Summary
지질 세포막에 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널의 완전한 재구성에 대한 절차를 설명합니다. 재구성 채널은 생화학 적 분석, 전기 녹음, 리간드 스크리닝 및 전자 결정학 연구에 적합합니다. 이러한 방법은 다른 막 단백질의 구조 및 기능 연구에 일반적으로 응용 프로그램이있을 수 있습니다.
Abstract
축소 된 패션 지질 단백질 상호 작용을 연구하기 위해, 잘 정의 된 지질 성분의 막으로 막 단백질을 통합 할 필요가있다. 우리는 프로토 타입 전압 문 칼륨 (Kv 값) 채널의 지질에 따라 게이트 효과를 공부하고, 다른 멤브레인 시스템으로 재구성 채널에 대한 자세한 절차를 일한. 우리 재구성 절차는 세제에 의한 소포의 융합 단백질 / 세제 지질 / 세제 혼합 미셀과 미셀뿐만 아니라 단백질 / 세제 / 지질과 세제 간의 지질의 평형 분포에 도달의 중요성의 융합을 모두 고려 걸릴 / 지질 혼합 미셀. 우리의 데이터는 지질 소포에있는 채널의 삽입 방향이 상대적으로 무작위 것을 제안하고, 재구성 효율은 감지 단백질 집계가 분획 실험에서 나타나지 않았다 너무 높다. 우리는 재구성을 활용 한다른 지질 채널의 구조적 상태를 결정하는 D 채널은 평면 지질 이중층에 통합 채널의 소수 파지 - 표시 펩타이드 라이브러리의 형태 특정 리간드에 대한 화면의 전기적 활동을 기록하고, 2 차원 결정의 성장을 지원 세포막 채널. 여기에 설명 된 재구성 절차는 특히 진핵 전압 게이트 이온 채널의 지질 효과를 조사, 지질 이중층의 다른 막 단백질 연구에 맞게 수 있습니다.
Introduction
전지 교환 재료 및 특정 막 단백질 1의 기능을 통해 환경 정보를 제공합니다. 세포막에있는 막 단백질 펌프, 채널, 수용체, intramembrane 효소, 링커 및 세포막에 걸쳐 구조 후원자로 작동합니다. 막 단백질에 영향을 미치는 돌연변이는 많은 인간의 질병에 관련되어있다. 그들은 중요하고 세포막에 쉽게 접근 할 수 있기 때문에 사실, 많은 막 단백질은 기본 약물 표적이었다. 그것은 세포막의 다양한 막 단백질의 구조와 기능을 이해하고, 그것이 가능한 인간의 질병에 돌연변이 단백질의 해로운 영향을 완화하기 위해 새로운 방법을 고안 할 수 있도록하는 것이 매우 중요합니다.
지질 이중층 2, 3에 통합 된 모든 막 단백질을 둘러싸고 있습니다. 진핵 세포의 세포막, 지질의 여러 가지 유형 microdomains 4, 5로 구성되는 것으로 알려져있다.많은 막 단백질이 microdomains뿐만 아니라 세포막 3, 6의 부피가 큰 유체 상에 분산 할 보였다. microdomains 및 막 단백질의 전달 그들에와 같은 배포판의 생리적 의미의 조직을 기본 메커니즘은 분명 중요하지만 제대로 이해 남아있다. 막 단백질의 지질 효과를 연구 한 주요 기술적 인 어려움은 거의 모든 재구성 단백질 기능 7아르 수 있도록 생화학 적으로 잘 통제 지질 성분의 막으로 막 단백질을 정제 안정적인 재구성이다. 지난 몇 년 동안, 우리는 다시 구성 A.에서 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널을 방법을 개발 구조 및 기능 연구 8-10에 대한 다양한 멤브레인 시스템에 pernix (KvAP). 다른 사람의 데이터와 우리가 함께 지질 가능성이 전압 감지의 구조적 변화 결정 요인임을 보여 주었다전압 - 게이트 이온 채널의 도메인이 채널 11의 일부 구조를 형성 할 수 있습니다. 다음에, 우리는 우리의 방법에 대한 자세한 설명을 제공하고 가능성이 우리의 결과를 성공적으로 재현뿐만 아니라 다른 막 단백질의 연구에 대한 우리의 방법의 확장을 보장합니다 중요한 기술 팁을 제공합니다.
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Protocol
1. 표현과 KvAP 채널의 정화 (그림 1)
- 준비 작업 - 일 0
- 일반 식기의 세제의 흔적을 제거하는 탈 이온수 (diH 2 O) 및 MilliQ H 2 O (MQH 2 O)과 세균 배양 용 유리 플라스크를 씻어.
- 2.8 L 삼각 플라스크에 멸균 1,000 ML의 LB 배지 (총 2 리터 여기에 예를 들어 문화). 물이 낮은 경도 변형 박테리아의 성공적인 문화에 중요한 것으로 밝혀졌다.
- 500 ML 플라스크에 멸균 100 ML의 LB 배지
- 200 NG와 XL1 - 블루 능력 세포의 60 μl를 변환 pQE60 플라스미드 / 100 μg을 포함하는 두 LB-한천 플레이트에의 C-말단 접시, 박테리아에서 트롬빈 절단 사이트와 그의 6 태그 KvAP에 대한 유전자를 포함 ML 암피실린, 그리고 37 ° C 배양기에서 14-16 시간 동안 그들을 품어.
- KvAP의 표현 - 1 일
- 응용 프로그램을 확인하룻밤 배양 후 접시에 박테리아 식민지 earance. 식민지는 일반적으로 직경이 약 0.2 ~ 0.5 mm이었고, 그들 중 많은이 있었다. 우리는 위성 식민지의 많은 둘러싸여 큰 식민지 항구 판을 싶지 않아요.
- 하룻밤 배양 각 LB-한천 플레이트에 5.0 ML의 LB 배지를 추가하고 식민지를 스크랩. 500 ML 플라스크에 압력 가마로 소독 100 ML의 LB 배지에 박테리아 현탁액을 전송합니다. 100 μg / ML의 최종 농도에 암피실린을 추가 ° C 37 ~ 1 시간 동안 작은 문화를 배양하거나 OD600까지 0.60에 도달합니다.
- 한편, 장소에 37에 1.0 L의 중간에 두 개의 플라스크 ° C 배양기 매체를 따뜻하게 BaCl 2 (1.0 M 각각 1.0 L의 문화에 10 mM의 최종 농도) 20 ㎖를 준비하는 동요, 2.0 ML 0.4 M IPTG (이소 프로필 티오 β-갈 락토), 물 100 MG / ML 암피실린 주식의 2.0 ML.
- 작은 문화가 준비되면, ampici 1.0 mL를 BaCl 2 10 ㎖를 추가단계 1.2.2에서 미리 예열 LB 미디어에 작은 문화 LLIN 주식, 50 ML. OD600 0.05 주위해야한다. 물이 높은 경도와 LB 매체에서 카운터 이온 때문에 가능한 침전보세요. 바 2 +는 칼륨 채널을 차단 이온 전류의 기공 도메인에 바인딩하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 박테리아 채널의 높은 수준의 표현의 독성을 감소합니다.
- 이 0.9-0.8에 도달 할 때까지 0.70를 도달하고, 매 15 분마다 때까지 매 시간마다 OD600를 가져 가라. 우리의 셋업, 보통 0.8에 도달하기 ~ 5 시간이 걸립니다.
- 채널 단백질의 유도 발현을 시작하고, 동요 225 RPM으로 37 ° C에서 또 다른 4.0 시간 동안 문화를 품어 IPTG 0.40 밀리미터를 추가합니다.
- 수확 15 분 4,000 XG, 4.0 ° C로 회전하여 1.0 리터 원심 분리기 병의 세균. 폐기물 비커에 가능한 한 많이 뜨는을 가만히 따르다, 모든 바 2 침전하는 10 ML 1.0 M 나 인산염 버퍼를 추가 + 한 다음 추가박테리아를 죽일 표백제의 작은 양. 밤새 4.0 ° C 냉장실 얼음에 묻혀 원심 분리기 병에 수확 박테리아를 유지합니다.
- KvAP 단백질의 정제 (2 일, 3 그림 1B)
- 1.0 L의 문화 당 IMAC 용해 버퍼의 15 ML에 박테리아 펠렛을 resuspend을. ~ 1.0 U DNase의 I, 및 펩틴의 세 가지 단백 분해 효소 억제제, 아프로 티닌 1.0 ㎍ / ㎖에서 pepstatin을 추가합니다. 2 리터 문화의 총 부피는 ~ 35 ML했다.
- ON 시간 총 10 분 동안 얼음에 묻혀 금속 비커에 재 부유 세균을 초음파 처리. microprobe의 sonicator은 4.0 ° C 냉장실에 40 %의 출력 전원주기 OFF / 10 초에서 5 초에 설립되었다. 박테리아의 대부분은 솔루션에서 많이 가열하지 않고 용해 된 있도록 출력 설정은 경험적으로 결정되었다.
- 초음파 처리 세포 파쇄에 건조 분말과 3 혼합물을 품어, N-데실-β-D-Maltoside (Anatrace에서 졸 - 학년 DM) 0.50 g을 넣고일정한 수평 흔들림 (~ 100 RPM) 가능한 한 많은 채널 단백질을 추출하기 위해 실온 (RT)에서 0.5 시간. 그것은 세제 분말이 완전히 30-50 분 동안 용해되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
- 세제 추출 후, 실온에서 30 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 파쇄에서 세포 파편을 제거합니다. 완료 원심 분리를 기다리는 동안, 상자 1에 설명 된대로 그의 - 태그 기반의 LC (저압 액체 크로마토 그래피) 컬럼을 준비합니다.
- 1-2 연동 펌프에 의해 구동되는 ML / 분의 유속으로 사전 포장 IMAC은 (i m ETAL 이온 ffinity C hromatography을 mmobilized) 컬럼에 단계 1.3.4에서 상층 액을로드합니다. 또는 추출 된 그의 - 태그 단백질은 회분식 바인딩에 대한 IMAC 수지로 배양 할 수 있습니다.
