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दृश्य दोष विशेषताएँ जीर्ण नेत्र उच्च रक्तचाप के एक लेजर प्रेरित माउस मॉडल

Published: August 14, 2013 doi: 10.3791/50440
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2
1Department of Ophthalmology, Northwestern University, 2Department of Neurobiology, Northwestern University

Summary

क्रोनिक आंख का उच्च रक्तचाप माउस आँखों में trabecular meshwork के लेजर photocoagulation का उपयोग कर प्रेरित किया जाता है. intraocular दबाव (IOP) लेजर उपचार के बाद कई महीनों के लिए उठाया है. दृश्य तीक्ष्णता और प्रायोगिक पशुओं के विपरीत संवेदनशीलता की कमी optomotor परीक्षण का उपयोग निगरानी कर रहे हैं.

Abstract

अक्सर बुलंद intraocular दबाव (IOP) के साथ जुड़े रोग, अंधापन के प्रमुख कारणों में से एक है. हम मानव उच्च तनाव मोतियाबिंद की नकल करने की आंख का उच्च रक्तचाप के एक माउस मॉडल की स्थापना करने की मांग की. यहाँ लेजर रोशनी कोण बंद उत्प्रेरण, जलीय बहिर्वाह photocoagulate को कॉर्निया किनारी पर लागू होता है. IOP के परिवर्तन लेजर उपचार के पहले और बाद में एक पलटाव टनमीटर उपयोग पर नजर रखी जाती है. एक optomotor व्यवहार परीक्षण दृश्य क्षमता में इसी परिवर्तन को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है. लेजर रोशनी के बाद निरंतर IOP ऊंचाई विकसित की है जो एक माउस से प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया है. एक कम दृश्य तीक्ष्णता और विपरीत संवेदनशीलता इस आंख का उच्च रक्तचाप से ग्रस्त माउस में मनाया जाता है. साथ में, हमारे अध्ययन glaucomatous चूहों में neuronal अध: पतन और अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली का परिचय.

Protocol

प्रक्रिया

C57BL/6J चूहों (जैक्सन प्रयोगशाला, बार हार्बर, इ) नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय के पशु देखभाल सुविधा में उठाए गए हैं. सभी जानवरों नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति और एनआईएच से तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में पशुओं के उपयोग पर दिशा निर्देशों के पुष्टि द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है.

1. लेजर photocoagulation

लेजर photocoagulation की प्रक्रिया 5-7 पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है.

  1. Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा, बटलर Schein पशु स्वास्थ्य, ओह) और xylazine (आयोवा, Shenandoah के 10 मिलीग्राम / किग्रा, लॉयड इंक, आइए) की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा एक 40-60 दिन पुराने माउस anesthetize.
  2. 1% atropine सल्फेट समाधान के एक या दो बूँदें (Alcon लैब्स, Inc, फोर्ट वर्थ, टेक्सास) के साथ सामयिक उपचार द्वारा प्रयोगात्मक पशु की दाहिनी आंख की पुतली को चौड़ा करना.
  3. Mydriasis के बाद, एक समतलnterior कक्ष लेजर प्रेरण 6 बढ़ाने के लिए. पूर्वकाल चैम्बर में तरल पदार्थ बाहर निकास के लिए भट्ठा दीपक के नीचे पूर्वकाल अंतरिक्ष (एसएल-3E, Topcon, ओकलैंड, न्यू जर्सी) में तेज टिप (विश्व परिशुद्धता उपकरण इंक, सारासोटा, FL) के साथ एक गिलास micropipette डालें.
  4. एक प्लास्टिक शंकु धारक (ब्रेनट्री विज्ञान इंक, एमए) में माउस को नियंत्रित करना और (चित्रा 1 ए देखें) एक घर का बना मंच पर बांध दिया. Restrainer साथ माउस पकड़ और भट्ठा दीपक के पीछे प्रकाश स्रोत के लिए माउस के दाहिने आंख को उजागर करता है. भट्ठा दीपक के नीचे anesthetized माउस के दाहिने आंख संरेखित करें.
  5. दोनों हाथों से माउस restrainer पकड़े, एक आर्गन लेजर (चरम सीमा 2000SE, सुसंगत, सांता क्लारा, CA) का उपयोग कर कॉर्निया किनारी के लिए लेजर रोशनी लागू होते हैं. लंब के रूप में trabecular meshwork की परिधि के आसपास 80-100 लेजर स्पॉट (514 एनएम, 100 मेगावाट, 50 मिसे नाड़ी, और 200 माइक्रोन स्थान) के बारे में वितरित करें. C57BL 6 / चूहों किसी भी पी के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करता है जो रंजित परितारिका हैotential है आवारा ऊर्जा 7.
  6. टपकाना सामयिक 0.5% moxifloxacin (Alcon लैब्स, Inc, फोर्ट वर्थ, टेक्सास) लेजर इलाज क्षेत्र और 0.5% Proparacaine (बॉश एंड लॉम्ब, रोचेस्टर, NY) के दर्द को दूर कीटाणुरहित आंख की सतह पर.
  7. यह पूरी तरह से जाग होने तक के बारे में एक घंटे के लिए वसूली के लिए एक हीटिंग पैड (सुरज उत्पाद इंक, बोका Raton, FL) पर पशु रखें.
  8. बाईं आंख एक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए इलाज है.

