Summary
Vi beskriver förfarandet och dataanalys av en kemisk screening system för glukokortikoid stresshormon signalering med hjälp av zebrafisk larver: glukokortikoid Responsive In vivo Zebrafish luciferasaktivitet (GRIZLY) analys. Analysen känsligt och specifikt upptäcker effekter på glukokortikoid signalering av föreningar som kräver metabolization eller påverkar endogen glukokortikoid produktion.
Abstract
Glukokortikoid stresshormoner och deras konstgjorda derivat används ofta läkemedel för behandling av inflammation, men långvarig behandling med glukokortikoider kan leda till allvarliga biverkningar. Testsystem behövs för att söka efter nya substanser som påverkar glukokortikoid signalering in vivo eller för att bestämma oönskade effekter av föreningar på glukokortikoid signalväg. Vi har etablerat en transgen zebrafisk analys vilken tillåter mätningen av glukokortikoid aktivitet signalering in vivo och i realtid, den GRIZLY assay (Glukokortikoid Responsive In vivo Zebrafish luciferasaktivitet). Luciferas-baserad analys detekterar effekter på glukokortikoid-signalering med hög känslighet och specificitet, inklusive effekter genom föreningar som kräver metabolisering eller påverkar endogen glukokortikoid produktion. Vi presenterar här ett detaljerat protokoll för kemikaliefri skärmar med denna analys. Vi beskriver datainsamling, normalisering ochanalys, placera fokus på kvalitetskontroll och datavisualisering. Analysen ger en enkel, tidsupplöst och kvantitativ avläsning. Den kan drivas som en fristående plattform, men är också lätt integreras i high-throughput screening arbetsflöden. Det möjliggör dessutom för många tillämpningar utanför kemisk screening, såsom kontroll av hormonstörande ämnen eller stress miljöforskning.
Introduction
Glukokortikoider (GCS) är steroidhormoner som produceras av binjuren, som spelar en viktig roll under stress och i regleringen av ämnesomsättningen 1. GC binder cytoplasmiska glukokortikoidreceptorer (GRS) av den nukleära receptorsuper som, vid bindning, translocate in i kärnan 2. Här kan de exempelvis trycka transkription genom att störa andra transkriptionsfaktorer (transrepression) eller aktivera gentranskription via glukokortikoid responselement (gres, trans). På grund av sina antiinflammatoriska egenskaper, är både naturliga och konstgjorda GC ofta används läkemedel för behandling av en rad sjukdomar, som astma eller artrit 3. Däremot kan speciellt långvarig användning av GC leda till allvarliga biverkningar, inklusive diabetes och glaukom 4. Därför är nya substanser som GC signalering med potentiellt mer gynnsam behandling effektivitet och tolerabilitet traktade akteruter. Viktigt kan ligand effekter som observerats i odlade celler skiljer sig från de som ses in vivo 5. Sådana effekter kan partiskhet resultat som erhållits med konventionella cellkultur baserad läkemedelsscreeninganalyser. Kemisk in vivo-screening som möjliggörs av den zebrafisk modell har nyligen kommit i fokus, eftersom den gör det möjligt att bestämma effekter ej finnas i cellodling 6,7.
Hormonella signalvägar kan också påverkas av miljöföroreningar. Så kallade hormonstörande kemikalier (EDC) påverkar olika hormonreglerade processer 8. Således kan fortplantning och sexuell differentiering av vattenlevande organismer moduleras av ämnen med östrogenliknande aktiviteter. Nyligen har framförts att metabola sjukdomar kan kopplas till EDCs i miljön 9. En väg måltavla för sådana "metabolisk störning" är glukokortikoid vägen, vilket också har varit inblandad i xenoantibiotika effekter på utveckling och immunförsvaret 10,11. Men jämfört med den stora mängd information som finns tillgänglig på föreningar som stör könssteroidhormon handling, relativt lite känt om hormonstörande effekter som förmedlas via GR. Därför är verktyg som behövs som tillåter övervakning av förorenande effekter på GC-signalering in vivo.