- IMAC 세척 버퍼의 5 침대 볼륨을 실행하여 IMAC 수지를 씻어 IMAC 세척 버프의 10 침대 볼륨어 플러스 20 mM의 이미 다졸. 인라인 UV 모니터는 세척이 깨끗한 있는지 확인하는 데 사용됩니다.
- 300 mM의 이미 다졸을 포함하는 IMAC 용출 버퍼를 적용하여 KvAP 단백질을 용출. 바인딩 KvAP의 대부분은 칼럼을 통해 용출 버퍼 6 ML에서 용출된다. 풀링 용출 분수에 트롬빈을 (단백질의 2-3 밀리그램 당 1.0 U) 추가 다니엘 그의 6 태그에 벤치에 하룻밤 단백질을 배양한다.
- 다음날에 트롬빈 소화 단백질 용액을 집중 Centricon (MWCO가 = 30K) 아래 사이즈 제외 FPLC (빠른 단백질 액체 크로마토 그래피) 600 μL합니다. 원심 분리하는 동안, 단백질 응집을 최소화하기 위해 샘플마다 5 분 섞는다. 단백질이 집중되면서, 멤브레인 필터에서 지역의 농도가 높아지고, 때로는 클리어 화이트 그렇지 않으면 필터 멤브레인을 방해 할 수있는 침전물이있다. 또한 집중의 하단에있는 단백질의 높은 농도 (~ 5-10 MG / ML)는 이마에 이르게니쉬 색상과 혼합 실제로 샘플 손실을 최소화하는 데 도움이됩니다.
- FPLC 평형 버퍼 사전 평형입니다 Superdex 200 컬럼을 통해 집중 KvAP를 실행합니다. 일반적으로 12.3 mL를 보존 볼륨 DM 용출에 합체 KvAP 채널의 피크입니다. 단량체 KvAP의 작은 금액을 가지고 13.6 주위 ML,의 작은 후행 꼬리가있다. 우리가 사용하는 컬럼의 무효는 7.0 ML에 있으며, 일반적으로 샘플은 거의 KvAP 단백질을 포함 무효의 작은 피크에 상승을 제공합니다. 이미 다졸은 용출 (~ 24 ML)의 끝에서 온다. 함께 KvAP tetramers을 포함하는 분수 아래로 0.5 ML에 단백질 용액을 집중 수영장. : URL, 280 nm의 [참조 12시 KvAP의 예상 소멸 계수 (방향족 잔기의 수에 따라 계산되었다 ~ 1.2E-5.0 M -1 cm -1)를 사용하여 시료의 농도를 결정 http://를이 web.expasy.org / protparam /].
실온에서, DM의 정제 KvAP 단백질의 상당한 손실없이 적어도 일주일 동안 안정적입니다. ° C 4시에, 심지어는 더 오래 지속될 수 있습니다. 세제의 단백질을 고정하지 마십시오. 그것은 4 ° C에서 DM에있는 단백질을 저장하는 것이 좋습니다, 상온에서 β-OG의 단백질이다. 그러나 우리는 일반적으로 대기하고 단백질 준비가 즉시 재구성 단계로 진행하지 않습니다. - 분석 SDS-PAGE 젤을 감소시키는 12 %의 샘플입니다.
위에서 설명한 각 단계에서 시료는 1.0 % β-ME와 보충 배 SDS-샘플 버퍼 (버퍼 표 3)과 표본의 20 μl를 혼합하여 제조 하였다. 샘플 삶은되지 않았습니다. 젤이 준비가되면, 샘플은 일반적으로 상온에서 10 분 이상을 위해 SDS-버퍼에 있었다. 젤이 실행 쿠마시 블루로 염색 한 후, 야생형 KvAP 주위에 26 kDa의 (그림 1B에 하나의 밴드로 나타났다
2. 이온 채널 재구성
2.1. 소포의 리포좀 준비와 세제에 의한 융합
지질 준비하기 전에, 14 ML 일회용 유리 시험관, 나사 덮인 유리 튜브 및 클로로포름 250 μL 유리 주사기를 씻어. TestTube에에 ~ 10 ㎖ 클로로포름을 붓는다.
- 파르 미트 - oleoyl-phosphatidyl-에탄올 아민 (POPE)와 파르 미트 - oleoyl-phosphatidyl-글리세롤 (POPG) 리포좀의 제조.
- 교황의 3.75 밀리그램 POPG의 1.25 MG (POPE : POPG = 3:1 중량비) 전송 전 청소 나사 덮인 유리 튜브에 클로로포름을 아르곤 가스의 연속 스트림에서 지질을 건조. 눈에 띄는 클로로포름이 남아 있지 않을 때, 한 시간 룸 진공 추가 지질을 건조.
- 소금 버퍼 낮은 440 μL (10 MM의 HEPES, pH를 7.4 추가) 또는 물 건조 지질와 소용돌이 하이드레이트 지질의 튜브에. 지질 서스펜션은 약간 흰 및 혼탁 보인다.
- 소포 솔루션 (OD410 <0.2) 반투명이 될 때까지 얼음처럼 차가운 목욕 sonicator에서 지질 현탁액을 초음파 처리.
일반적으로 물이나 낮은 소금 버퍼에 10 ㎎ / ㎖ POPE / POPG 솔루션을 위해, 우리는 15-20 분 총 30 초 ON, 30 초 OFF (얼음)로 sonicator를 운영. 때문에 초음파 중에 생성 된 열, 그것은 지질 산화를 최소화하고, ° C 이하 10 sonicator의 물 목욕을 냉각하기 위해 지질 용액에 1.0 MM의 DTT를 추가하는 것이 좋습니다. 최종 OD410은 지질 따라 달라집니다. 특정 지질의 경우는 이러한 낮은 OD에 도달하기가 매우 어려울 수 있습니다. 그렇게되면, 우리는 일반적으로 완전히 지질을 용해 및 장기 배양이 단백질 함유 미셀 (다음 참조) 주변 지질이 잘 분포에 도달 할 수 있도록 세제를 사용하십시오.
대용량 목욕 sonicator 오드 중요하다ER은 OD410 <0.2에 도달. 우리는 실험실 용품 유한, Inc의 (모델 # G112SPIG, 힉스 빌, 뉴욕)에 의해 만들어진 시스템을 사용하고있다. 소포의 적절한 초음파의 핵심은 튜브의 중간에 공진 센터는 강한 진동을 가지고 있는지 확인하는 것입니다. 진동은 물의 양에 따라 다릅니다 따라서 조정할 수 있습니다. 또한 그것은 경험적으로 글리세롤의 작은 금액을 추가하여 물의 점도가 증가하여 초음파의 효능을 향상시킬 수 있음을 발견합니다.
또는 우리는 플라스틱 또는 금속 관의 지질 서스펜션과 접촉 microprobe의 sonicator를 사용하여 동일한 결과를 생성 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. microprobe를 청소해야 만 팁 지질 용액에 담그지입니다. 지질 입자가 microprobe의 표면에 작은 조각으로 부러 때문에 샘플이 냉각 유지하는 것이 매우 중요합니다, 일부는 불포화 지질의 산화를 방지하기 위해 주위에 환원제있다.
cryo - 전자 MICR 이하oscopy, 초음파 처리 unilamellar 소포의 대부분은 직경 30-50 nm의 (데이터 표시되지 않음)입니다. 작은 포드 SUV의 곡률이 작은 섭동 직경이 80 ~ 200 nm의 (다음 참조)은 더 큰 것들로이 소포의 역동적 인 융합을 유도 할 수있을만큼되도록 높다. - 3.0 M KCl을 50 μL와 최종 지질 정지 300 MM의 KCl을하고 DM 10 밀리미터가되도록 혼합물 DM 0.50 M의 10 μl를 추가합니다. 지질 / 세제 혼합 미셀을 형성 RT에서 2 시간 동안 수평 회전 솔루션을 품어. 부화 후, 서스펜션은 작은 unilamellar 소포의 세제에 의한 융합에 의한 약간의 혼탁 (그림 2A)가 있어야합니다.
- 단백질이 2.0 이상에 집중 될 때 MG / ML에 지질 / 세제 혼합물에 0.50 밀리그램 KvAP 단백질, 3.0 M KCl을 50 μl의 물에 0.50 M DM 주식의 16 μL, 10 MM의 HEPES, pH를 7.4 추가 최종 부피 1 ㎖를 확인합니다. 최종 지질 : 단백질 무게 비율은 10:1과 DM의 최종 농도는 18 mM의 (그림 2A)입니다. 또 다른 2 시간 동안 수평 회전 유리관에있는 단백질 / 지질 / 세제 혼합물을 품어.
세제 농도의 선택은 세제에 의한 소포 융합 및 소포 가용화 (13)에 의해 유도된다. 소포는 강력한 초음파에 의해 형성 될 때의 평균 직경은 EM에서 30 ~ 50 ㎚의 범위에 있습니다. 이 소포는 410 nm의 매우 낮은 산란있다. 낮은 농도에서, 세제가 처음 소포에 삽입, 소포를 불안정하게하고, 세제 포화 소포 (OD410가 간다, 그림 2A 참조)의 융합을 유도. 소포 융합 OD410 ㎚의 증가로 이어집니다. 10 ㎎ / ㎖ POPE / POPG 소포를 들어, DM 약 15 밀리미터에서 OD410 봉우리. 더 많은 세제가 도입 될 때, 소포는 조각에 침입하고 지질이 세제 / 지질 혼합 미셀로 분할 될 시작합니다. 이 후자의 과정에 의해 동반최종 낮은 수준 (<0.1)을 다운 OD410의 감소.
