ve larva kümeleri ile hücre süspansiyonu filtre.
- Pelet 450 santrifüjleme ile ayrışmış hücre süspansiyonu, 15 dakika boyunca xg. Süpernatantı ve CM-15 hücre kültürü ortamında pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
- . Cam kapak Plaka ayrışmış hücreleri daha önce su Not çözünmüş fıstık lektin (0.1 mg / ml) ile kaplı fişleri: hücreleri ayırt etmek için yüzeye uygun olmalıdır.
- Hücreler, 2 haftadan daha uzun için hava içinde oda sıcaklığına (16-20 ° C) muhafaza edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim protokolleri ile, nöronal fonksiyonu 8 insan Aβ 42 oligomer etkilerini incelemek. Bir fragmanını kodlayan insan Aβ 42 ve yangın vektör pPD50.52 yapay olarak sinyal peptidi kodlama sekansı ucunda bir Sma 1 kısıtlama endonükleaz sitesini ortaya primerler kullanılarak yapı PCL12 9 ile amplifiye edildi. Bu kısım daha sonra özel Sma 1 Alanı 10 arasındaki pPD95.75 Acil vektörü içinde bir 2.481-bp FLP-6 promotör sekansı ihtiva eden bir yapıya eklenir. Protokol 1 'de tarif edilen transformasyon tekniklerini kullanarak biz ASE nöronların (FDX (ses25) suşu) 8 Aβ 42 eksprese eden transgenik bir solucan inşa edilmiştir. Pozitif dönüştürücüler işaretlemek için biz özellikle ASE sağ (ASER) nöron 11 GFP ifade sürücüler P Kıbrıslı Rumları-5 :: GFP muhabiri kullanılır. Kuru agaroz, su emer çünkü Worms ped sopa. Bu nedenle, CRU olduğusosyal hayvanlar enjeksiyon ped üzerine yerleştirilir ve aksi takdirde kurutulması ve ölecek, çünkü, nispeten hızlı bir şekilde enjekte olduğunu. Iletilebilir bir ekstrakromozomal dizisi taşır F1 döllerinin yüzdesi değişebilir. Tipik değerler% 3-7 aralığındadır. Bu DNA'lar birbirleri ile homolog yeniden birleştirmeye tabi çünkü püskürtme karışımı (1.1.3) DNA'nın (genellikle boş vektör) ile sigara kodlayan DNA dizisi homolojisi paylaşım ihtiva etmesi önemlidir. Transgenin ekspresyonu bir sorun ise, ancak enjeksiyon karışım 50-100 ng / Sca 1 ile sindirilmiş genomik DNA ul ile takviye edilmelidir. ASE nöronlar gibi biotin gibi suda çözünür Cezbedici tespit ve bu nedenle işlevleri davranış testleri (kemotaksis testi, protokol 2 ve Şekil 1A ve 1B) 12 değerlendirilebilir. Tipik bir deneyde, biz P Kıbrıslı Rumları-5 ifade yedi günlük solucanlar :: GFP tek başına (DA1262 suşu) veya Aβ 42 (FDX (ses25)) ile testbiotin inhibe etmektedirler. Genç solucanlar (3-4 günlük) olarak Aβ 42 ifade etkileri mütevazı ama zaten saptanabilir (kemotaksi endeksinde ~ 10% azalma, ref bakın. 8). Bu deneyin sonuçları Şekil Örnek 1C ve 1D gösterilmiştir. En DA1262 solucanlar, yakın cezbedici nokta (Şekil 1C) bulundu, ya da edildi. Buna Aβ 42 ifade sadece birkaç solucanlar cezbedici nokta (Şekil 1D) bulabiliriz. Biz sırasıyla DA1262 ve FDX (ses25), için biotin 0.68 için bir kemotaksis indeksi ± 0.09 ve 0.12 elde 5 test plakaları / genotipi dağıtılan 100 hayvan / genotip ± 0.04 test. Aktif solucanlar tek tek aldı ve test plakasının merkezine transfer edildi. Bu değil sadece hızlı bir şekilde önemli değil, aynı zamanda aksi takdirde birkaç dakika için etkin kalır ve cezbedici izlemek için başarısız olabilir, çünkü hafifçe solucanlar aktarın. Deney sonunda biz monitör solucanlar bir tavsiyeOnların yolları bakarak ctivity. Sadece birkaç parça görünür ise genellikle plaka atın.
