Summary
We beschrijven de procedure en de data-analyse van een chemische screening systeem voor glucocorticoïde stresshormoon signaleren met behulp van zebravis larven: de Glucocorticoid Responsive In vivo zebravis luciferaseactiviteit (Grizly) test. De test gevoelig en specifiek detecteert effecten op glucocorticoïd signalering door verbindingen die metabolization nodig hebben of van invloed endogene glucocorticoïden productie.
Abstract
Glucocorticoïd stresshormonen en hun kunstmatige derivaten worden op grote schaal gebruikt medicijnen om de ontsteking te behandelen, maar een langdurige behandeling met glucocorticoïden kan leiden tot ernstige bijwerkingen. Testsystemen nodig om te zoeken naar nieuwe verbindingen beïnvloeden glucocorticoïde signalering in vivo of ongewenste effecten van verbindingen op de glucocorticoïde signaleringsroute bepalen. We hebben een transgene zebravis test die de meting van glucocorticoïde signalerende activiteit kan in vivo en in real-time gevestigd, Grizly assay (glucocorticoïde reagerende In vivo zebravis luciferaseactiviteit). De luciferase-gebaseerde test detecteert effecten op glucocorticoïd signalering met een hoge gevoeligheid en specificiteit, met inbegrip van effecten door verbindingen die metabolization nodig hebben of van invloed endogene glucocorticoïden productie. We presenteren hier een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van chemische schermen met deze assay. We beschrijven data-acquisitie, normalisatie enanalyse, het plaatsen van een focus op kwaliteit en data visualisatie. De assay is een eenvoudige, tijdsopgeloste en kwantitatieve uitlezing. Het kan worden gebruikt als een stand-alone platform, maar is ook eenvoudig te integreren in high-throughput screening workflows. Het staat bovendien voor vele toepassingen buiten chemische screening, zoals milieu-monitoring van endocriene verstoorders of stressonderzoek.
Introduction
Glucocorticoïden (GC) zijn steroïde hormonen die door de bijnier, die een belangrijke rol spelen tijdens de reactie op stress en in de regulatie van het metabolisme 1. GC binden cytoplasmatische glucocorticoïdereceptoren (GRS) van de nucleaire receptor superfamilie die, na binding, translocatie in de kern 2. Hier kunnen ze bijvoorbeeld de transcriptie door te interfereren met andere transcriptiefactoren (transrepressie) of activeer gentranscriptie via glucocorticoid respons elementen (GREs, transactivering). Door hun anti-inflammatoire eigenschappen worden zowel natuurlijke als kunstmatige GC gebruikte geneesmiddelen bij de behandeling van een aantal ziekten, zoals astma en artritis 3. Toch kan vooral gebruik van GC's op lange termijn leiden tot ernstige bijwerkingen, waaronder diabetes en glaucoom 4. Daarom worden nieuwe verbindingen richten GC signalering met mogelijk gunstiger behandeling efficiëntie en verdraagbaarheid zeer gewilde achterschipER. Belangrijk is dat ligand waargenomen in gekweekte cellen verschillen van die gezien in vivo 5. Dergelijke effecten kunnen vooringenomenheid resultaten verkregen met conventionele celcultuur gebaseerde farmaceutische screeningstesten. Chemische stof in vivo screening als ingeschakeld door de zebravis model is onlangs op de voorgrond geplaatst, omdat hiermee de bepaling van effecten niet aantoonbaar in celcultuur 6,7.
Hormonale signaalwegen kan ook worden beïnvloed door milieuverontreinigende stoffen. Zogenaamde hormoonontregelaars (EDC's) invloed hebben op verschillende gereguleerde processen 8. Zo kunnen de voortplanting en seksuele differentiatie van waterorganismen worden gemoduleerd door stoffen met oestrogeen-achtige activiteiten. Recent zijn bezorgdheid geuit dat metabole stoornissen kan worden gekoppeld aan EDC's in het milieu 9. Een route door dergelijke "metabole verstoring" is de glucocorticoïd weg, dat ook is betrokken bij xenobiotica effecten op de ontwikkeling en het immuunsysteem 10,11. Echter, in vergelijking met de grote hoeveelheid informatie beschikbaar over verbindingen bemoeien met seks steroïde hormoon actie, relatief weinig bekend over endocriene verstoring effecten gemedieerd via de GR. Daarom zijn hulpmiddelen nodig die het mogelijk maken het toezicht op de effecten van pollutie op GC signalering in vivo.