2. IOP माप

  1. प्लास्टिक कोन धारक में लोड और फिर (2A चित्रा देखें) मंच पर इसे नियंत्रित करने के लिए एक ट्यूब में जाग माउस रखें.
  2. पांच से दस मिनट माउस धारक स्थिति के लिए अनुकूलित हो जाओ करने की अनुमति दें. जांच टिप दूर कॉर्निया 14 की सतह से 2-3 मिमी है जब तक माउस आंखों के लिए पलटाव टनमीटर (TonoLab, औपनिवेशिक चिकित्सा आपूर्ति, Franconia, एनएच) दृष्टिकोण.
  3. जांच टिप केंद्र सतह मारा जाने के लिए माप बटन दबाएंधीरे से कॉर्निया. एक ही आंख की IOP के छह माप की लगातार तीन सेट प्राप्त कर लिया और आंख की IOP के रूप में औसत रहे हैं. अनुपचारित नियंत्रण आंख हमेशा अगले मापा जाता है कि लेजर इलाज आंख के लिए एक आधार रेखा पढ़ पाने के लिए पहले मापा जाता है.

3. Optomotor टेस्ट

दृश्य तीक्ष्णता और विपरीत संवेदनशीलता 14,15 जांच की जाती है. व्यक्तिगत चूहों के दो आँखें बहती झंझरी दिशा reversing द्वारा अलग से जांच कर रहे हैं, एक घड़ी की बहती झंझरी बाईं आंख और सही नज़र 16 के लिए एक काउंटर दक्षिणावर्त बहती झंझरी के दृश्य समारोह की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है अर्थात्. प्रत्येक परीक्षा के बारे में 15 मिनट लगते हैं और स्वतंत्र रूप से दो पर्यवेक्षकों द्वारा दोहराया है.

  1. माउस रखें और माउस चार कंप्यूटर मॉनिटर (चित्रा 3 ए बी) से घिरा हुआ एक ऊंचा मंच पर आसानी से ले जाने के लिए अनुमति देते हैं.
  2. वे क्षैतिज sinusoidal बहती प्रदर्शन इतना है कि मॉनिटर सेट अप39 सीडी / 2 मीटर का मतलब luminance के साथ दृश्य उत्तेजनाओं के रूप में जाली. झंझरी के चलते दिशा वैकल्पिक चाहिए लगातार बीच दक्षिणावर्त और counterclockwise.
  3. पशु की गतिविधियों का विश्लेषण. दृश्य उत्तेजना पर है और फिर धीरे - धीरे वृद्धि हुई है के बाद बहती gratings के साथ संगीत कार्यक्रम में पशु के आंदोलनों 15 सेकंड के भीतर "सकारात्मक" माना जाता है. उच्चतम प्रतिक्रिया जानने दृश्य उत्तेजना जानवर दृश्य तीक्ष्णता 17 के रूप में परिभाषित किया गया है.
  4. 0.075, 0.16, और डिग्री प्रति 0.3 चक्र (सीपीडी): तीन पूर्व चयनित स्थानिक आवृत्तियों पर विपरीत संवेदनशीलता की जांच करना. प्रत्येक आंख के लिए इसके विपरीत सीमा पूर्व निश्चित आवृत्ति पर दृश्य प्रतिक्रियाओं elicits कि सबसे कम विपरीत के रूप में परिभाषित किया गया है. इसके विपरीत संवेदनशीलता सीमा 17 से पारस्परिक है.