Den zebrafisk har länge varit en populär modell i utvecklingsbiologi och har på senare tid även lockat forskare från andra områden, inklusive endokrinologi 12. Jämfört med andra teleosts är systemet av zebrafisk GC signalerings mer liknar den hos däggdjur, eftersom zebrafisk-genom endast innehåller en GR-gen i motsats till de duplicerade receptorer i många andra fiskarter 13-15. Dessutom är hypotalamus-hypofys-binjure-axeln redan funktionella i 5 dygn gammal zebrafisk larver, vilka ökar endogen GC-produktion som svar på stressfaktorer 14,16-18.
Vi har nyligen genererat en transgen zebrafisk linje, GRE: Luc, som möjliggör övervakning av GC-signaleringsaktivitet in vivo och i realtid 18. Linjen uppbär en luciferasrapportörgen konstrukt under kontroll av en minimal TATA-box-promotorn och fyra concatemerized GRE (Figur 1A). GC inducerad bioluminiscens kan mätas från enstaka GRE: Luc larver i 96 väl mikrotiterplattor in vivo under längre perioder. Denna GRIZLY analys (för "Glukokortikoid Responsive In vivo Zebrafish luciferasaktivitet") kan användas inom en rad olika forskningsområden, såsom stress forskning, miljöövervakning, och farmakologiska skärmar 18. Vi kunde upptäcka den endogena ökningen av kortisol efter osmotisk stress från enstaka larver och kunde följa mognaden av svaret under utveckling. Dessutom kan vi övervaka effekterna på GC signalering av tennorganiskas som kräver metabolization av larven. Viktigt linjen kunde upptäcka dessa effekter på miljömässigt relevanta koncentrationer. Slutligen, i en pilot skärm analysen känsligt och specifikt detekterade föreningar med GC aktivitet från ett kemiskt bibliotek, däribland en förening som stimulerade endogen kortisolproduktion i larverna. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för kemiska skärmar använder GRIZLY assay.
Protocol
1. Bered Working Utspädning av Chemical Library
Predilute föreningarna med läkemedelsbiblioteket, som skall testas (t ex FDA-godkända läkemedel, ENZO Life Science) i E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2) med en robotvätskehanterande station (t.ex. Multiprobe II, åtta nålar med omhändertagande tip adapter, PerkinElmer). Lämpliga koncentrationer är t.ex. 40 pg / ml i 3% DMSO, men detta kommer att bero på den typ av bibliotek som används. Inställningarna Multiprobe II motsvarar de steg som beskrivs nedan anges i tabell 1. Det protokoll som beskrivits i tabellen möjliggör framställning av fyra alikvota plattorna parallellt.
- Pipettera 10 l alikvoter av stambiblioteket (2 mg / ml i DMSO) i djupa brunnar (t.ex. 96-Well Storage Plate, Round Well, 0,8 ml, ABgene). Kolumn 1 och 12 skall lämnas tomma - dessa kommer att få de positiva och negativa inom-platta kontroller.
- Tillsätt 10 l av DMSO i kolumn 1 och 10 pl av en 5 mM dexametason-lösning (i DMSO) till kolumn 12 som inom-platta kontroller. Koncentrationen av DMSO i alla brunnar är nu 3%, den dexametason koncentrationen i de positiva kontrollbrunnarna är 100 ^ M i E3 / 3% DMSO.
- Täta plattan med DMSO resistent självhäftande tätningsblad. Förvara plattorna vid -80 ° C fram till användning.
2. Uppfödning av Reporter Fish
Samla embryon från naturlig lek grupp parningar mellan GRE: Luc transgen fisk. Höj embryon (ej mer än 60) i 9 cm Petri-skålar innehållande E3-medium kompletterat med 1 mg / ml av fungiciden metylenblått tills fyra dagar efter befruktning (dpf) i en inkubator vid 28 ° C. Byt E3 medel regelbundet.
title "> 3. Beredning av luciferas Medium (E3L)Förbered en vatten luciferin stamlösning av 50 mM genom att lägga dH 2 O till injektionsflaskan innehållande luciferin pulvret. Denna stamlösning kan lagras vid -80 ° C under flera månader. Späd luciferin lager till E3-medium till en slutlig koncentration av 0,5 mM för att erhålla E3L medium.
4. Fördela Larver i 96-brunnsplattor
- Bered en ml pipettspetsar med stort hål genom att skära av ca 5 mm från spetsen och i korthet flammande de skarpa kanterna.