De zebravis is al lang een populair model in de ontwikkelingsbiologie en heeft sinds kort ook aangetrokken onderzoekers uit andere gebieden, waaronder endocrinologie 12. Vergeleken met andere teleosten, GC signaalsysteem van zebravis is vergelijkbaar met die van zoogdieren, aangezien de zebravis genoom bevat slechts een GR gen in plaats van de gedupliceerde receptoren in vele andere vissoorten 13-15. Bovendien, de hypothalamus-hypofyse-bijnieras is ook functioneel in 5 dagen oude zebravis larven, die endogene GC productie in respons op stressoren verhogen 14,16-18.
Luc, waardoor voor de controle van GC signalerende activiteit in vivo en in real-time 18: We hebben onlangs een transgene zebravis lijn, GRE gegenereerd. De lijn draagt een luciferase reportergen construct onder controle van een minimale promoter TATA box en vier concatemerized GREs (figuur 1a). GC geïnduceerde bioluminescentie kan worden gemeten van enkele GRE: Luc larven in 96 microtiterplaten in vivo gedurende langere perioden. Deze Grizly assay (voor "Glucocorticoid Responsive In vivo zebravis Luciferaseactiviteit") kan worden gebruikt in een aantal verschillende onderzoeksgebieden, zoals stress onderzoek, toezicht op het milieu, en farmacologische schermen 18. We konden de endogene stijging cortisol detecteren na osmotische stress uit een larven, kan de rijping van de reactie te volgen tijdens de ontwikkeling. Verder konden we de effecten op GC signalering van organische bewakens dat metabolisering door de larve vereist. Belangrijk is dat de lijn was in staat om deze effecten in het milieu relevante concentraties. Tot slot, in een pilot scherm de test gevoelig en specifiek gedetecteerd verbindingen met GC-activiteit van een chemische bibliotheek, waaronder een verbinding die endogene cortisol productie gestimuleerd in de larven. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de chemische schermen met behulp van de Grizly assay.
Protocol
1. Bereid werkverdunning van Chemical Bibliotheek
Verdun de verbindingen met de geneesmiddelenbibliotheek te testen (bijv. FDA goedgekeurde geneesmiddelen, ENZO Life Science) in E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2) met een robot vloeistofverwerking station (bijv. Multiprobe II, 8 naalden met verwijdering tip adapter, PerkinElmer). Geschikte concentraties zoals 40 pg / ml in 3% DMSO, maar dit zal afhangen van het type bibliotheek. De Multiprobe II instellingen die corresponderen met de hieronder beschreven stappen zijn weergegeven in tabel 1. De in de tabel beschreven protocol maakt de bereiding van vier hoeveelheid platen in parallel.
- Pipet 10 ul fracties van de voorraad bibliotheek (2 mg / ml in DMSO) in diepe putjes (bv. 96-wells platen, Ronde Nou, 0,8 ml, ABgene). Kolommen 1 en 12 moeten leeg worden gelaten - deze zullen de positieve en negatieve binnen-plaat controles ontvangen.
- Voeg 10 ul DMSO in kolom 1 en 10 pi van een 5 mM dexamethason oplossing (in DMSO) kolom 12 en binnen-plaat controles. De concentratie van DMSO in alle wells nu 3%, de dexamethason in de positieve controleputjes 100 uM in E3 / 3% DMSO.
- Dicht de plaat met DMSO resistente lijm afdichting vellen. Bewaar de platen bij -80 ° C tot gebruik.
2. Fokken van Reporter Fish
Verzamel embryo's uit natuurlijke paai van groep paringen tussen GRE: Luc transgene vis. Raise embryo's (niet meer dan 60) bij 9 cm platen met E3 medium aangevuld met 1 mg / ml van het fungicide methyleenblauw tot 4 dagen na de bevruchting (DPF) in een incubator bij 28 ° C. Veranderen regelmatig E3 medium.
titel "> 3. Voorbereiding van Luciferase Medium (E3L)Bereid een waterige luciferin voorraad oplossing van 50 mM door het toevoegen van dH 2 O aan de flacon met de luciferin poeder. Deze voorraadoplossing kan worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende enkele maanden. Verdun de luciferine bouillon in E3 medium tot een eindconcentratie van 0,5 mM tot E3L medium te verkrijgen.
4. Verdeel Larven in 96 well platen
- Bereid 1 ml pipet tips met wijde boring door het afsnijden van ongeveer 5 mm van de tip en kort vlammend de scherpe randen.