때문에 때문에 작은 소포의 세제에 의한 융합 광학 밀도의 상승 단계에서 활성 퓨전 사건, 그것은 단백질 / 세제 미셀 적극적으로 세제 포화 지질 소포와 융합 될 가능성이 높다. 단백질 / 지질 / 세제 혼합물을 준비하는 시간 DM 18 mm의 선택 뒤에 이유는있다. 세제 4 겹 이상으로 농축 될 경우, DM 요구 금액은 최종 농도가 18 ~ 20 밀리미터의 주위에 계속되도록 조정할 수 있습니다. 단백질 수율이 매우 낮은 경우, 그것은 농축 세제는 샘플에 얼마나 평가하기가 어렵습니다, 우리는 대신에 완전히 용해 지질과 단백질을 혼합하고 재구성을 위해 완전히 평형 혼합물을 사용합니다. 우리 손에, 충분한 시간이 단백질을 함유하고 단백질 무료 미셀, reconstitut 간의 지질의 좋은 평형 분포에 도달 할 수 된 경우이온의 효율성이 크게 떨어졌다. 우리는 일반적으로 두 가지 실험으로 재구성 효율성을 테스트 : 1) 자당 밀도 구배 원심의 소포 분수와 단백질의 공동 마이그레이션을 검토, 2)의 분별을 재구성 소포의 단백질을 추출하고 젤 (우리의 경우 KvAP) 합체로 남아 얼마나 많은 단백질을 찾기 위해 여과 열입니다. 단백질 / 지질 / 세제 배양의 최소 시간은 실온에서 또는 야간 4도에서 몇 시간이다.
다른 세제 안정되어 새로운 막 단백질의 경우, 첫 번째 단계는 그림 2a에서 보여진다 것과 유사한 같은 세제에 의한 지질의 가용화 속성을 찾을 것입니다. 다음으로는 E.로 PC 추출물로 시작하는 것이 좋습니다 특정 단백질의 기능에 대한 특정 인지질을 필요로하는 경우 대장균 극지 추출물 PC, 대두 PC 추출물 등, 그래서, 그것은 이미 extrac에 포함 할 수 있음테드 지질 혼합물.
- 세제 가용화와 혼합물 KvAP의 제조 1,2 - dioleoyl-3-트리메틸 - 프로판 (DOTAP) 또는 1,2 - dioleoyl-SN-팔미-3-숙시 네이트 (개) --- 완전한 지질 용해도의 예 재구성을위한
- 지질 준비 POPE / POPG 소포의 경우와 동일합니다. 작은 unilamellar 소포에 수화 지질의 초음파 교황 / POPG 지질 (보통 5-10 분)보다 긴 시간 (보통 45 ~ 60 분)이 필요합니다. 개 소포는 천천히 서로 융합 작은 기름 방울을 형성 할 수 있습니다.
때문에 DOTAP와 강아지의 높은 품질의 포드 SUV를 만드는 어려움 재현성, 우리는 일반적으로 완전 단백질과 혼합하기 전에 이러한 두 가지 지질을 용해. - 완전히 DOTAP 또는 개를 가용화하는, 초음파 처리 소포는 DM 10 mm와 40 mM의 N-옥틸-β-D-글루코 시드 (β-OG)로 혼합한다. 지질 / 세제 혼합물 (> 15 시간) 밤새 배양합니다실내 온도에, 그리고 혼합물은 작은 입자 나 물방울이 없어야합니다. 대신 그것은 매우 분명하다. 이 단계에서 완전한 평형에 도달하지 않으면 multilamellar 소포의 상당 부분의 형성으로 이어질 것입니다.
- 보다 작거나 1:10 같다 지질 비율 : 단백질 세제 가용화 DOTAP 또는 강아지와 KvAP 단백질을 섞는다. 단백질 / 세제 / 지질 혼합물 엔드 오버 엔드 회전 2 ~ 3 시간 동안 상온에서 배양 할 수있다.
- 지질 준비 POPE / POPG 소포의 경우와 동일합니다. 작은 unilamellar 소포에 수화 지질의 초음파 교황 / POPG 지질 (보통 5-10 분)보다 긴 시간 (보통 45 ~ 60 분)이 필요합니다. 개 소포는 천천히 서로 융합 작은 기름 방울을 형성 할 수 있습니다.
2.2. proteoliposomes을 형성하는 세제의 제거
- 투석 --- 상대적으로 높은 임계 미셀 농도 (CMC ≥ 1.0 ㎜)가 같은 DM 및 β-OG으로 세제의 느린 제거,
각 1.0 ML의 혼합물 용 2 리터 투석 버퍼 (표 3)을 준비합니다.
투석 튜브의 적절한 길이를 잘라 (MWCO = 10K, 0.70 cm 폭)을, 그리고 DI를 물로 씻어. 그것은 확인하는 것이 중요합니다튜브에는 누수가 없는지 확인하십시오. 민감한 샘플은 튜브 먼저 10 MM 트리스 - 염산 PH8.0 및 2.0 mM의 EDTA의 버퍼 처리 될 수 후 3-5 분 동안 끓는 물에 청소. 튜브는 다음 한쪽 끝에 고정 및 투석 버퍼로 세척합니다.
투석 튜브에 단백질 지질 세제 혼합물을로드합니다. 솔루션 왼쪽 위 최소한의 공간과 튜브의 양쪽 끝을 고정. 투석 버퍼에로드 튜브를 넣고 튜브를 천천히 솔루션으로 회전되도록 교반 판을 사용합니다. 매일 8 시간 한 번 투석 버퍼를 변경합니다. 단백질 지질 세제 혼합물이 완전히 분명했다 경우 첫 번째 버퍼를 변경 한 후 솔루션 흐린 될 것이다. 투석이 너무 빠른 경우, 솔리드 흰색 투석 튜브의 바닥에 침전물이있을 수 있습니다. 그것은 버퍼 변경시, 튜브가 문질러, 그리고 여러 번 반전 것이 좋습니다. 투석 버퍼의 다섯 변경 한 후, 소포는 일반적으로 준비.
우리는 지질 이중층에 소포를 촬영하여 세제의 잔류량을 확인합니다. 왼쪽 세제 여전히 상당한 양이있을 때, 이중층 거의 순간적으로 파손됩니다. 그것은 비색 방법을 사용하거나 소포 현탁액의 표면 장력을 측정하여 잔류 세제를 측정 할 수도 있습니다. - 낮은 CMC가 세제를 제거하는 데 도움이 폴리스티렌 구슬의 사용
많은 경우에, 우리는 DDM (물 CMC ~ 0.17 ㎜)의 낮은 CMC 세제를 사용합니다. 작은 소수성 구멍에 구슬이 세제에게 14를 제거하는 데 사용됩니다.- 구슬의 준비. 0.5 건조 구슬의 G와 50 ML 코닝 튜브에 넣어 밖으로 무게, 20 ML의 메탄올을 추가 5 분 동안 5,000 rpm에서 비즈를 스핀 다운, 갇혀있는 거품을 제거하는 5 분 동안 목욕 sonicator에서 솔루션을 초음파 처리 한 다음, 가만히 따르다 대부분의 메탄올. 에탄올과 MilliQ 물과 세척을 반복한다. 세척 구슬은 4 ° C에서 20 % 에탄올에 저장됩니다사용하기 전에 세제없는 버퍼로 변경해야합니다.
- 처리 할 단백질 / 지질 / 세제 혼합물 세제의 양을 추정하고, 세제를 제거하기 위해 필요한 구슬의 양을 계산합니다. DDM과 DM의 경우, 바인딩 용량은 10 ㎎ 세제 약 100 mg을 구슬입니다. 과잉의 물없이 젖은 구슬 중 무게, 그리고 단백질 혼합물에 직접 추가됩니다. 적어도 15 분은 충분히 효과가 구슬에 필요한 세제 농도의 감소는 정상 수준의 14 ~ 16에 도달합니다. 이러한 바이오 구슬 SM2로 ~ 18 밀리미터에 해당하는 1.0 ML 솔루션, 폴리스티렌 비즈 87 밀리그램의 총에 DDM (도데 실 maltoside)의 8.7 MG를 제거하려면 다섯 동일한 분수에 사용됩니다. 상온에서 일정 엔드 오버 엔드 회전 20 ~ 30 분마다 분수와 단백질 / 지질 / 세제 혼합물을 혼합, 구슬의 회전 구슬의 다음 부분에 뜨는을 전송하고 끝까지 반복합니다.
때 세제 concentrATION는 CMC에 도달, 우리는 의도적으로 솔루션 세제의 작은 금액이 큰 것들로 작은 소포의 융합을 촉진 할 수 있도록 한 시간이에 대한 시간 기간을 연장. - 마지막 단계 이후 세제의 미량을 제거하려면, 35 MG 바이오 래드 SM2 구슬을 추가하고 4 시간 동안 소포에 품어.
세제 제거를위한 절차는 새로운 단백질에 적용 할 수 있습니다 위에서 설명한 경우는 ~ 1:10 단백질 / 지질 비율 (중량 / 중량)로 시작하는 일반적으로 것이 좋습니다. 지질 / 세제 혼합물은 충분히 신중 세제가 완전히 지질 (그림 2A)을 가용화에 추가 될 수 있도록 준비해야합니다. 그것은 일정한 흔들림 (400 RPM) 또는 최종 오버 엔드 회전 실온 (1 ~ 2 mM의 DTT 포함) 이상의 2 시간 동안 지질 세제 혼합물을 배양하는 것이 중요합니다. 단백질이 지질과 혼합 될 때, 단백질 / 지질 / 세제 혼합물 (하룻밤 단백질 stabl 경우 충분히 배양해야한다E) 단백질을 함유 미셀과 단백질이없는 미셀 사이 세제 및 지질의 분포가 상대적으로도되도록 실온 하나에서 또는 냉장실합니다. BioBeads를 사용하여 세제의 빠른 제거가 고용되어있는 경우 또한, 그것은 구슬의 세제 결합 능력을 발견하는 것이 중요합니다. 세제의 느린 제거 가능성이 단백질 무결성을 유지하고 상대적으로 상당한 소포에 삽입되기에 충분한 지질있을 것이라는 점을 보장합니다.