- Pool larver från flera korsningar genom att försiktigt hälla dem från Petri-skålar i en bägare. Harvest ca 50 larver vid en tidpunkt genom att försiktigt hälla dem på en sikt (porstorlek 0,25 mm diameter) och omedelbart placera sil i en liten petriskål (diameter 5,5 cm) fylld med E3L medium.
- Med ett stort hål pipettspets, överför 225 ul av medium innehållande en larv vardera till brunnarna på en vit96 brunnar (OptiPlate, PerkinElmer).
- Täta plattorna med självhäftande tätningsblad (t.ex. TopSeal-A, PerkinElmer) och inkubera dem vid 28 ° C över natten. Denna preinkubation förhindrar inspelning av övergående förändringar i mareld omedelbart efter tillsats av luciferin, ett fenomen som också förekommer i odlade celler 19.
5. Läkemedelsbehandling
- Ta bort plattan som innehåller arbetsutspädning av biblioteket från -80 ° C frys ca 4 timmar före användning. Vortexa försiktigt plattan och kortfattat snurra det i en centrifug för uppsamling av vätska i botten av plattan.
- Avlägsna självhäftande tätningsblad från larver plattorna.
- Med en handmanövrerad 96-kanalspipetteringsanordning (t.ex. Liquidator, Steinbrenner) pipett läkemedelslösningen upp och ner 3 gånger. Då alikvot 25 pl av arbetsspädning av kemiskt bibliotek i brunnarna innehåller larver (med exemplet ovan, dettaresulterar i en slutkoncentration av 4 ng / ml i E3 med 0,3% DMSO). Förbered 10 (minimum: 5) replika plattor med larver per biblioteks platta.
- Täta plattor med de självhäftande tätningsblad och märka varje platta med en streckkod klistermärke.
6. Luminescence Recording
- Sätt plattorna innehåller larver i stapling enheter av en EnVision mareld läsare med förbättrad luminiscens känslighet (PerkinElmer). Alternativt kan du använda en robotiserad inkubatorsystem som de som används för däggdjurscellodlingsscreeningsystem i kombination med läsaren.
- Registrering bioluminescens för två dagar med användning av läsarinställningar som är analoga med de som beskrivits i tabell 2 för EnVision läsaren. Anpassa antalet analys upprepningar till antalet plattor i körningen för att matcha önskad drifttid.
- Efter slutet av körningen, kontrollera plattorna med avseende på förekomst av döda larver att utvärdera allmän toxicitet compounds.
7. Dataanalys
Alla dataanalys utförs i miljön statistiska programmerings R med hjälp av anpassade skript.
- AUC beräkning
För att identifiera föreningar som aktiverar GC signalering oavsett kinetiska egenskaper, bestäm arean under kurvan (AUC) av de registrerade luminiscens spår (mareld rå räknas vs tid) som screening parameter. AUC approximeras med trapetsregeln (se diagram 2a och a '). - Normalisering
Logga omvandla AUC-värdena för att säkerställa en högre normalitet av data (figur 2b och b '). Sedan normalisera log transforme AUC-värdena för varje bibliotek platta med den robusta Z-score-metoden (se 20). Denna normalisering resulterar i värden som representerar antalet standardavvikelser från medianen av alla datapunkter. På detta sättsystematiska fel, som till exempel inter run variabilitet, tas bort från datan. Uppgifterna kan nu visualiseras genom att plotta den genomsnittliga robusta Z-score av repliker för varje brunn (figur 2c och c '). - Kvalitetsmått
- Heatmap
För att visualisera plåtrelaterade effekter, plotta data för varje platta som en heatmap med t.ex. den heatmap.2 funktion gplot paketet 21. På detta sätt kan kanteffekter eller förening överföring lätt upptäckas (t.ex. jämföra figur 3a med 3b). Uteslut suboptimala plattor från vidare analys. - ROC-kurva
För att bestämma känsligheten och specificiteten hos analysen, beräkna en mottagare som arbetar karakteristisk (ROC)-kurva, t.ex. med hjälp av ROC bioledare paketet 22 med hjälp av Z-score värden som bestäms i 7.2 (figur 3c). Därefter bestämmer AUC för denna curve. Ett AUC-värde nära 1 indikerar hög känslighet och specificitet för analysen.