FDX (ses25) solucanlar ASER nöronlarda GFP floresan (gösterilmemiştir) yaşamın ilk on gün içinde kaybolur. Bu, bu hücrelerin Aβ 42'nin varlığı nedeniyle apoptoz göstermektedir. Bu yüzden, belirlenen olmadığı gibi apoptoz, geniş spektrumlu bir inhibitörü kaspaz inhibitörü N-(2-kinolil) valil-aspartil-(2,6-diflorofenoksi) metil keton (Q-VD-oph) 13 ASER hücrelerinin kaybı durdurabilir . Bu amaçla, protokol 3 'te tarif edildiği gibi hazırlanmıştır 14 embriyolar, primer kültürlerinde nöronların ASER kullanılmıştır. Genç (4 günlük) FDX (ses25) kültür nöronların görüntüleri ile birlikte solucan bir ASER nöron Temsilcisi görüntüleri Şekil 2A-C gösterilmiştir. Kültür ASER hücreleri (Şekil 2B) kısa ömürlü idi. 0.3 mg / ml ile beklenen kuluçka gibi Q-VD-OPH taze, günlük c takviye ompletely floresan ASER nöronların kaybı durdu. Kültür primer nöronlar ile çalışırken bir fırsat hücre yoğunluğu korumak için önemlidir. Bu parametre, özellikle yumurta elde etmek için kullanılmaktadır kurtların sayısı bağlıdır. Biz standart bir hemasitometre ile hücre yoğunluğu ölçmek ve hücre kültüründen hücre kültürü için sürekli hücre yoğunluğu korumak için özen. Bu gibi farmakolojik deneyler burada açıklandığı için dört birleşik 10 cm tabak hasat elde edildi ~ 200.000 hücre / cm 2 ile çalıştı. Hücreler, 24-çukurlu plaka 12 kuyu içinde plakalanmıştır. En iyi sonuçlar için onlar kümeleri oluşturmak eğilimi olarak tohumlama önce embriyonik hücreleri ayırmak için de önemlidir. Biz bir 27 iğne ve aristokrasiye geri süspansiyon aspire ileri kez bir çift ile bir şırınga kullanın. Bu genellikle hücrelerin (özellikle başlangıçta bir mikroskop altında süspansiyon kontrol etmek için öneririz) en ayırmak yeterlidir.
t "fo: keep-together.within-page =" her zaman ">
Şekil 1. Kemotaksis testi. A. Temsilcisi kemotaksisini plakası. Cezbedici (biotin) ve kontrol noktaları bir içi boş ve dolu daire ile işaretlenmiştir. B. biotin bir degrade oluşturmak için kullanılan agar 0.5 cm çapında bir parça ile yüklü bir kemotaksisini plaka. Agar parçası cezbedici nokta etrafında solucanlar bir cam Pasteur pipeti. C. Temsilcisi dağıtım üst tarafında kullanarak 10-cm plaka kesildi. Bu örnekte DA1262 solucanlar çoğunluğu FDX (ses25) solucanlar C. olduğu gibi cezbedici kaynağı (biotin). D. lokalize başardık. Bu biotin-duyarsız solucanlar plaka etrafında dağınık dağıtım sergilendi ve sadece birkaç cezbedici nokta yakınlarında bulundu.