- Pool larven uit verschillende kruisingen door ze voorzichtig met bakken uit de petrischalen in een bekerglas. Oogst ongeveer 50 larven voor een door deze voorzichtig gieten op een zeef (poriëngrootte van 0,25 mm diameter) en onmiddellijk het zeef in een kleine petrischaal (diameter 5,5 cm) gevuld met E3L medium.
- Met een breed boring pipet tip, overdracht 225 ul van medium dat een larve elk aan de putjes van een witte96 well plaat (OptiPlate, PerkinElmer).
- Sluit de platen met lijm afdichtende vel (bijv. Topseal-A, PerkinElmer) en incubeer ze op 28 ° C overnacht. Deze voorincubatie voorkomt dat kortstondige voorbijgaande veranderingen in bioluminescentie onmiddellijk na toevoeging van luciferine, een verschijnsel dat ook voorkomt in gekweekte cellen 19.
5. Drug Treatment
- Verwijder de plaat met de werkverdunning van de bibliotheek van de -80 ° C vriezer ongeveer 4 uur voor gebruik. Vortex voorzichtig de plaat en kort draaien in een centrifuge om de vloeistof te verzamelen op de bodem van de plaat.
- Verwijder lijm afdichting vellen uit de larven platen.
- Met een hand te bedienen 96-kanaals pipetteren apparaat (bijv. Liquidator, Steinbrenner) pipet de drug oplossing op en neer 3 keer. Dan 25 pi aliquot van de werkverdunning van de chemische bibliotheek in de putjes die de larven (met bovenstaande voorbeeldresulteert in een uiteindelijke concentratie van 4 ug / ml in E3 met 0,3% DMSO). Bereid 10 (minimum: 5) replica platen met larven per bibliotheek plaat.
- Dicht de platen met de lijm afdichting lakens en benoem elke plaat met een barcode sticker.
6. Luminescentie Recording
- Leg de platen die de larven in het stapelen van eenheden van een EnVision bioluminescentie reader met verbeterde luminescentie gevoeligheid (PerkinElmer). Alternatief gebruik gerobotiseerde incubator systeem zoals toegepast voor zoogdierlijke celkweek screening systemen in combinatie met de lezer.
- Record bioluminescentie twee dagen met Reader instellingen gelijk aan die in tabel 2 beschreven voor de EnVision lezer. Pas het aantal test herhalingen om het aantal platen in de aanloop naar overeenkomen met de gewenste looptijd.
- Na het einde van de run, controleer dan de platen op de aanwezigheid van dode larven met de algemene toxiciteit van de comp evaluerenounds.
7. Data Analysis
Alle data-analyse wordt uitgevoerd in de statistische programmeeromgeving R met behulp van aangepaste scripts.
- AUC berekening
Om verbindingen activerende GC signalering ongeacht hun kinetische eigenschappen te identificeren, het gebied onder de curve (AUC) van de opgenomen luminescentie sporen (bioluminescentie ruwe tellingen versus tijd) als parameter screening. AUC's zijn benaderd met de trapeziumvormige regel (zie figuren 2a en a '). - Normalisatie
Log transformatie AUC waarden om een hogere normaliteit van de gegevens (figuren 2b en b) zorgen. Normaliseren dan de log-getransformeerde AUC-waarden voor elke bibliotheek plaat met de robuuste Z-score-methode (zie 20). Deze normalisering resulteert in waarden die het aantal standaarddeviaties van het gemiddelde van alle datapunten. Zosystematische fouten, zoals inter-run variabiliteit, worden verwijderd uit de data. De gegevens kunnen nu worden gevisualiseerd door het uitzetten van de gemiddelde robuuste Z-score van de replica's voor elk putje (figuren 2c en c '). - Kwaliteit metrics
- Heatmap
Om de plaat gerelateerde effecten te visualiseren, plot de gegevens voor elke plaat als een heatmap gebruik bijvoorbeeld de heatmap.2 functie van de gplot pakket 21. Zo kan randeffecten of samengestelde overdracht gemakkelijk worden gedetecteerd (bv. vergelijk figuur 3a met 3b). Uitsluiten suboptimale borden van verdere analyse. - ROC curve
Om de gevoeligheid en specificiteit van de test te bepalen, berekenen een receiver operating characteristic (ROC) curve bijv. met behulp van de ROC Bioconductor pakket 22 met behulp van de Z-score-waarden bepaald in 7.2 (figuur 3c). Vervolgens bepalen de AUC van deze curve. Een AUC waarde dichtbij 1 geeft hoge gevoeligheid en specificiteit van de assay.