- Heatmap
- Hit Identifiering
För att optimera gränsvärdet för identifiering av aktiva föreningar, bestämma Youden Index. För att beräkna index, subtrahera den beräknade sant positivt ränta (RTB) från den falska positiva (FPR) i ROC-kurvan för att öka robusta Z-score gränsvärdena. Ta den robusta Z-poäng med högsta Youden Index (RTB minus FPR) som brytpunkten. The TPR / FPR kan uppskattas genom detektion av positiva kontrollbrunnar eller av kända aktiva föreningar inom biblioteket. Vid användning av positiv kontroll brunnar se till att de matchar den förväntade träffstyrkan.
8. Omprov
- Utvärdera positiv träff föreningar genom behandling larver med seriespädningar av de föreningar som erhållits från en annan leverantör, med användning av samma inspelnings ställt upp som beskrivits ovan. Sanna träffar bör inducera luminiscens enLSO i denna analys, helst på ett dosberoende sätt.
Representative Results
I en tidigare publikation 18, skärmad vi ett bibliotek av 640 FDA-godkända läkemedel i en pilot skärmen för att utvärdera prestandan hos GRIZLY assay. Detta bibliotek innehåller 12 äkta GC, vilket gör det möjligt för oss att bestämma kvalitetsmått för känslighet och specificitet för analysen.
Figur 2 visar typiska exempel på rådataanalys och normalisering tas från denna skärm. Ett typiskt resultat från en dexametason kontrollbrunnen visas i figur 2a, som visar den temporala information som ges av dessa data. En topp i mareld som inträffar vid ungefär 12 timmar efter behandlingen avtar långsamt under följande 36 timmar av mätning. Figur 2a "belyser tillnärmning av AUC-värdet med hjälp av trapetsmetoden. Denna beräkning görs för alla brunnar och varje teknisk upprepning. Resultatet av den log-transformation visas i figurerna 2b </ Strong> och b ". Här medelvärdet av de positiva kontrollerna är avsatta i ett normalt QQ plot. Logga omvandling leder till en större tillnärmning av datapunkterna till de teoretiska normalfördelade värden som anges av de röda diagonaler. En omvandling för att uppnå normalitet av uppgifterna ökar den statistiska kraften i de efterföljande analyserna. Slutligen Figurerna 2c och 2c "visar effekten av robusta Z-score normalisering på plåt-till-plåt variabilitet: De olika utgångsvärden som erhålls med olika plattor (Figur 2c) normaliseras i den robusta Z-score plotten i Figur 2c".
De robusta Z-score värden kan användas för att identifiera systematiska fel i uppgifterna genom att visualisera fördelningen av träffar över plattorna Figur 3a. Visar ett exempel på en heatmap av ett bibliotek platta, där den robusta Z-score valderingar plottas färgkodade i brunnen positioner. Man identifierar lätt kolumn 12 med i-platta positiva kontroller. Positiva poäng biblioteksföreningar ses i väl F8 och, om än svagare, visar E2. Figur 3b en platta där ett systematiskt fel är närvarande. Man observerar en serie föreningar med minskande Z-score värden i raderna A och E över flera kolumner. Ingen av föreningarna i dessa brunnar testades positiva vid omtestning. Eftersom brunnarna med detta minskar GRIZLY provverksamhet är placerade längs banan pipetteringsroboten tar när alikvotering biblioteket plattorna, är detta mönster tyder på överföring av en positiv förening under den automatiska pipetteringsprocessen.
Den robusta Z-score normalisering tillsammans med närvaron av kända GCs i biblioteket också möjligt för oss att beräkna en Receiver Operating Characteristic (ROC)-kurva för skärmen 18 Figur 3c. Visar ett diagram över den beräkparat sant positivt kurs mot den uppskattade falsk positiv för olika robusta Z-score gränsvärdena. Den uppskattade sant positivt Graden definieras som den andel av sant positiva träffar (här, de kända glukokortikoider som finns i biblioteket) som finns vid en given robust Z-score gränsvärdet. Motsvarande beräknade falskt positivt värde indikerar att andelen icke-positiva föreningar hit vid denna brytpunkt. AUC för denna kurva är 0,95, vilket indikerar en hög sensitivitet och specificitet av skärmen och utmärkt analysprestandan. AUC-kurvan också för att uppskatta den optimala gränsvärdet för hit identifikation genom att beräkna Youden index för olika robusta Z-värdena. Vi identifierade den robusta Z-poäng på 1,49 som har det högsta Youden index. Detta gränsvärde visas i figur 2c "som en svart linje som separerar träffar från huvuddelen av föreningarna.