2.3. proteoliposome의 저장 및 품질 관리
- 소포가 준비되면 액체 질소에 직접 폭락으로 분주을 50 μL의 aliquots로 그 (것)들을 준비하고 플래시 동결. 냉동 소포는 다음 -80 ° C 냉동고에 저장됩니다. 동결 - 해동 사이클이 때로는 우리의 CYS 특정 반응에 유물을 소개하는 발견 되었기 때문에 생화학 적 분석을 위해, 우리는 냉동 소포를 사용하지 않습니다. 전기 녹음을위한의, 우리는 6 개월 미만 -80 ° C에 저장됩니다 소포를 사용합니다.
- 밀도 기울기의 소포의 부상 (그림 2B)
- 4에서 4 시간 동안 20만그램에서 10 MM HEPES와 스핀에서 만든 0.3 ML 10, 35 각각 55 % 자당을 포함 자당 기울기의 층 위에 ° C.에 소포 현탁액의 50 μl를로드 가속 및 레이어 사이의 인터페이스의 중단을 피하기 위해 천천히 감속.
- 맨 처음부터 100 ㎕의 분수를 수집하고 비 환원성 SDS-PAGE (그림 2B)에 그들을 실행합니다. KvAP은 0.5-1.0 마이크로 그램의 단백질 밴드가 명확하게 볼 수 있도록 쿠마시 블루와 잘 염색된다. KvAP 단백질은 10 ~ 35 %의 자당 사이의 인터페이스에서 찾을 수 있어야합니다. 단백질의 더 무거운 집계 거의 모든 단백질은 세포막에있는 것을 나타내는, 높은 밀도 범위에서 볼 수 없습니다.
- 소포에 KvAP 채널의 적절한 형태. <을 확인BR /> 우리의 이전 데이터가 제대로 이중층에 통합 된 단일 시스테인 돌연변이 (L125C/C247S) KvAP가 완전히 세포막에 묻혀 있으며, 시스테인 특정 시약 (8)에 의해 액세스 할 수 없습니다 설립했다. 재구성 절차는이 돌연변이 채널, 테스트 및 시스테인 특정 시약, MTS-PEG5000에 의해 확인되었다. 상온에서 1.0 μM MTS 시약과 L125C에서 수정 nonreducing SDS-PAGE 젤의 KvAP 밴드에 5kDa 변화를 소개합니다. 우리 재구성 절차의 성공적인 구현은 이중층의 모든 채널의 거의 완전한 삽입을 제안, 인지질 막에 L125C 돌연변이 채널에 대한 탐지되지 반응으로 이어질 것이다. 반응의 양성 대조군으로, 5.0 mM의 DM은 MTS 시약에 액세스 돌연변이 채널의 거의 모든 L125C 잔류 물을 렌더링하기 위해 도입된다.
또한, 같은 chrybdotoxin 같은 기공 바인딩 독소, 합체 채널을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 같은 항체 기반 바인딩(수직 주파수가 KvAP에 대한 형태 - 특정 리간드로 준비 상자 2 참조) 말은 재구성 소포에서 사용할 수있는 바인딩 사이트를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 결합 분석은 다음 재구성 채널의 분수 tetramers과 단백질의 어떤 부분 제대로 전압 센서 패들 (전압 센서의 S3/S4)가 무엇인지 파악하기 위해 총 단백질을 측정하는 정량 분석과 비교 될 수있다 접혀.
다른 단백질을 재구성 할 경우, 그것은 무엇을 재구성 단백질의 비율 것은 제대로 접혀 평가하는 정량 방법을 소개하는 것이 좋습니다. 주의 기능 검사는 이렇게 성공적으로 재구성을위한 좋은 품질 컨트롤을 개발하기위한 전제 조건이다.
3. 재구성 된 채널 함유 소포체의 응용
3.1. 기능 검정 지질 세포막에있는 이온 채널의 활동 연구.
N의 준비eeded 자재.
- 지질 준비
- 유리 테스트 튜브, 테프론 표면 나사 모자를 가진 호박색 유리 병, 클로로포름 유리 주사기의 집합을 청소합니다. 아르곤 가스의 흐름에 따라 호박 유리 병을 건조.
- 전송 825 밀리그램 교황 0.25 밀리그램 호박 유리 병에 클로로포름에 POPG 및 아르곤 가스 클로로포름을 증발시킬 것.
- 0.20 ML의 펜탄, 잔류 클로로포름을 제거하기 위해 완전히 건조와 건조 지질을 씻으십시오. 마지막 50 μL 데칸의 지질을 용해. 데칸 (20 MG / ML)의 지질은 실험 이중층 컵 (그림 3A)의 한면에 얇게 부분에 드릴 150-250 미크론 구멍 (그림 3B)에 걸쳐 지질 이중층을 그림에 사용됩니다.
- 솔루션을 준비
- 세포 내 용액 (트랜스) : 10 MM의 HEPES / KOH, 산도 7.4, 15 MM의 KCl을
- 세포 용액 (CIS) : 10 MM의 HEPES / KOH, 산도 7.4, 150 MM의 KCl을
- 소금 브릿지 : 벤드 유리 모세관U 자형 다리로, 그리고 세포 용액에 녹아있는 1.0 % 녹은 한천을 입력합니다.
트랜스와 시스 솔루션을 사이에 설립 삼투 기울기는 지질 이중층 17 소포 융합을위한 주요 원동력 것으로 나타났다. 음전하 지질를 들어, 15 mM의 염화칼슘 또는 양전하 폴리 아르기닌 펩티드 융합 이벤트를 유도 할 수있을 것으로 나타났다. 이러한 DOTAP와 개 등으로 Fusogenic 지질은, 지질에 도입 할 수는 융합 이벤트의 가능성이 높은 있도록 소포.
지질 이중층에 KvAP 채널에서 전기 녹음
- 이중층 컵 (그림 3B)의 원통 표면에 뚫은 둥근 구멍 (직경 ~ 0.25 mm) 사전 페인트. 지질은 실험실에서 만든 모세와 유 봉 전송됩니다. 모세관 유봉의 둥근 머리는 광택과 컵의 표면을 긁지 않습니다. 목모세관 유 의해 수행 지질의 전자 소량의 이중층 컵에 구멍이 퍼져, 공기 건조합니다.
- 데칸이 완전히 증발되도록 1 ~ 2 분 동안 기다립니다. 주의 구멍에 들어가기에서 지질 솔루션을 피하기 위해주의해야한다.
- 녹음 챔버에 컵을 넣고 소금 교량에 넣고 녹음 컵의 양쪽 (그림 4A)에 전극을 연결합니다. CIS 및 구멍의 양쪽에 횡단 솔루션을 추가합니다. 삼투 기울기는 지질 이중층에 소포의 융합을 촉진하기 위해 설립된다.
- ~ 0 (보통 <2 밀리 볼트)로 컵의 양면 사이의 오프셋 가능성을 조정합니다. 데칸 지질 혼합물의 작은 금액을 전송하고, 이중층 막 형성 될 때까지 구멍을 통해 지방을 그릴 모세관 유봉을 사용합니다. 이중층의 형성은 램프 펄스의 전송 중에 정전 용량 전류를 기록하여 감지됩니다.
- 막까지 기다려밖으로 가겠다 상대적으로 안정됩니다. 3-5 분 동안 막 용량에 더 많은 변화가 없음 때까지 기다려야합니다.
, 큰 구멍을 통해 형성되는 평면 이중층에 대한 일반적인 생각은 막 바로 중간 부분이 일반 이중층 두꺼운 ~ 4.0 nm의 수에 가까운 것입니다, 그것은 구멍의 가장자리에 가까이 오면 막 두께가 이 환형 주위입니다 데칸 용매의 대부분은 19 18입니다. 그것은 멤브레인의 중앙 이중층 부분에 남아있는 잔류 데칸가 불가피하다. N-데칸 대 PC의 볼륨 비율의 과거 추정 이중층 18, 20-22 숱이 후 0.35-0.45이었다. EM은 희석 이중층의 검사 이중층 (22)의 두 전단지 사이에 데칸의 렌즈가 있다고했다. 이러한 데이터는 지질 이중층의 세포막에 삽입 된 막 단백질은 데칸의 작은 섬 (최대 직경 50 nm의)와 함께 사용할 것을 제안했다. 잔류 데칸 전N 이중층은 0.4 ~ 0.5 측정 용량에 따라 희석 이중층의 크기의 대략적인 견적을 얻을 수 있습니다 μF / cm 2, 일정한 전기 용량을 감소시킨다. 100 PF 용량의 이중층 직경 ~ 180 ㎛의 원형 이중층 막에서 온다.
KvAP의 경우, 잔여 데칸는 채널 기능을주의 깊게 무용제 이중층에서 검토되지 않은 경우에도 불구하고, 그 전압에 따라 게이트를 손상하지 않았다. 같은 NaChBac 채널 BLMs 23에 삽입 Kv1.2 채널을 사실로 나타났다. 그것은 난자의 채널 데칸 지질 이중층 상대의 Kv1.2 채널에서 측정 GV 곡선의 중요한 왼쪽 시프트 잔류 데칸 23과 아무 상관이 있는지 여부를 아직 명확하지 않다. 이중층을 형성에 사용되는 지질에 따라 이중층에 잔류 데칸의 양이 다를 수 있습니다. 예를 들어이보고되었다 그 평면 지질 membr의 형성MGDG의 마취 (모노 갈 락토 - 디아 실 글리세롤)는 데칸 분자로 채워지고 원뿔 MGDG 사이의 틈으로 인해 발생 가능 데칸가 필요합니다. 잔류 데칸 공부 할 단백질에 미치는 영향이 있는지 여부는 순전히 경험하고, 실험 테스트는 효과가 중요한인지 여부를 알 필요가있다. - 마자 막 안정으로 0.5 ~ 1.0 μL 채널 함유 오른쪽의 구멍 위에 P2-피펫 팁의 좋은 끝을 배치하여 소포를 촬영합니다. 소포는 컵의 바닥에 구멍을 통해 아래로 떨어진다.