tp_upload/50435/50435fig2.jpg "/>
Şekil 2. C. Kültür elegans embriyonik hücreler. A. Floresan mikroskobu görüntüsü (sol resim) ve parlak ışık (sağ resim) bir FDX (ses25) transgenik solucan baş alınan. Bu solucan Kıbrıslı Rumları-5 organizatörü tarafından tahrik ASER nöron GFP ifade eder. FDX (ses25) embriyonik hücre kültürü B. Parlak ışık görüntü. Ölçek bar 5 mikron. Bir kültür FDX (ses25) ASER nöron C. Floresan mikroskopi görüntü. Görüntüleri bir dijital kamera ile donatılmış bir Olympus BX61 mikroskop ile alınmıştır. D. Örnek deney kültürlü, yaş-senkronize, ASER nöronların canlılığı test. Hücreler de devam DA1262 embriyolar (içi boş daireler) veya FDX (ses25) embriyo elde edilmiştir olmaması / 300 ng / ml Q-VD-Oph (içi boş ve dolu kareler, sırasıyla) varlığı. GFP flöresan ortadan kalkması, bir nöronun canlılığı bir ölçüsü olarak kullanılmıştır. Eskiperiment ~ 300 floresan ASER nöronlar ile başladı. Canlılık 100 * (Günlük 1 floresan hücre sayısına bölünmesiyle gün X de floresan hücre sayısı) olarak hesaplanmıştır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada C. kullanarak amylopathies hücresel ve moleküler yönlerini incelemek için, kombine yaklaşım tarif elegans. Bu yaklaşımın avantajları şunlardır:. 1) düşük maliyetli C.elegans oda sıcaklığında, bakterilerle numaralı seribaşı normal bir Petri kabı korunur. 2) Güçlü genetik. Transgenik hayvanlar birkaç ay içinde elde edilen promotör sekansları ve geniş bir dizi spesifik nöronlarda istenen genin ekspresyonunu yürütmek için kullanılabilir edilebilir. 3) Basit, iyi karakterize, sinir sistemi. C. elegans son derece basit bir sinir sistemi (302 nöronlar) sahiptir. Bu basitlik hücre soyu, her nöronun belirli bir işlevi / rol ve sinaptik bağlantıları da dahil olmak üzere solucan en sinir sisteminin kapsamlı karakterizasyonu tanınan vardır. C sınırlamaları elegans gibi immünhistokimya gibi standart biyokimyasal tekniklerin uygulanması ve neu yalıtım kalın bir cilt (manikür) engel hücreleri, küçük boyutu dahilRons dış ortam oluşturur. Bu nedenle, farmakolojik yaklaşımlar C de sınırlı bir etkiye sahip olabilir Primer hücre elegans. Kültürler kısmen bu sorunu iyileştirmek için geçerli bir strateji temsil eder.
Bu deneysel protokollerde önemli adımlar solucanlar büyük miktarlarda ile başlayan ve yumurta, embriyo vb kaybetmemek için hazırlıklarını izleme içerir. Ayrıca enjeksiyon sırasında hayvanlar için öğrenmek için çok önemlidir. Büyük bir pipet ile delme ya da çok fazla DNA karışımı enjekte, çok uzun agaroz ped solucanlar tutmak geri dönüşümsüz zarar verebilir. Dönüşüm verimlilik, tekrarlanabilirlik ve transgen ifadesi değişebilir. Verimlilik enjeksiyon karışımı saflık ve bileşimi (kodlamayan DNA varlığı) ile ilgilidir. Ekstrakromozomal diziler hayvandan hayvana değişir, bu nedenle transgen başına 2-3, en azından bağımsız hat oluşturmak için çok önemlidir. Öte yandan, ve buna ek olarak sindirilirKarışıma genomik DNA aşırı ifadesi, transjenik azaltmak için geçerli bir strateji temsil eder. Kemotaksis deneyleri nispeten sorunsuz bulunmaktadır. Ancak yanlış sonuçlar önlemek için konsantrasyon degrade tutarlılık korumak için çok önemlidir. Pasteur ile kesilmiş pipet-ve dengeleme zaman sabiti korumak örneğin boyutu-aynı agar parçaları kullanın. Varsa, bir pamuklu çubukla fazla çözüm çıkarın.
Sonuç olarak, burada basit, genetik uysal organizma amylopathies moleküler yönlerini araştırmak için kullanılabilir bir örnek sağlar. Aynı deneysel teknikler diğer nöronal protein çalışma ve hastalığın hayvan modellerinde yeni nesil ile uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
References
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer's disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
- Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
- Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
- Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
- Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
- C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222 (1997).
- Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
- Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
- Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
- Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
- Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