I vår skärm18, kunde vi identifiera nästan alla kända GC närvarande i biblioteket. Endast tre av de 12 bona fide GC inte upptäcktes. I fallet med melengestrolacetat, detta var ett falskt negativt fynd, eftersom denna förening testades positivt i återtestet vid en högre koncentration än den som används i biblioteket. De andra två GC var negativ även i re-testet. Kortikosteron är den stora GC i gnagare, men inte i fisk eller människa 1, medan den prodrug prednison inte kan metaboliseras väl av larv systemet. Intressant också två läkemedel inte annoterade som GC identifierades i skärmen, där man inte kunde bekräftas i omprovet (spironolakton, en mineralkortikoidreceptorn antagonist). Den andra föreningen, pregnenolon, är en föregångare i steroidbiosyntes, som omvandlas till kortisol från binjurarna. Faktum behandling med pregnenolon stimulerade kortisolproduktion i larverna 18. Alla dessa resultat bekräftar den höga performance av analysen: bara en falsk negativ och en falskt positiv förening var bland resultaten primär skärm, och 10 av de 11 bekräftade föreningar med GC signalering stimulerande aktivitet identifierades redan i den primära skärmen.
Figur 1. Allmän princip för analysen och-flödet av prövningsförfarandet. A) System för GRIZLY analys reporter konstruktion. Luciferas (gul) uttryck styrs av en minimal promotor (P min, orange) och fyra concatemerized GRE element ((GRE) 4, vit), som är bundna av ligand-aktiverad GR homodimerer (GR, blå). Röda rutor indikerar Tol2 transposas webbplatser som underlättar integration av konstruktionen in i genomet. Den rosa ruta representerar en poly-adenylering webbplats (pA). Transgena larver bär denna konstruct placeras i opaka 96 väl mikrotiterplattor för bioluminescence mätningar. b) System för luciferas-reaktionen. Luciferas katalyserar oxidationen av luciferin att oxyluciferin, vilket leder till ljusemission (hv). Reaktionen kräver också ATP och Mg 2 +, som tillhandahålls av larven. PP i, pyrofosfat. C) Arbetsflöde på skärmen. Arbets stock utspädningar framställes från en FDA-godkänd läkemedelsbiblioteket i 96 brunnars plattor, en kolonn innehållande en negativ inom plåtstyrning (DMSO enbart, grön) och en kolonn innehållande en positiv kontroll (Dexametason, röd) (biblioteksdesign). GRE: Luc larver är fördelade i 96 brunnar (5-11 replikat) och behandlas med biblioteksföreningar (Drug Application). Bioluminescence spår spelas in med en mareld läsare i två dagar (datainsamling). Bioluminescence spår är integrerade (AUC beräkningar), logga omvandlas och robust Z-score normaliserad (normalisetion). Normaliserade data används för att bestämma kvalitetsmått och för träff identifiering (dataanalys). Valda träffar omprövas för dosberoende aktivitet i analysen (omtest). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Dataanalys illustreras med data från en skärm av ett FDA-godkända läkemedel bibliotek. a) Representant spår från en positiv kontroll väl. a) Arean under kurvan (AUC) approximeras med trapetsregeln. De trapetser som används för beräkningen visas i olika nyanser av rött. B) Normal QQ plot av råa AUC-värdena för de positiva kontrollbrunnarna (y-axeln) jämfört med en vanlig normalbefolkningen (x-axel) innan logg förvandling. B ' ) Normal QQ plot av AUC-värden efter log omvandling. En normal fördelning indikeras av linearitet logg transformerad datapunkter. C) Rita av log transformerad rådata för alla föreningar som testades i skärmen. Blå, bona fide glukokortikoider,. Grå, alla andra föreningar c) Rita av skärm data efter robust Z-score normalisering. Systematiska fel såsom mellanplatt variationer har tagits bort från datan. Röda linjer visar medelvärdet ± SEM av positiva inom-platta kontroller. Svart linje: hit identifiering gränsvärde som fastställs av Youden-index optimering (Figur 3). Reproducerad med tillstånd från 14 2012 ACS. Klicka här för att visa en större bild .