이 과정에서 여러 소포는 구멍을 통해 막에 부착된다. 충분한 시간을 감안할 때, 일부는 KvAP 채널의 작은 번호가 제대로 멤브레인의 중심 부분에 평면 이중층에 삽입되도록 이중층 부분에 융합되어 있습니다. 삼투 기울기 및 정전기 상호 작용은 모두 지질 이중층 17, 24에 소포의 융합에 중요하다. - 테스트하려면이중층의 KvAP 채널, 80 MV의 짧은 펄스는 -80 MV의 보유 잠재력 전달됩니다. 빠른 불 활성화 및 비활성화의 느린 회복, 긴 간격 (PE / PG 세포막의 채널 ~ 120 초)으로 인해 두 개의 펄스 사이에 제공됩니다. 교황 / POPG 막 채널의 전형적인 전류 기록은 그림 3C에 보여진다. 전류가 작은 경우에 더 소포를 촬영합니다. 현재 크기가 잘 보이는되면, 막의 양쪽에 솔루션의 이온 농도를 균형. 채널은 전기 생리학 실험 준비가되어 있습니다.
3.2. 소포의 채널에 대한 형태 - 특정 리간드에 대한 심사
- 파지 - 표시 라이브러리 소개.
파지 - 디스플레이 20 - 메르 펩타이드 라이브러리는 사상 살균 FD-TET 25의 한쪽 끝에 PIII 단백질의 다섯 복사본의 N-말단에 존재합니다. 도서관은 약을 제공합니다. 1 × 10 8 다르다임의의 20 - 메르 펩타이드 시퀀스의 엔트 유형, 그리고 친절 UT 남서 의료 센터 26 박사 Kathlynn 브라운의 연구실에서 당사에 제공되었다. E.에 파지 감염 대장균 K91 12 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린에 박테리아가 저항합니다.
세균 배양을위한 세부 절차, 파지 및 파지 식민지의 염기 서열의 증폭 및 titering는 우리는 다음 섹션에서 기본 작업에 대한 간단한 설명을 제공합니다 맥과이어, 외. (26)에 의해 기술되었다. 독자 맥과이어 용지에 대한 자세한 내용을 찾을 수 있습니다. 우리는 대신에 소포의 재구성 이온 채널 (그림 4A)에 단단히 결합 특정 클론의 분리에 초점을 맞출 것이다.
우리의 스크린 뒤에 기본적인 아이디어는 구체적으로 재구성 채널에 바인딩 파지가 소포로 내려 오게 할 수 있다는 것입니다. 바인딩 파지 지질 세포막 채널에 대한 증폭 및 테스트 할 수 있습니다. 우리의 연구다른 지질 세포막 KvAP 전압 센서의 구조적 변화 8은의 headgroup 지역에서 인산염을 포함하지 않는 사람들에게 정기적으로 인지질의 지질을 전환하여 "활성화"또는 "휴식"상태 중 하나에 전압 센서를 유지하는 것이 가능하다는 것을 보여 주었다 (DOTAP 우리의 실험 DOGS). 이 두 지질 정해진 conformations에이 형태 특정 리간드 우리의 심사에 활용된다. 파지 라이브러리가 먼저 DOTAP와 개 막 (양 선택)에서 채널을 꽉 바인더으로 선택되기 전에 인지질 소포의 채널 (음 선택)에 의해 포화 될 것입니다. - 파지 선택 뒤에 기본 절차
LB 배지에서 K91 박테리아의 성장 : 박테리아의 배가 시간은 37시 20 분 ° 동요 200 분당 회전 수와 C이다.
라이브러리의 증폭 : OD0.4에서 박테리아 K91와 파지 솔루션을 섞는다. 37 15 분 부화 후° C, 혼합물은 12 ㎍ / ㎖ 테트라 사이클린을 포함 -9.5 X 9.5 인치 2 한천 플레이트에 균등하게 분산되어, 큰 판의 사용은 높은 성장 속도가 박테리아에 의해 문화의 지배를 방지 할 수 있습니다. 라이브러리의 다양성 작하면, 10 cm 페트리 접시는 선택과 작은 규모의 증폭에 사용됩니다.
각각의 클론의 대규모 증폭 : 250 ML의 LB 플러스 5 mM의 황산 마그네슘 및 12 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린에 파지 (~ 100 백만)의 작은 나누어지는 접종 37에서 하룻밤 성장 ° C. 10 분 동안 6,000 rpm으로 회전하여 세포를 수집합니다. 상층 액을 수집하고 0.2 권 / 권 강수량 버퍼 (2.5 M의 NaCl, 20 % PEG8000)에 추가합니다. 1.0 시간 동안 얼음에 부화 후, 펠렛 모든 파지에 30 분 동안 17,000 XG에서 솔루션을 원심 분리기. 30 분 동안 얼음에 품어 1.0 ML PBS, 부드럽게 펠릿 (아무 소용돌이로 교반) resuspend을 추가, 모든 상층 액을 제거합니다. 신선한 튜브 현탁액을 전송하고, 14,00 원심 분리기2 분 0 RPM. 다른 튜브에 뜨는을 전송하고, 65에서 품어 ° C 모든 박테리아를 죽일 수있는 15 분 동안 물 목욕. 13,000 rpm에서 2 분 동안 튜브를 원심 분리기. 펠렛, 나누어지는을 취소하고 -80 ° C.에 파지 솔루션을 저장 - 지질 소포에 KvAP 채널에 대한 파지의 패닝.
- 펩타이드 표시 파지는 증폭하고 실험 때문에 단위 부피 당 파지의 수를 알 수 있습니다 그 전에 titered해야합니다. KvAP은 대조군으로,와 개에 POPE / POPG (3시 1분)와 0.50 % 비오틴 - DOPE의 소포로 재구성되었다 : 바이오틴-DOPE (199:1; 같은이 DOTAP 소포에 대해 수행되었다) 선택 대상으로 사용됩니다. 소포에 KvAP의 최종 농도는 0.50 ㎎ / ML이며, 지질 5.0 ㎎ / ㎖이다. 패닝 버퍼는 500 mM의 KCl을, 100 MM의 HEPES / KOH 산도 7.4, 0.10 밀리그램 / ML BSA가 포함되어 있습니다.
첫 번째 실행을 위해 ~ 10 10 파지 (각 유형을위한 100 부) 0.050 ML의 LB 배지로 희석 하였다. 이후 패닝 단계 성을위한arting 파지 6월 10일에서 8월 10일까지 이내로 조정했다. - 부정적인 선택 :
1.0 ML 패닝 버퍼, 100 μL NeutrAvidin 아가로 오스 비즈 (피어스 수지의 ML 당 바인딩 1-2 MG 바이오틴 BSA 수) 50 μL LB에 희석 파지를 품어. 10 분 부화 후 1.0 분 100 XG에서 그들을 회전하여 구슬을 분리합니다. 두 구슬에 직접 바인딩하는 파지를 제거하려면이 단계를 반복합니다.
어떤 단백질을 포함하지 50 μL 빈 소포와 이전 단계 (POPE / POPG 플러스 0.5 % 비오틴-DOPE)에서 왼쪽에 파지를 섞는다. 파지 - 소포 혼합물 패닝 버퍼로 세척 된 100 μL NeutrAvidin를 구슬로 장식을 추가합니다. 5 분 실온에서 혼합물을 회전 한 후, 30 초 동안 100 XG에 스핀 구슬을 제거합니다. 비오틴 - DOPE (199:1)뿐만 아니라 교황 / POPG 소포에 KvAP 채널 (0.5 % 비오틴-DOPE 포함)에 대한 :이 단계는 개 빈 소포에 대해 반복됩니다. 이러한 치료 contai 후 상층 액을NS는 파지를 완전히 삭제. 처음 두 화면 사이클 후 사전 승인을 POPE / POPG 소포에 KvAP에 대해서만 수행 할 수 있습니다. - 긍정적 인 선택
10 분 동안 상온에서 100 μL NeutrAvidin 구슬의 존재 비오틴 - DOPE (199:1) 소포 (DOTAP의 소포에 대해 동일) 강아지의 KvAP 채널 완전 삭제 파지를 품어. 10 분 100 XG에서 원심 분리하기 전에 팬 버퍼를 사용하여 15 ML에 혼합물의 양을 가져옵니다. 구슬을 수집하고 45 ML 패닝 버퍼 그들에게 세 번 씻는다. - 5.0 ㎍ / ㎖의 비오틴을 포함한 500 μL LB 배지에서 구슬을 resuspend을하고, 기본 비오틴보다 낮은 친화력이 NeutrAvidin에서 바인딩 된 파지의 일부를 해제하기 위해 두 시간 동안 실온에서 혼합물을 품어. 일분 100 XG에 스핀 구슬을 분리합니다. titering에 대한 두 개의 서로 다른 튜브에 뜨는 구슬을 수집합니다.
- 선택한 파지, m를 증폭500 μL K91 박테리아 문화의 마지막 단계 (OD600 ~ 0.4-0.6, 배양 ~ 그것이 사용 4 시간 전에)에서 상층 액 또는 재 부유 구슬의 IX 200 μL. 37 부화 후 ° C 하룻밤 문화 테트라 사이클린 접시에 각각 15 분, 플레이트 50 μL합니다.
모든 파지 식민지를 복구하고 증폭하기 위해 처음 두 화면 사이클 동안 (그림 4A), 마지막 단계에서 모든 500 μl의 상층 액과 구슬을 수집 5 ML 박테리아 문화를 혼합하고, 9.5 인치 사각 접시에 플레이트를 . 이 단계는 박테리아가 다른 사람보다 느리게 성장하게하는 파지를 복구하는 것이 중요합니다. - 판에서 식민지 (맥과이어, 외., 26 참조) 패닝과 선택의 다음주기 전에 증폭 titered 있습니다.
- 채널의 긍정적 선택한 파지의 활동을 검사합니다.