- Heatmap
- Hit Identificatie
Om de cut-off waarde te optimaliseren voor de identificatie van actieve verbindingen, bepalen de Youden Index. Om de index te berekenen, trekt u de geschatte ware positieve tarief (TPR) van de valse positieven (FPR) van de ROC-curve voor het verhogen van robuuste Z-score cut-off-waarden. Neem de robuuste Z-score met de hoogste Youden Index (TPR minus FPR) als de cut-off point. De TPR / FPR kan worden geschat door detectie van positieve controles en van bekende werkzame verbindingen in de bibliotheek. Bij het gebruik van positieve controles voor zorgen dat ze overeenkomen met de verwachte hit sterkte.
8. Hertesten
- Opnieuw beoordelen positieve treffer verbindingen door behandeling larven met seriële verdunningen van de verbindingen verkregen bij een andere leverancier, met dezelfde opname opstelling hierboven beschreven. True resultaat mag luminescentie een inducerenlso in deze assay, bij voorkeur in een dosis afhankelijke wijze.
Representative Results
In een eerdere publicatie 18, gescreend we een bibliotheek van 640 FDA goedgekeurde geneesmiddelen in een pilot scherm om de prestaties van de Grizly test geëvalueerd. Deze bibliotheek bevatte 12 bonafide GC, waardoor wij de kwaliteit ervan vast inzake gevoeligheid en specificiteit van de test.
Figuur 2 toont typische voorbeelden van de ruwe data-analyse en normalisatie uit dit scherm. Een typisch resultaat van een dexamethason controle goed is weergegeven in figuur 2a, ter illustratie van de temporele informatie van de gegevens. Een piek in bioluminescentie die optreedt bij ongeveer 12 uur na de behandeling langzaam af gedurende de volgende 36 uur van de meting. Figuur 2a 'benadrukt de onderlinge aanpassing van de AUC-waarde met de trapeziumvormige methode. Deze berekening wordt uitgevoerd voor alle bronnen en elke technische herhaling uitgevoerd. Het resultaat van de log transformatie is weergegeven in figuren 2b </ Strong> en b '. Hier het gemiddelde van de positieve controles worden weergegeven in een normale QQ plot. Log transformatie leidt tot een grotere aanpassing van de gegevenspunten met de theoretische normaal verdeelde waarden aangegeven door de rode diagonalen. Een transformatie naar normaliteit van de gegevens te verkrijgen verhoogt de statistische power van de latere analyses. Tenslotte figuren 2c en 2c 'tonen het effect van robuuste Z-score normalisatie op plaat-to-plate variabiliteit: De verschillende uitgangswaarden verkregen met verschillende platen (figuur 2c) zijn genormaliseerd in de robuuste Z-score plot in figuur 2c'.
De robuuste Z-score waarden kunnen worden gebruikt voor systematische fouten in de data te identificeren door het visualiseren van de verdeling van de treffers in de platen. Figuur 3a toont een voorbeeld van een heatmap van een bibliotheek plaat, waarbij de stabielere Z-score valwaarden zijn uitgezet kleurcodering in de put posities. Men gemakkelijk identificeert kolom 12 met de in-plaat positieve controles. Positief scorende bibliotheek verbindingen worden gezien in goed F8 en, zij het zwakker, E2. Figuur 3b toont een plaat waarin een systematische fout aanwezig is. Men observeert een reeks verbindingen met afnemende Z-score waarden in rijen A en E over meerdere kolommen. Geen van de verbindingen in deze putjes positief getest in de hertest. Omdat de putten met deze afnemende Grizly testactiviteit langs het pad de pipettering robot neemt wanneer aliquoting de bibliotheek platen worden geplaatst, dit patroon is een indicatie van versleping van een positieve verbinding tijdens het geautomatiseerde pipetteren proces.
De robuuste Z-score normalisatie samen met de aanwezigheid van bekende GC in de bibliotheek ook ons in staat om een receiver operating characteristic (ROC) curve voor het scherm 18 te berekenen. Figuur 3c een plot van de schatting blijktgedekt echt positief ten opzichte van de geschatte valse meldingen voor verschillende robuuste Z-score cut-off-waarden. De geschatte ware positief wordt gedefinieerd als het percentage terecht positieve resultaten (hier, de bekende glucocorticoïden aanwezig in de bibliotheek) die zijn gevonden op een gegeven robuuste Z-score cut-off waarde. Het daarmee overeenkomende geschatte valse meldingen geeft het percentage van niet-positieve verbindingen hit op deze cut-off waarde. De AUC van deze curve is 0,95, wat wijst op een hoge gevoeligheid en specificiteit van het scherm en de uitstekende test prestaties. De AUC-curve werd ook gebruikt om de optimale grenswaarde voor hit identificatie te schatten door het berekenen van de Youden index voor verschillende robuuste Z-scores. We identificeerden de robuuste Z-score van 1.49 als het hebben van de hoogste Youden index. Deze cut-off waarde wordt aangegeven in figuur 2c 'als een zwarte lijn tussen de hits van het grootste deel van de verbindingen.