0439fig3.jpg "/>
Figur 3. Skärm resultat. a) heatmap skärmresultat. Robust Z-score värden av biblioteksföreningar ritas in i respektive brunnspositioner. De positiva kontroller i kolumn 12 samt två positiva hit föreningar i brunnar F8 och E2 är synliga. B) Heatmap av en platta som visar överföring av en positiv förening vid biblioteket förberedelse med en pipetteringsrobot. En gradient av aktivitet är synlig längs pipettering väg som roboten. C) Receiver operating characteristic (ROC)-kurva för skärmen. De uppskattade sant positiva priser (vänster y-axel) och falska positiva värden (x-axel) plottas för att öka robusta Z-score cutoff-värdena (färgkodade, höger y-axel). AUC-värdet för den resulterande kurvan är nära 1, vilket indikerar god analysprestandan. Reproducerad med tillstånd från 14 2012 ACS. D) tabell visar föreningar som aktiv (yellow) eller inaktiv (blå) i den primära skärmen (prim.) eller i omtest. Bona fide glukokortikoider var inte alltid testas (vit). Ritas med tillstånd från 14 2012 ACS. Klicka här för att visa en större bild .
| Allmänna inställningar: | |||
| Steg 1,1 | |||
| Procedur | typ: | enda vätska | |
| Förfarande: | blåsa ut | ||
| dispenserar per aspirera: | 1 | ||
| optimera för snabbhet: | Ja | ||
| luftgap System: | 10 | il | ||
| transport: | 0 | ||
| Flush / Wash | Ingen | ||
| Aspirera | Typ av inställning | Värde | anmärkningar |
| Position | B7, B10, B13, B16 | ||
| Aspirera Vol. | 10 | il | ||
| Hastighet | 200 ^ l / sek | ||
| Flytande spårning | 60% | ||
| Aspirera Höjd | Labware standard | 22,28 | |
| Dispensera | Typ av inställning | Värde | anmärkningar |
| Positioner | D7, D10, D13, D16 | ||
| Fördela Vol. | 10 | il | ||
| Hastighet | 200 ^ l / sek | ||
| Flytande spårning | 100 | il | ||
| Dispensera Höjd | Labware standard | 17,01 | |
| Steg 1,2 | |||
| Procedur | typ: | reagens | |
| Förfarande: | avfall | ||
| dispenserar per aspirera: | 3 | ||
| optimera för snabbhet: | Ja | ||
| luftgap System: | |||
| transport: | 0 | ||
| Flush / Wash | Ingen | ||
| Aspirera | Typ av inställning | Värde | anmärkningar |
| Position | A4 | ||
| Aspirera Vol. | 3 x 490 l | ||
| Luftspalter | 15 och 0 | ||
| Hastighet | 200 ^ l / sek | ||
| Flytande spårning | 400% | ||
| Aspirera Höjd | Vätskeytan | ||
| Dispensera | Typ av s Komma | Värde | anmärkningar |
| Position | D7, D10, D13, D16 | ||
| Fördela Vol. | 490 | il | ||
| Luftspalter | 15 och 0 | ||
| Hastighet | 200 ^ l / sek | ||
| Flytande spårning | 100% | ||
| Dispensera Höjd | Labware standard | 17,01 | |
Tabell 1. Inställningar för Multiprobe II. Protokollet i Tabell 1 beskriver framställningen av 4 plattor (vardera 96 brunnar). Plattorna finns på platt adaptrar inom arbetsområdet vid positioner som anges av roboten (t.ex. B7, B10, B13, B16).
1 "fo: keep-together.within-page =" alltid ">Discussion
Vi presenterar här arbetsflödet och dataanalys för en kemisk skärm som mäter GC-aktivitet in vivo med hjälp av GRIZLY analys 18. Analysen har kvalitetskontroll egenskaper och prestanda åtgärder som är jämförbara med konventionella cell baserade skärmar, en viktig fördel för dess användning i hög genomströmning inställningar. Dessutom, dock känner vivo-analysen i också föreningar som inte är tillgängliga för in vitro-skärmar. Detta exemplifieras av närvaron av prohormon pregnenolon bland träffarna. Således sträcker sig GRIZLY assay omfattningen av skärmar som syftar till GC signaleringsaktivitet.