선택의 10-12 사이클 후, 지질 bila에 KvAP 채널의 총 증폭 파지 테스트yers를 교황 / POPG의했다. 긍정적 인 클론의 상당 부분이있을 경우 우리가 휴식 상태에서 안정화 채널에 대한 선택했다대로, 100-500 nm에서 선택한 파지 (그림 4B) 이중층의 채널 상당 부분을 차단해야합니다. 긍정적 인 데이터는 휴식 상태에서 채널 강한 바인딩을 보여줍니다 복제가하는 것이 좋습니다. 선택의 16 사이클 후 단일 식민지 연속 50 긍정적 인 식민지을 선택합니다. 확인 지배 파지 클론 시퀀스를 비교에서 선택되고, 증폭 및 이중층의 채널에 대해 테스트됩니다. 긍정적 인 클론이 확인되면 강한 긍정적 인 클론에 의해 실시하는 펩티드를 합성하고 그들의 형태 고유의 활동을 확인하기 위해뿐만 아니라 채널을 테스트합니다.
- 펩타이드 표시 파지는 증폭하고 실험 때문에 단위 부피 당 파지의 수를 알 수 있습니다 그 전에 titered해야합니다. KvAP은 대조군으로,와 개에 POPE / POPG (3시 1분)와 0.50 % 비오틴 - DOPE의 소포로 재구성되었다 : 바이오틴-DOPE (199:1; 같은이 DOTAP 소포에 대해 수행되었다) 선택 대상으로 사용됩니다. 소포에 KvAP의 최종 농도는 0.50 ㎎ / ML이며, 지질 5.0 ㎎ / ㎖이다. 패닝 버퍼는 500 mM의 KCl을, 100 MM의 HEPES / KOH 산도 7.4, 0.10 밀리그램 / ML BSA가 포함되어 있습니다.
3.3. 구조 결정 27-29를위한 세포막 KvAP 채널의 결정화
- 의 형태를 안정채널, 채널, 33H1 Fv는 단백질의 형태 특정 바인더, KvAP / 수직 주파수 복합체를 형성하는 데 사용됩니다. 수직 주파수 단백질의 혼합물은 상자 2에 자세히 설명되어 있습니다. Superdex 200 열에서 복잡한 정화. 우리의 시스템 11.4 정도 ML의 복잡한 용리.
- 초기 화면이 완전히 DM 또는 β-OG에 용해되어 DMPC 또는 POPC과 단백질을 섞는다. 단백질 / 지질 / 세제 혼합물은 혼합 미셀 사이의 세 가지 구성 요소의 분포 열역학적 평형에 도달하기 위해 15 개 이상의 시간 동안 혼합한다. 보통 우리는 처음 세 개의 서로 다른 지질 / 단백질 비율 (LPR = 0.5, 1.5, 2.5)와 세 가지의 pH 수준 (6.0, 7.0 및 8.0) 테스트합니다. 투석 버퍼는 20 mM의 K-인산 버퍼, 100 MM의 KCl을, 및 3.0 mM의 NaN3가 포함되어 있습니다. 투석 버퍼는 2-3 일마다 변경됩니다. 크리스탈의 작은 나누어지는이 소포의 형성과 결정 격자의 가능한 외관을 검사 2-3 일마다 밖으로 가지고 있습니다.
타블로이드 목록LPR의 대 pH는 지질의 두 가지 다른 종류의 단백질의 동작을 결정하는 데 사용됩니다. 우리는 투석 샘플 음 얼룩 EM에 의해 검사되는 경우 (이상 150 nm의) 상대적으로 큰 크기의 소포 나 막 시트를 얻으려면. 세포막에있는 작은 일반 패턴은 타격을 제안하고 추가 최적화를 안내하는 데 사용됩니다.
음 얼룩 EM : 탄소 필름 (~ 3-5 nm의 두께)로 코팅 된 구리 그리드되어 글로우 방전 탄소 표면이 친수성 만들기 위해 공기를합니다. 결정 현탁액의 작은 양 (2-3 마이크로 리터)는 탄소 표면에로드하고, 0.5 ~ 1.0 분 동안 배양한다. 워트 먼지 # 3 필터 종이의 찢어진 가장자리 측면에서 그리드를 더 럽히십시오. 그리드를 뒤집어 150 마이크로 리터 염색 용액 (2.0 %의 하락의 상단에 ~ 15 초 동안 그것을 품어 PTA / KOH, 물, 산도 8.0 플러스 0.5 % 트레할로스, 또는 6.0 % 암모늄 몰 리브 데이트 / KOH, pH6.3-6.5 물에 플러스 0.5-1.0 %의 트레할로스). 최대한 t에서 솔루션을 얼룩그는 격자 표면 및 그리드 검사를 위해 TEM 삽입하기 전에 건조 할 수 있습니다. 소포의 이미지는 전자에 의해 모든 결정 패킹의 손상을 방지하기 위해 저용량 조건 하에서 수행된다. - 화면이 다음 올바른 LPR에 도달하기 위해 LPR의 작은 단계를 검토하는 확장됩니다. 단백질 결정화에 적합하면 세포막에있는 단백질의 작은 격자가 표시 될 수 있습니다. 이러한 초기 조건의 주위에 더욱 소금의 종류와 농도, 온도, 속도 및 세제 제거, 양이온, 단백질을 준비하는 데 사용되는 세제, 침전제, 지질 성분 등의 방법을 변화시켜 결정을 최적화
KvAPΔ36/Fv 복잡한 최적화 된 2D 결정은 20-30 미크론 (그림 5A)에 몇 미크론에서 큰 시트를 그 범위로 성장. 4 배 대칭 짱에서 예상대로 cryoEM 조건에서, 결정은 분명 4 배 대칭 투명 사각형 격자를 표시NELS (그림 5B와 C).
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Representative Results
생화학 적 동질성에 KvAP 채널을 정화 실험의 일반적 흐름은 그림 1A에 설명되어 있습니다. 단백질의 발현 및 정제하는 동안 일반 샘플은 그림 1B의 SDS-PAGE 젤에 보여진다. IMAC 정화 후, 단백질은 상대적으로 순수하다. KvAP 채널의 수율은 약 1.0 ㎎ / 리터 문화입니다.
세제 지질 소포의 가용화는 지질 대 세제의 각 쌍 위해 일해야합니다. DM으로 POPE / 교황의 작은 unilamellar 소포의 가용화는 그림 2a에 제시되어, 소포 부양의 결과는 일반적으로 매우 간단합니다. 그라디언트에서 분수의 SDS-PAGE 분석의 전형적인 결과는 그림 2B에서 보여준 있습니다. 자당 밀도 구배에 채널이 포함 POPE / POPG 소포는 보통 10 % 계층 사이의 인터페이스에 집중되어있다D 35 % 계층. KvAP 함유 DOTAP 또는 DOGS 소포가 가볍고 일반적으로 인터페이스 사이 5 % 및 10 % (약간 10 % 계층에 침투)입니다. multilamellar 소포의 상당 부분이있을 경우, 그들은 일반적으로 10-35% 인터페이스 아래 흰 집중한다. 우리는 이것이 일반적으로 단백질 세제 지질 혼합물이 충분히 지질의 좋은 분포를 도달하기 위하여 배양되지 않은 경우에 발생 것으로 나타났습니다.
평면 지질 이중층에 통합 KvAP 채널의 전기 기록은 그림 3에 나와 있습니다. 일반적으로 현재 추적은 -80 MV에서 채널 조용한 것을 보여줍니다. +80 MV로 전환하면 빠른 용량 피크 (전압 스위칭시의 날카로운 것)에 이르게한다. 현재의 느린 상승 단계는 채널이 활성화되고 외부 칼륨 전류를 수행 할 수 있다는 것을 시사한다. 상승 단계의 피크 후, 현재는 비활성화라는 단계를 감소하기 시작합니다. inactivati에 완료하는 데 몇 백 밀리 초 걸립니다. 전압이 -80 MV로 전환되면, 오픈 채널의 폐쇄를 반영하고 비활성화합니다 (그림 3C)이라고 아래 용량 피크 후 반환 단계가있다.
파지 화면의 중간에, 우리는 교황 / POPG의 이중층에 KvAP 채널의 증폭 된 파지의 활동을 테스트했습니다. 12 선택 사이클 후, 증폭 된 파지는 채널 활동 (그림 4B, 선별 된 파지)을 억제. 그러나 시작 파지 - 표시 라이브러리 채널 (그림 4B, 제어 파지)에 어떤 영향을 보여주지 않았다. 긍정적 인 파지 만 낮은 농도가 약했기 때문에 선택한 파지의 활동이 매우 높은하지 않았다하더라도, 분명, 재생 효과가 높은 결합력을 전시 활동, 긍정적 인 클론이 있다는 것을 제안, 선택적 중에 농축되어야한다 나머지 심사 CYCles의 한 번 풍성는 세포막 채널에 강한 억제 활동을 가질 가능성이있다.