In ons scherm18, waren we in staat om bijna alle bekende GC aanwezig in de bibliotheek te identificeren. Slechts drie van de 12 bonafide GC werden niet gedetecteerd. Bij melengestrolacetaat, was dit een vals negatief bevinding, omdat deze verbinding testte positief in de hertest bij een hogere concentratie dan die in de bibliotheek. De andere twee GC negatief waren ook in de re-test. Corticosteron is de belangrijkste GC in knaagdieren maar niet in vissen of mensen 1, terwijl de prodrug prednison niet goed kan worden gemetaboliseerd door het larvale systeem. Interessant ook twee drugs geannoteerd als GC werden in het scherm, waarvan een niet in de hertest (spironolacton, een mineralocorticoïde receptor antagonist) kan worden bevestigd. De andere verbinding, pregnenolon, is een precursor van biosynthese, dat wordt omgezet in cortisol door de bijnieren. Inderdaad, de behandeling met pregnenolon gestimuleerd cortisol productie in de larven 18. Al deze resultaten bevestigen de hoge performance van de test: slechts een vals-negatieve en een vals positief verbinding behoorden tot de resultaten primaire scherm, en 10 van de 11 bevestigde verbindingen met GC signalering stimulerende activiteit werden reeds in het primaire scherm.
Figuur 1. Algemeen principe van de test en de workflow van de screening procedure. A) Regeling van de Grizly assay reporterconstruct. Luciferase (geel) expressie wordt aangestuurd door een minimale promoter (P min, oranje) en vier concatemerized GRE elementen ((GRE) 4, wit), die gebonden zijn door ligand geactiveerde GR homodimeren (GR, blauw). Rode vakjes geven Tol2 transposase plaatsen dat integratie van het construct in het genoom te vergemakkelijken. De roze doos is een poly-adenylatie website (Pa). Transgene larven voortzetting van deze construct worden in ondoorzichtige 96 microtiterplaten geplaatst voor bioluminescentie metingen. b) Regeling van de luciferasereactie. Luciferase katalyseert de oxidatie van luciferine tot oxyluciferine, wat leidt tot lichtemissie (hv). De reactie vereist ook ATP en Mg2 +, welke door de larve. PP i, pyrofosfaat. C) Workflow van het scherm. Werkvoorraad verdunningen bereid uit een FDA goedgekeurde geneesmiddelenbibliotheek in 96 putjes, een kolom die een negatieve in-plate controle (alleen DMSO, groen) en een kolom die een positieve controle (dexamethason, rood) (bibliotheekontwerp). GRE: Luc larven worden verdeeld in 96 putjes platen (5-11 replicaten) en behandeld met de bibliotheekverbindingen (geneesmiddeltoediening). Bioluminescentie sporen worden opgenomen met een bioluminescentie lezer voor twee dagen (het verzamelen van gegevens). Bioluminescentie sporen zijn geïntegreerd (AUC berekeningen), log getransformeerd en robuuste Z-score genormaliseerd (normalisatie). Genormaliseerde gegevens worden gebruikt voor het bepalen van de kwaliteit en metrics voor hit identificatie (data-analyse). Gekozen hits opnieuw getest voor dosis-afhankelijke activiteit in de assay (hertest). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Data-analyse geïllustreerd met gegevens uit een scherm van een FDA goedgekeurde geneesmiddel bibliotheek. a) Vertegenwoordiger spoor van een positieve controle goed. a) Het oppervlak onder de curve (AUC) wordt benaderd met de trapezium regel. De trapeziums gebruikt voor de berekening zijn weergegeven in verschillende tinten rood. B) normale QQ plot van rauwe AUC-waarden van voor de positieve controles (y-as) versus een standaard normale populatie (x-as) voor logtransformatie. B ' ) Normale QQ plot van de AUC-waarden na log transformatie. Een normale verdeling wordt aangegeven door de lineariteit van de log-getransformeerde gegevenspunten. C) plot van log-getransformeerde ruwe gegevens voor alle geteste verbindingen op het scherm. Blauw, bonafide glucocorticoïden;. Grijs, alle andere verbindingen c ') Plot van het scherm gegevens na robuuste Z-score normalisatie. Systematische fouten zoals tussen platen variaties zijn verwijderd uit de data. Rode lijnen geven het gemiddelde ± SEM van positieve binnen-plaat controles. Zwarte lijn: hit identificatie cut-off waarde zoals bepaald door Youden-Index optimalisatie (figuur 3). Overgenomen met toestemming van 14, 2012 ACS. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