Vikten av att upptäcka in vivo-effekter med vår analys illustreras också av resultat vi erhållits med tennorganiska föroreningar DBT och TBT 18. DBT, men inte TBT, har visats inhibera GC-signalering i däggdjurscellkultur, och vi observerade samma i zebrafisk cellkulturer uttryckaning GRE: Luc reporter. Viktigt är emellertid i GRIZLY assay TBT uppvisade inhibitorisk aktivitet på GC-vägen, eftersom den kan omvandlas till DBT genom larv metabolism. Denna hämning redan observerats vid miljömässigt relevanta koncentrationer av TBT. Dessa resultat visar vidare potentialen i GRIZLY analysen att upptäcka sammansatta effekter som bygger på interorgan överhörning och metabola förändringar hos föreningarna i det levande djuret. De belyser också tillämpningen potential GRIZLY analysen för miljöövervakning. Sålunda kan hormonstörande effekter studeras vid nivån för receptorsignalering, där disruptor stör GC signaleringsaktivitet som induceras av en GR-agonist, såsom dexametason. En annan möjlighet är att studera sammansatta effekter på pregnenolon stimulerad GC-syntes. Den höga genomströmning kvalitet hos analysen bör tillåta snabb screening av bibliotek miljöprov.
Användningen av luciferas som areporter genen tillåter en hög dynamiska området för detektering av signaleringsaktivitet 23. Faktum är att känsligheten hos analysen är det möjligt att detektera osmotisk stressinducerad GC produktion från enkelt larver 18. Den höga tidsupplösning uppnås med luciferas reporter tillåter oss att följa signalverksamhet över tid, vilket gör det möjligt att också analysera kinetik datan.
En potentiell nackdel för vissa tillämpningar är det begränsad lämplighet för fysisk övervakning av denna reporter systemet. Fluorescerande reportersystem kan vara bättre lämpad för analyser som kräver övervakning av vissa delar av larver. Dock kan sådana analyser lider av lägre känslighet på grund av bakgrundseffekter som orsakas av exciteringsljuset, som också utgör gränserna för detektion av fluorescerande föreningar. Dessutom kan de ge mindre kinetisk upplösning på grund av den generellt högre stabilitet av fluorescerande proteiner 23.Dessutom presenterar de utmaningar i form av bildutrustning, dataanalys och datalagring som kan begränsa deras användning för mindre forskningslaboratorier.
Upplägget av GRIZLY analysen som en mikrotiterplatta baserad analys möjliggör enkel integrering i typiska screening arbetsflöden. Analysen är lätt applicerbar även i mindre forskningslaboratorier på grund av dess enkla hantering och dataanalys. Samtidigt möjliggör det en hög grad av automatisering, t.ex. automatiserad läkemedelsansökan genom att pipettera robotar eller automatiserad distribution av embryon från embryo sorteringsanordningar 24,25. Den enkla avläsning kräver inte automatiserade screening mikroskop eller avancerad bildanalys programvara, men ändå ger en rik uppsättning av uppgifter om tidsmässiga och kvantitativa aspekterna av den studerade signalväg.
Sammanfattningsvis presenterar vi en steg-för-steg-protokoll för en relativt billig, robust och enkel att hantera kemiska screeninganalys för GCsignaleringsaktivitet in vivo och i realtid. Analysen gör det möjligt att bestämma in vivo-effekter av föreningar på GC signalering inte kan spåras i cellodling baserade analyser. Bland de många applikationer för analysen är t.ex. bestämning av genetiska effekter på glukokortikoid signalering, kontroll av hormonstörande effekter på glukokortikoid syntes och signalering aktivitet miljön, och screening av föreningar för oönskade effekter på GC-signalering eller för romanen in vivo modulatorer av detta viktig signalväg.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar S. Burkhart, C. Hofmann och Simone Gräßle för utmärkt tekniskt bistånd och är tacksamma för M. Ferg för hjälp med dataanalys. Vi tackar också S. Rastegar för kritiska synpunkter på manuskriptet. Vi erkänner finansiering från Studienstiftung des deutschen Volkes (till MW), DFG (DI913/4-1) och Helmholtz Program Biointerfaces på SATS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer composition + reagents | |||
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Carl Roth GmbH Co KG | A994.2 | |
| FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| E3 | N/A | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 |
| Instruments | |||
| Multiprobe II | PerkinElmer | 8 channel, equipped with disposable tip adaptor | |
| Liquidator 96 | Steinbrenner Laborsysteme | hand-operated 96-channel pipette | |
| EnVision XCite Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector | |
| Plasticware + consumables | |||
| 96-Well Storage Plate | ABgene | AB-0765 | round well, 0.8 ml |
| Cover films, | ratiolab | 6018412 | self adhesive, DMSO resistent |
| Pipette tips | Steinbrenner Laborsysteme | LRF-200L | for liquidator 96, 200 μl, low retention |
| TopSeal-A | PerkinElmer | 6005185 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005299 | white opaque 96-well microplate |
| Barcode Labels | PerkinElmer | 1608182 | |
| filtered polypropylene IsoTip pipette tips | Corning | S058.4809 | |
| Animals | |||
| GRE:Luc fish | N/A | ZDB-TGCONSTRCT-120920-1 | available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe |
References
- Norris, D. O. Vertebrate Endocrinology. , 4, Elsevier Academic Press. (2007).