2D 결정을 심사의 초기 단계에서, 우리는 많은 작은 소포 작은 격자를 보았다. 최적화, 일부 대형 시트는 주변에 작은 소포 (그림 5A)를 많이 나타났다. 이러한 결정의 cryoEM 이미지는 항상 더 최적화가 더 나은 결정을 얻기 위해 필요하다고 제안, 지역의 결함 (그림 5B)을 많이 보여 주었다. 결정이 잘 최적화 된되면, 그들은 날카로운 모서리를 전시하고, 하나의 시트로 나타났다. 높은 배율에서 각각의 유닛은 분명 더 나은 (그림 5C)로 정렬되었습니다.
| 시약 / 재료의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 트립 톤 | RPI 공사 | T60060 | |
| 효모 추출물 | RPI 공사 | Y20020 | |
| 염화나트륨 | 어부 | S271-3 | |
| 트리스 자료 | RPI 공사 | T60040 | |
| 칼륨 염화물 | 어부 | BP366-500 | |
| N-도데 실 β-D-Maltoside | Affymetrix의 | D322S | 졸 - 등급 |
| N-옥틸-β-D-글루코사이드 | Affymetrix의 | O311 | 아나 급 |
| 아프로 티닌 | RPI 공사 | A20550-0.05 | |
| 펩틴 | RPI 공사 | L22035-0.025 | |
| Pepstatin | RPI 공사 | P30100-0.025 | |
| PMSF | P7626 | ||
| DNase의 I | 로슈 | 13407000 | |
| 바이오 비드 SM-2 | 바이오 라드 | 152-3920 | |
| HEPES | RPI 공사 | H75030 | |
| POPE | 벤티 극지 지질 | 850757C | |
| POPG | 벤티 극지 지질 | 840457C | |
| DOGS | 벤티 극지 지질 | 870314C | |
| DMPC | 벤티 극지 지질 | 850345C | |
| 비오틴 - DOPE | 벤티 극지 지질 | 870282C | |
| DOTAP | 벤티 극지 지질 | 890890C | |
| NeutrAvidin 아가장미 구슬 | Piercenet | 29200 | |
| 투석 튜브 | 스펙트럼 연구소, Inc의 | 132-570 | |
| 펜탄 | 어부 | R399-1 | |
| 데칸 | TCI 미국 | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | 토론토 연구 화학 물질 | M266501 |
표 1. 시약 및 재료의 목록입니다.
|
표 2. 필요한 장비.
| 버퍼 이름 | 내용 |
| IMAC 용해 버퍼 | 50 MM 트리스 (산도 8.0), 100 mM의 KCl을 |
| IMAC 워시 버퍼 | 50 MM 트리스 (산도 8.0), 100 MM의 KCl을, 및 5.0 mM의 DM |
| IMAC 용출 버퍼 | 50 MM 트리스 (산도 8.0), 100 mM의 KCl을, 5.0 mM의 DM, 300 mM의 이미 다졸 |
| SDS-샘플 버퍼 (배) (nonreducing) | 60 MM 트리스 - 염산 (산도 6.8), 25 % 글리세롤, 2.0 % SDS, 0.10 % 브롬 페놀 블루. (1.0 % 2 - 머 캅토 에탄올이 감소 버퍼를 만들기 위해 추가). |
| SDS-PAGE (4X)를위한 젤 버퍼를 스택 | 0.50 M 트리스 - 염산 (산도 6.8), 0.40 % SDS |
| SDS-PAGE (4X)의 해결 젤 버퍼 | 1.5 M 트리스 - 염산 (산도 8.8), 0.40 % SDS |
| FPLC equilib정액 | 20 MM 트리스 산도 8.0, 100 MM의 KCl을, 및 5.0 mM의 DM |
| 리포좀 투석 | 10 MM HEPES, 100 mM의 KCl을 |
표 3. 버퍼 이름과 내용으로 구성되어 있습니다.
그림 1. 재구성을위한 KvAP의 준비. 단백질 발현, 정제 및 재구성의. 일반 작업 흐름. 단백질의 B. 생물 정화. E.의 유도 문화 대장균 XL1-블루 표현 KvAP이 처리 KvAP는 정제 하였다. 세포 배양의 스물 μL를하기 전에 (1 레인) 또는 후 (레인 2) 유도 세제 추출물 (레인 3), IMAC 크로마토 그래피의 흐름을 통해 (레인 4), 2 개의 세척 단계 (레인 5.6), 총 5.0 μg 후 단백질300 mM의 이미 다졸 용출 (레인 7) 및 크기 배제 FPLC의 KvAP 사량 중 (레인 8) 5.0 μg을 12 % SDS-PAGE와 쿠마시 블루 염색을 비 감소를 받게되었다.
그림 2. 교황 / POPG 소포에있는 KvAP의 재구성. 세제 농도의 함수로. 소포 융합 및 가용화. 410 nm에서 흡광도를 소포 (기준이없는 세제 부분을 뺀)의 빛 산란을 모니터링하는 데 사용되었다. 지질 (POPE / POPG 3:1) 10 ㎎ / ㎖이었다. 강력한 초음파 후 작은 unilamellar 소포는 단 분산, 직경 30 ~ 50 nm의 자신의 크기로 인해 약한 산란을 가지고있다. 세제가 도입되었을 때, 그들은 해결책 위상과 지질 막 상에 분산. 작은에 강한 곡률로 인해 unilamellar 소포, 도입 된 세제 트리거 소포 융합과 곡선의 릴리스 (따라서 낮은 표면 전위 에너지). 융합 소포 크기가 큰 410 nm에서 강한 산란을 보여줍니다. 피크의 상승 단계 (회색 색 영역) 따라서 세제에 의한 융합, 소포에 단백질 미셀 융합을위한 좋은 제도를 반영합니다. 오른쪽 흡수 피크 세제 (여기 예를 들어 DM)의 농도는 실제로 우리 재구성 프로세스에 선택되었다. B.는 재구성 KvAP의 소포의 쉰 마이크로 리터 (KvAP 0.5 MG / ML) 자당 밀도 구배에 의해 분리되었다. 자당 기울기의 위에서 아래로 (1 ~ 9) 100 μL 분수의 샘플은 SDS-PAGE를 줄여 12 %로 assayed되었다. 젤 쿠마시 블루 염색했다. 차선 3 ~ 2 μg의 KvAP가 포함되어 있습니다.
/ files/ftp_upload/50436/50436fig3.jpg "/>
그림 3. 재구성 이중층의 KvAP 채널의 전기적 활동. 셋업 패러데이 케이지 내부 1 A. 기록, 2 전극, 2, 트랜스 쪽, 3, 시스 측, 4;. 소금 다리 B.는 구멍 5를 보여 이중층 컵의 한쪽에 얇게 부분의 부분을 확대했습니다 , 세포막을 만들기를 위해 사용됩니다. 블랙 지질 막에 융합 된 KvAP 채널 C. 전기 활동을 기록 하였다. -80 MV에서 개최되는 동안, 막 잠재력이 150 밀리 초를 위해 80 MV에 펄스, 다음 채 잠재적으로 변경되었다. 이온 전류는 Axopatch 200B 앰프를 사용하여 전압 클램프 모드에서 기록되었다.
그림 4. conformati에 대한 심사파지 - 표시 라이브러리에 특정 리간드. 이온 채널에 대한 심사 뒤. 계획은 수포로 재구성. 소포는 비오틴 - DOPE으로 도핑되고, 그들은 NeutrAvidin 구슬로 솔루션을 떠나게 될 수 있습니다. KvAP 채널의 형태는 특정 지질에 의해 제어됩니다. 파지가 대상 구조적 상태에서 채널 (여기 예를 들어 DOTAP 또는 강아지)와 함께 배양되기 전에 구슬, 빈 소포 및 다른 형태의 채널 소포에 대한 부정적인 선택이 완료됩니다. 선택한 파지는 이중층의 채널에 대한 증폭 및 테스트 할 수 있습니다. 화면의 중간에서 선택한 파지의 B. 시험은. 시작 파지 라이브러리 (총 :., 노란색 추적 - 후 - 2 분, 빨간색 추적을 추가 한 후 10 분 최고를 추가하기 전에 - 블랙 추적 : 선택한 파지를 추가 한 후 서로 다른 시간 지점에서 이중층의 KvAP의 전기 활동 ~ 10 10 파지 추가이중층까지)은 이중층의 채널에서 테스트되었습니다, 각 파지 클론은 약 100 사본 바닥이 기 때문에 탐지 활동이없는 것을 발견했다 : 12. 선택 사이클 후, 파지는 여전히 다른 클론의 혼합물이었다. 채널 활동의 명확한 억제 이중층 리드의 채널에 10 10에 대한 파지를 추가 친화력이 있어야 긍정적 인 클론이 있다는 것을 시사하는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 세포막 KvAP의 2 차원 결정. 크리스탈 최적화의 중간에 부정적인 스테인드 단일 레이어 2D 결정의 A. 이미지. 결정은 6.0 % 암모늄으로 염색 하였다몰리브덴, 산도 6.4 플러스 0.50 %의 트레할로스. 설탕 때문에, 그들은 종종 서로 쌓여. 검은 색 사각형 상자 ~ 20 Â가는 회절 반점의 오른쪽에 표시된 회절 패턴에 상승을 제공 영역을 지정합니다. (A)에 사용되는 것과 유사한 샘플에서 2D 크리스탈 B. CryoEM 이미지. 시편은 3 % 트레할로스와 혼합 직접 폭락으로 동결하고, cryoEM에서 몇 군데 있었다. 이미지는 50,000 X에서 얻은 것입니다. 그것은 크리스탈 패킹에있는 지역의 결함이 있었다는 것을 명확했다. 더 최적화 된 결정의 C. CryoEM 이미지. 시편은 0.75 % 탄닌과 10 % 트레할로스에 포함되었고 이미지가 50,000 X.에서 직선과 단단한 포장 채널이 아니라 결정의이 유형에 주문한 것을 제안 촬영되었다. 두 개의 검은 화살표는 사각형 격자를 표시합니다.
상자 :
상자 1. IMAC 열 준비
- 철저하게 IMAC 수지 resuspend을.
- 바로 50 ML 튜브로 현탁액 수지의 필요한 양을 전송합니다. 우리는 2 L의 문화 KvAP의 정화를위한 수지 2 ㎖ 침대 볼륨을 사용합니다.
- 수지 아래 펠렛 2 분 700 XG에서 튜브를 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고 폐기합니다.
- MQH 2 O의 10 침대 볼륨을 추가하고 수지를 씻어 살짝 섞는다.
- 수지 다운 펠렛 2 분 700 XG에 Recentrifuge. 상층 액을 버린다.
- MQH 2 O의 10 침대 볼륨을 추가하고 빈 컬럼에 붓는다.
- 수지가 정착 될 때까지 기다린 저압 액체 크로마토 그래피 흐름 어댑터의 열을 닫습니다.
- 열을 MQH 2 O와 평형 버퍼의 5 침대의 볼륨 5 침대 볼륨을 실행합니다.