0439fig3.jpg "/>
Figuur 3. Screen resultaten. a) Heatmap van het scherm resultaten. Robuuste Z-score waarden van bibliotheek verbindingen worden uitgezet in de betreffende put posities. De positieve controles in kolom 12 en twee positieve hit verbindingen in putten F8 en E2 zijn zichtbaar. B) Heatmap van een plaat toont overdracht van een positieve verbinding tijdens bibliotheek voorbereiding met een pipetteren robot. Een gradiënt van activiteit zichtbaar langs het pipetteren weg die de robot. C) Receiver operating characteristic (ROC) curve voor het scherm. De geschatte ware positieve tarieven (linker y-as) en fout-positieve (x-as) wordt uitgezet voor het verhogen van robuuste Z-score cut-off-waarden (kleurcode, rechter y-as). De AUC-waarde van de resulterende curve dicht bij 1, wat aangeeft goede testprestaties. Overgenomen met toestemming van 14, 2012 ACS. D) Tabel met verbindingen actief (yellow) of inactief (blauw) in de primaire scherm (Prim.) of in de hertest. Bona fide glucocorticoïden werden niet altijd opnieuw getest (wit). Opnieuw getekend met toestemming van 14, 2012 ACS. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
| Algemene instellingen: | |||
| Stap 1.1 | |||
| Procedure | Type: | enkele vloeistof | |
| modus: | opblazen | ||
| doseert per aspireren: | 1 | ||
| optimaliseren voor snelheid: | Ja | ||
| luchtspleten systeem: | 10 gl | ||
| vervoer: | 0 | ||
| Flush / Wash | Geen | ||
| Aspireren | Type instelling | Waarde | opmerkingen |
| Positie | B7, B10, B13, B16 | ||
| Aspireren Vol. | 10 gl | ||
| Snelheid | 200 ul / sec | ||
| Vloeistof volgen | 60% | ||
| Aspireren Hoogte | Labware default | 22.28 | |
| Uitdelen | Type instelling | Waarde | opmerkingen |
| Posities | D7, D10, D13, D16 | ||
| Afzien Vol. | 10 gl | ||
| Snelheid | 200 ul / sec | ||
| Vloeistof volgen | 100 pl | ||
| Afzien Hoogte | Labware default | 17.01 | |
| Stap 1.2 | |||
| Procedure | Type: | reagens | |
| modus: | afval | ||
| doseert per aspireren: | 3 | ||
| optimaliseren voor snelheid: | Ja | ||
| luchtspleten systeem: | |||
| vervoer: | 0 | ||
| Flush / Wash | Geen | ||
| Aspireren | Type instelling | Waarde | opmerkingen |
| Positie | A4 | ||
| Aspireren Vol. | 3 x 490 gl | ||
| Luchtspleten | 15 en 0 | ||
| Snelheid | 200 ul / sec | ||
| Vloeistof volgen | 400% | ||
| Aspireren Hoogte | Vloeistofoppervlak | ||
| Uitdelen | Type s etting | Waarde | opmerkingen |
| Positie | D7, D10, D13, D16 | ||
| Afzien Vol. | 490 pl | ||
| Luchtspleten | 15 en 0 | ||
| Snelheid | 200 ul / sec | ||
| Vloeistof volgen | 100% | ||
| Afzien Hoogte | Labware default | 17.01 | |
Tabel 1. Instellingen voor Multiprobe II. Het protocol in Tabel 1 beschrijft de bereiding van 4 platen (per 96 putjes). De platen liggen op plaat adapters in het werkgebied op de posities die door de robot (bijv. B7, B10, B13, B16).
1 "fo: keep-together.within-page =" altijd ">Discussion
We presenteren hier de workflow en data-analyse voor een chemisch scherm meet GC activiteit in vivo met behulp van de Grizly assay 18. De test heeft kwaliteitscontrole en-prestaties maatregelen die vergelijkbaar zijn met conventionele cel-gebaseerde schermen zijn, een belangrijk voordeel voor het gebruik in high-throughput-instellingen. Bovendien, echter, de in vivo analyse detecteert ook verbindingen die niet toegankelijk zijn in vitro schermen. Dit wordt geïllustreerd door de aanwezigheid van het prohormoon pregnenolon onder de hits. Aldus de Grizly assay breidt het toepassingsgebied schermen ter GC signaleringsactiviteit.