- Kassel, O., Herrlich, P. Crosstalk between the glucocorticoid receptor and other transcription factors: molecular aspects. Mol Cell Endocrinol. 275, 13-29 (2007).
- Baschant, U., Tuckermann, J. The role of the glucocorticoid receptor in inflammation and immunity. J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 69-75 (2010).
- Schacke, H., Docke, W. D., Asadullah, K. Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids. Pharmacol Ther. 96, 23-43 (2002).
- De Bosscher, K. Selective Glucocorticoid Receptor modulators. J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 96-104 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nat Protoc. 4, 1422-1432 (2009).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 3, 454-460 (2010).
- Casals-Casas, C., Desvergne, B. Endocrine disruptors: from endocrine to metabolic disruption. Annu Rev Physiol. 73, 135-162 (2011).
- Grun, F., Blumberg, B. Minireview: the case for obesogens. Mol Endocrinol. 23, 1127-1134 (2009).
- Odermatt, A., Gumy, C., Atanasov, A. G., Dzyakanchuk, A. A. Disruption of glucocorticoid action by environmental chemicals: potential mechanisms and relevance. J Steroid Biochem Mol Biol. 102, 222-231 (2006).
- Odermatt, A., Gumy, C. Glucocorticoid and mineralocorticoid action: why should we consider influences by environmental chemicals. Biochem Pharmacol. 76, 1184-1193 (2008).
- Lohr, H., Hammerschmidt, M. Zebrafish in endocrine systems: recent advances and implications for human disease. Annu Rev Physiol. 73, 183-211 (2011).
- Schaaf, M. J. Discovery of a functional glucocorticoid receptor beta-isoform in zebrafish. Endocrinology. 149, 1591-1599 (2008).
- Schaaf, M. J., Chatzopoulou, A., Spaink, H. P. The zebrafish as a model system for glucocorticoid receptor research. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 75-82 (2009).
- Alsop, D., Vijayan, M. The zebrafish stress axis: molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. Gen Comp Endocrinol. 161, 62-66 (2009).
- Alsop, D., Vijayan, M. M. Molecular programming of the corticosteroid stress axis during zebrafish development. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 49-54 (2009).
- Schoonheim, P. J., Chatzopoulou, A., Schaaf, M. J. The zebrafish as an in vivo model system for glucocorticoid resistance. Steroids. 75, 918-925 (2010).
- Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical Screening System for Glucocorticoid Stress Hormone Signaling in an Intact Vertebrate. ACS Chem Biol. 7, (2012).
- Hirota, T. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20746-20751 (2008).
- Birmingham, A. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Warnes, G. R., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Liaw, W. H. A. gplots: Various R programming tools for plotting data. 2.11.0, (2012).
- Carey, V., Redestig, H. ROC: utilities for ROC, with uarray focus. , Boston, MA, USA. (2013).
- Fan, F., Wood, K. V. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev Technol. 5, 127-136 (2007).
- Graf, S. F., Hotzel, S., Liebel, U., Stemmer, A., Knapp, H. F. Image-based fluidic sorting system for automated Zebrafish egg sorting into multiwell plates. J Lab Autom. 16, 105-111 (2011).
- Letamendia, A. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS ONE. 7, e36690 (2012).