상자 2. 수직 주파수 정화
FV 변환 - 1 일
- 변환100 ㎍ / ㎖ 암피실린, 그리고 37 ° C 배양기에서 하룻밤 배양을 포함하는 4 개의 LB-한천 플레이트에 수직 주파수 - 그의 JM83 유능한 세포의 6-60 μL, 접시 박테리아를 포함하는 플라스미드 100 NG.
- 세균 배양 용 6 X 1 L의 LB를 준비합니다.
수직 주파수의 표현 - 2 일
- LB 배지에 접시에서 모든 식민지를 스크랩. 암피실린 (100 ㎎ / L)의 존재 6 X 1 L의 LB에 세균이 현탁액을 추가하고 OD600이 0.5에 도달 할 때까지 배양한다.
- OD가 0.5에 도달 할 때, 115-20 ° C 및 RPM 온도를 낮 춥니 다. 때 ~ 20의 온도 강하 ° C, 20 단백질 발현과 부화 다른 5 시간의 유도를 시작하기위한 추가 anhydrotetracycline (DMF에 1mg/ml의 100 μL 1 L까지) ° C 정상적인 떨고.
- 수확 15 분 4,000 XG에서 1 L 원심 분리기 병 박테리아. 가능한 한 상층 액을 붓는다. 얼음에 수확 박테리아를 유지밤새 4 ° C 냉장실.
3 일 - 박테리아 Fv는 분자를 방출
- 수직 주파수 방출 버퍼의 150 ML (50 MM 트리스 산도 8.0, 20 % 자당, 1.0 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에서 박테리아를 resuspend을.
- 자석 교반 막대로 교반하면서 0.1 MG / ML에 라이소자임을 추가하고 30 분 동안 얼음에 박테리아를 유지합니다. 그 후, 2.0 mm의 MgCl 2를 추가하고 또 다른 15 분 동안 얼음에 보관하십시오.
- 4에서 30 분 동안 20,000 XG에서 처리 된 세균을 원심 분리기 ° C. 세균 spheroblasts 모든 펠렛에 가서해야하고, Fv는 분자의 대부분은 상층에 해제됩니다.
- 최소 4 시간 동안 차가운 방에서 세척 버퍼 4.0 L (20 MM 트리스 산도 8.0, 100 MM의 염화나트륨)에 대한 상층 액을 Dialyze. 하루의 끝에서, 신선한 투석 버퍼로 변경하고 하룻밤 dialyze. 솔루션의 자당 때문에, 투석액의 양이 50 % 증가합니다. 투석 튜브의 초과를 사용해야합니다.
IMAC 정화 및 FPLC - 4 일
- 50 ML 튜브에 투석 버퍼 IMAC 정화 수지 (박스 1 참조) 10 ㎖ 침대 볼륨을 평형.
- 10 mm까지 MgCl 2를 추가하고 200 ML에 볼륨을 증가, 튜브에서 투석을 전송합니다. 4 ℃에서 30 분 동안 전 평형 수지와 부화와 혼합
- 배양 수지 빈 열을 포장하고, 10 MM 이미 다졸, 30 mM의 이미 다졸 각각 버퍼를 세척 5 침대 볼륨에 따라 세척 버퍼의 5 침대 볼륨과 수지를 씻는다.
- 세척 버퍼의 20 ML 플러스 이미 다졸 300 mm 인 바운드 단백질을 용출.
- 버퍼를 세척과 사전 평형 Superdex 200 컬럼을 통해 집중 수직 주파수를 실행합니다. 수영장 함께 수직 주파수를 (일반적인 피크가 17.6 ML 보존 볼륨 보여줍니다)을 포함하는 분수와 그것을 집중한다. 280 nm에서 수직 주파수의 흡광 계수를 사용하여 샘플의 농도를 결정합니다.
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Discussion
다른 막에 KvAP 채널의 재구성은 여러 연구 8-10에서 사용되었다. 세제 / 지질 혼합 미셀과 단백질 / 세제 / 지질 혼합 미셀 간 지질의 분포를 보장의 아이디어에 따라, 우리는 매우 다른 지질 만들어진 세포막에 KvAP의 거의 완전한 재구성에 도달 할 수 있습니다. 각각의 합체 KvAP 채널은 완벽하게 그 횡단 영역을 커버 ~ 100 지질 분자가 필요합니다. 필수 요구 사항은 세제가 제거되기 전에 충분한 지질 분자가 단백질 / 지질 / 세제 미셀에 융합 할 수 있도록하는 것입니다. 우리의 표준 조건 (0.5 MG 단백질과 5.0 ㎎ 지질)는 평균이 있다는 것을 ~ 단백질 분자 1,000 지질 분자를 확인합니다. 우리의 부양 실험, 생화학 실험은 재구성이 거의 완료되었음을 확인 하였다. 블랙 지질 세포막에 삽입 채널에서 전기 녹음 재구성 채널의 심사대항 할 파지 - 표시 펩타이드 라이브러리 및 세포막 채널의 2D 결정의 성장은 모든 용도에 막 재구성의 성공적인 응용 프로그램을 보여줍니다.
파지 - 표시 펩타이드 라이브러리에 대한 KvAP 채널과 검진의 지질에 따라 구조적 변화가 아닌 특정 conformations에 8 채널을 유지하기 위해 전기 생리학에 의존 생화학 적 방법으로 채널 차단제 또는 채널 오프너 화면에 새로운 길을 소개. 형태 고유의 바인더에 대한 우리의 화면에서의 성공은 동일한 전략을 활성화 형태에 대한 특정 바인더를 찾아 적용 할 수 있습니다하는 것이 좋습니다. 그것은 소포의 재구성 채널을 하나의 체인 수직 주파수 라이브러리, 팹 라이브러리 등 마찬가지로 대해 사용할 수 있다는 예상이다, 다른 막 단백질은 이러한 작업을 실행하고 다양한 목적을 위해 유용 할 수 있습니다 그들의 꽉 바인더를 보호 할 수 있습니다. 우리가 믿는이 북동W의 방법은 미래의보다 일반적인 응용 프로그램을 볼 수 있습니다.
재구성 멤브레인 시스템은 막 단백질 11 지질 효과 뒤에 화학 세부 사항의 해명을 허용합니다. 지질 - 단백질 상호 작용은 많은 막 단백질에 중요한 것으로 알려져 있으며, 최근 3에서 여러 연구의 대상이되었다. 세포 기반 연구에서 조작이 세포막에 특정 구성 요소를 변경하기 위해 구현 될 수 있으며, 그 막 단백질의 기능 변화는 세포막의 구조와 성분 변화와 관련이있다. 이러한 연결은 간접 잘 특성화되지 않은 세포의 세포막에 여러 요인이 발생할 수 있습니다. 재구성 균일 한 막에서는 막 단백질의 구조 및 기능 변화와 지질 조성과 막 특성의 변화 사이의 연결을 더 결정적인이다. 궁극적으로, t를 이해하기그는 지질 단백질 상호 작용의 뒤에 화학의 원리, 우리는 막 횡단 영역 주위 지질의 분포를 묘사하고, 단백질의 바로 옆에 이러한 지질의 동적 인 변화를 이해할 필요가있다. 재구성 시스템은 이해 향해 신뢰할 수있는 방법이 나타납니다.
막 단백질의 재구성은 단백질 / 지질 / 세제 혼합 미셀에서 세제의 제어 제거, 결국 소포 (30)에 회전 큰 것들로 혼합 미셀의 융합이 필요합니다. 세 가지 다른 방법으로는 제거 세제, 투석, 구슬 및 사이클로 덱스트린 14, 31, 32에 사용되고있다. 그러나 작은 양 33, 34에서 세제의 잘 통제 된 점진적 제거를 달성하기 어려운 남아있다. 세제 제거를위한 이상적인 방법은 제어 속도에서 전체 볼륨에 걸쳐 균일 액상의 밖으로 세제를 취할 것이며, 강력한 간섭 (을)를 발휘하지 않아야이중층의 세포막의 재구성을 n을. 이러한 방법은 재구성의 속도와 효율성을 변경할 수 있습니다, 그리고 가능성이 작은 볼륨 재구성을 가능하게 할 것이다. 천천히 희석 세제 제거를위한 세 가지 일반적인 방법 중 하나의 조합이 목표에 접근 할 수 있습니다. 단백질 / 세제 / 지질 혼합물에 물을 소량 도입하여 천천히 희석 고르게 CMC에 세제 농도를 감소하는 제어 방법이다. 세제 제거 후 많은 사람들에 작은 소포의 융합을 위해 여전히 중요하지만, 소포 형성에 덜 중요합니다. 제어 세제 제거를 달성하는 다른 방법은 아직 생각하고 개발해야합니다.
우리 재구성 절차는 혼합 미셀과 소포뿐만 아니라 혼합 미셀의 세제에 의한 융합 사이에 지질 분포를 고려합니다. 그것의 성공은 연구의 응용 프로그램의 광범위한 스펙트럼에 이르는 길을 불법 체류자우리가 제시 한 세 방향보다 더 econstituted 소포. 다른 막 단백질에 대한 우리의 절차의 적응은 중요한 기술적 인 한계가 발생하지 않아야합니다. 많은 막 단백질이 방법은 하나 또는 다른 재구성되었다하더라도, 그것은 완전한 재구성 근처에 달성하기 위해 여러 다른 관점에서 단백질의 기능을 평가하기 어렵게되었습니다. KvAP 재구성 우리의 노력은 우리의 방법은 전체 재구성을 허용 할 수 있으며 이러한 목적에 적합 할 것이 좋습니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
장 실험실에서 KvAP에 대한 연구는 록펠러 대학에서 박사 로데릭 맥키의 연구실에서 상당한 도움을 얻을 수있다. 특별 감사는 조언 박사 Kathlynn 브라운과 마이클 McQuire에 가서 우리의 파지 화면 실험에 도움이됩니다. 이 작품은 NIH (Q-XJ에 GM088745와 GM093271) 및 AHA (Q-XJ에 12IRG9400019)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
References
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