Het belang van de detectie van de in vivo effecten onze test blijkt ook resultaten die we verkregen met de organische verontreinigingen DBT en TBT 18. DBT, maar niet TBT, is aangetoond dat GC signalering blokkeert in zoogdierlijke celkweek en zagen we hetzelfde in zebravis celkweken tot expressieing de GRE: Luc reporter. Belangrijk is echter de Grizly test TBT vertoonden remmende activiteit op de GC pad, zoals deze aan DBT kan worden omgezet door de larven metabolisme. Deze remming werd al waargenomen bij milieurelevante concentraties van TBT. Deze resultaten van het potentieel van de Grizly test verder te illustreren in het opsporen van samengestelde effecten op basis van inter-orgel cross-talk en metabole aanpassingen van de verbindingen in het levende dier. Ze benadrukken ook de toepassingsmogelijkheden van de Grizly test voor toezicht op het milieu. Aldus kan endocrien verstorende effecten worden bestudeerd op het niveau van receptor-signalering, waarbij de disruptor interfereert met GC signalerende activiteit geïnduceerd door een GR agonist zoals dexamethason. Een andere mogelijkheid is om samengestelde effecten op pregnenolon gestimuleerde GC synthese bestuderen. De high throughput kwaliteit van de test moet de snelle screening van milieumonster bibliotheken mogelijk.
Het gebruik van luciferase als areporter gen zodat een hoge dynamische bereik van detectie van signalerende activiteit 23. Inderdaad, de gevoeligheid van de test maakt het mogelijk om osmotische stress geïnduceerde GC productie detecteren uit een larven 18. De hoge tijdsresolutie bereikt met de luciferase reporter kunnen we signalering activiteiten in tijd, waardoor het mogelijk analyseert ook de kinetiek van de gegevens is vastgesteld.
Een mogelijk nadeel voor sommige toepassingen is de beperkte geschiktheid voor ruimtelijke controle van dit reportersysteem. Fluorescerende reportersystemen wellicht beter geschikt voor testen die de controle op bepaalde gebieden van de larven vereist. Echter mogelijk dergelijke tests lijden lagere gevoeligheid als gevolg van achtergrondlicht invloeden veroorzaakt door het excitatielicht, die ook stelt grenzen aan de detectie van fluorescerende verbindingen. Daarnaast kunnen ze minder kinetische resolutie bieden vanwege de algemeen hogere stabiliteit van fluorescerende eiwitten 23.Bovendien presenteren zij uitdagingen op het gebied van imaging apparatuur, data-analyse en data-opslag die het gebruik ervan voor kleinere onderzoekslaboratoria kunnen beperken.
De set-up van de Grizly test zoals een microtiterplaat gebaseerde test zorgt voor eenvoudige integratie in typische screening workflows. De test is eenvoudig toe te passen ook in kleinere onderzoekslaboratoria vanwege de eenvoudige bediening en data-analyse. Op hetzelfde moment, het zorgt voor een hoge mate van automatisering, bijvoorbeeld geautomatiseerd drugtoepassing door pipetteren robots of automatische distributie van embryo's door embryo sorteren apparaten 24,25. De eenvoudige uitlezing niet geautomatiseerde screening microscopen of geavanceerde beeldanalyse software nodig, maar biedt een rijke set van gegevens over de temporele en kwantitatieve aspecten van de bestudeerde signaalweg.
Samengevat, geven we een stap-voor-stap protocol voor een relatief goedkope, robuuste en eenvoudig te hanteren chemische screening test voor GCsignalerende activiteit in vivo en in real time. De assay maakt de bepaling van de in vivo effecten van verbindingen van GC signalering niet detecteerbaar in celkweek gebaseerde bepalingen. Onder de vele aanvragen voor de test zijn bijvoorbeeld de bepaling van genetische effecten op glucocorticoïd signalering, toezicht op het milieu van endocrien verstorende effecten op glucocorticoïden synthese en signalerende activiteit, en de screening van verbindingen voor ongewenste effecten op GC signalen of voor de roman in vivo modulatoren van deze belangrijke signalerende weg.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken S. Burkhart, C. Hofmann en Simone Gräßle voor een uitstekende technische bijstand en zijn dankbaar aan M. Ferg voor hulp bij data-analyse. We danken ook S. Rastegar voor kritische opmerkingen over het manuscript. Wij erkennen financiering door de Studienstiftung des deutschen Volkes (op MW), de DFG (DI913/4-1) en het Helmholtz Program BioInterfaces bij het KIT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer composition + reagents | |||
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Carl Roth GmbH Co KG | A994.2 | |
| FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| E3 | N/A | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 |
| Instruments | |||
| Multiprobe II | PerkinElmer | 8 channel, equipped with disposable tip adaptor | |
| Liquidator 96 | Steinbrenner Laborsysteme | hand-operated 96-channel pipette | |
| EnVision XCite Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector | |
| Plasticware + consumables | |||
| 96-Well Storage Plate | ABgene | AB-0765 | round well, 0.8 ml |
| Cover films, | ratiolab | 6018412 | self adhesive, DMSO resistent |
| Pipette tips | Steinbrenner Laborsysteme | LRF-200L | for liquidator 96, 200 μl, low retention |
| TopSeal-A | PerkinElmer | 6005185 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005299 | white opaque 96-well microplate |
| Barcode Labels | PerkinElmer | 1608182 | |
| filtered polypropylene IsoTip pipette tips | Corning | S058.4809 | |
| Animals | |||
| GRE:Luc fish | N/A | ZDB-TGCONSTRCT-120920-1 | available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe |
References
- Norris, D. O. Vertebrate Endocrinology. , 4, Elsevier Academic Press. (2007).
- Kassel, O., Herrlich, P. Crosstalk between the glucocorticoid receptor and other transcription factors: molecular aspects. Mol Cell Endocrinol. 275, 13-29 (2007).
- Baschant, U., Tuckermann, J. The role of the glucocorticoid receptor in inflammation and immunity. J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 69-75 (2010).
- Schacke, H., Docke, W. D., Asadullah, K. Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids. Pharmacol Ther. 96, 23-43 (2002).
- De Bosscher, K. Selective Glucocorticoid Receptor modulators. J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 96-104 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nat Protoc. 4, 1422-1432 (2009).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 3, 454-460 (2010).
- Casals-Casas, C., Desvergne, B. Endocrine disruptors: from endocrine to metabolic disruption. Annu Rev Physiol. 73, 135-162 (2011).
- Grun, F., Blumberg, B. Minireview: the case for obesogens. Mol Endocrinol. 23, 1127-1134 (2009).
- Odermatt, A., Gumy, C., Atanasov, A. G., Dzyakanchuk, A. A. Disruption of glucocorticoid action by environmental chemicals: potential mechanisms and relevance. J Steroid Biochem Mol Biol. 102, 222-231 (2006).
- Odermatt, A., Gumy, C. Glucocorticoid and mineralocorticoid action: why should we consider influences by environmental chemicals. Biochem Pharmacol. 76, 1184-1193 (2008).
- Lohr, H., Hammerschmidt, M. Zebrafish in endocrine systems: recent advances and implications for human disease. Annu Rev Physiol. 73, 183-211 (2011).
- Schaaf, M. J. Discovery of a functional glucocorticoid receptor beta-isoform in zebrafish. Endocrinology. 149, 1591-1599 (2008).
- Schaaf, M. J., Chatzopoulou, A., Spaink, H. P. The zebrafish as a model system for glucocorticoid receptor research. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 75-82 (2009).
- Alsop, D., Vijayan, M. The zebrafish stress axis: molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. Gen Comp Endocrinol. 161, 62-66 (2009).
- Alsop, D., Vijayan, M. M. Molecular programming of the corticosteroid stress axis during zebrafish development. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 49-54 (2009).
- Schoonheim, P. J., Chatzopoulou, A., Schaaf, M. J. The zebrafish as an in vivo model system for glucocorticoid resistance. Steroids. 75, 918-925 (2010).
- Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical Screening System for Glucocorticoid Stress Hormone Signaling in an Intact Vertebrate. ACS Chem Biol. 7, (2012).
- Hirota, T. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20746-20751 (2008).
- Birmingham, A. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Warnes, G. R., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Liaw, W. H. A. gplots: Various R programming tools for plotting data. 2.11.0, (2012).
- Carey, V., Redestig, H. ROC: utilities for ROC, with uarray focus. , Boston, MA, USA. (2013).
- Fan, F., Wood, K. V. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev Technol. 5, 127-136 (2007).
- Graf, S. F., Hotzel, S., Liebel, U., Stemmer, A., Knapp, H. F. Image-based fluidic sorting system for automated Zebrafish egg sorting into multiwell plates. J Lab Autom. 16, 105-111 (2011).
- Letamendia, A. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS ONE. 7, e36690 (2012).