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Representative Results

जैसा कि प्रक्रियाओं में वर्णित, लेजर रोशनी कोण बंद (चित्रा 1) उत्प्रेरण, जलीय बहिर्वाह photocoagulate को अंगीय क्षेत्र में trabecular meshwork के उद्देश्य से है. हाल lasered आंखों पिछले निष्कर्ष 6 के साथ संगत कोई महत्वपूर्ण शारीरिक क्षति, वर्णक टुकड़ी या संक्रमण, प्रदर्शन किया. चूहों के एक छोटे समूह (सभी lasered जानवरों की कम से कम 5%) ऐसे पिचकाकर आंख गेंदों, गंभीर मोतियाबिंद, महत्वपूर्ण वर्णक टुकड़ी, या खून बह रहा है के रूप में गंभीर क्षति के शारीरिक लक्षण प्रदर्शित करते हैं, हम उन्हें तुरंत euthanized. Lasered आंखों के चारों ओर 30% नाबालिग कॉर्निया का निशान विकसित की है, और उनमें से ज्यादातर 1-2 सप्ताह लेजर उपचार के बाद भीतर बरामद किए.

हम अधिक से अधिक एक सौ चूहों से लगभग हर लेजर इलाज आँखों में बुलंद IOP पाया. प्रायोगिक पशुओं की IOP एक पलटाव टनमीटर (चित्रा 2) के उपयोग पर नजर रखी जाती है. चित्रा 2B मैं के परिवर्तन का एक उदाहरण से पता चलता हैलेजर उपचार के पहले और बाद में ओपी. 15.7 mmHg (दाएं) बनाम 14.7 mmHg (बाएं, 0 दिन, चित्रा 2B): लेजर इलाज से पहले, माउस की दो आंखों के IOP baselines कोई अंतर नहीं दिखाया. लेजर उपचार के बाद सात दिन, इलाज (दाएं) आंख की IOP अनुपचारित आंख (15.7 एमएमएचजी) की तुलना में 30.7 mmHg को लगभग 2 गुना वृद्धि हुई है. लेजर इलाज आंख की IOP के बारे में 4 महीने के लिए 26-28 mmHg में ऊंचा रहा: 4 महीने में उपचार के बाद इलाज आंख का मतलब IOP अनुपचारित बाईं आंख की कि (16.3 एमएमएचजी) की तुलना में काफी अधिक 26 एमएमएचजी, था. इसके बाद इलाज आंख की IOP धीरे कमी आई है और इलाज के बाद 6 महीने (24 सप्ताह) (अनुपचारित आंख: 15.3 एमएमएचजी) में 18.7 mmHg पर पहुंच गया. हमारे आंकड़े निरंतर IOP ऊंचाई से अधिक 4 महीने के लिए हासिल की है कि प्रदर्शित करता है.

हम अगले optomotor परीक्षण (चित्रा 3) का उपयोग दृष्टि हानि की पुष्टि की. कर्मकर्त्ता सिर टीआर माध्यम स्थानिक दृष्टि से optomotor परीक्षण उपायों पहलुओंआंदोलनों acking. चित्रा -3 सी चित्रा 2B में जांच जानवर के दृश्य तीक्ष्णता की कमी को दर्शाता है. लेजर इलाज से पहले, दोनों आँखें (:; राइट 0.375 सीपीडी: 0.397 सीपीडी, चित्रा -3 सी वाम) सामान्य तीक्ष्णता प्रदर्शन किया. दो महीने में लेजर उपचार के बाद, दाहिनी आंख (बुलंद IOP) की तीक्ष्णता काफी बाएं नियंत्रण आँख के साथ तुलना में कमी आई (वाम: 0.45 सीपीडी; अधिकार: 0.228 सीपीडी, चित्रा -3 सी). बुलंद IOP के साथ आंख की तीक्ष्णता (.:;: 0 258 सीपीडी, चित्रा -3 सी राइट 0.378 सीपीडी बाएं) लेजर उपचार के बाद 5-6 महीने में कम रहा. इसी तरह, बुलंद IOP साथ दाहिनी आंख की एक कम विपरीत संवेदनशीलता (चित्रा 3 डी) मनाया गया. दाहिनी आंख 0.075 सीपीडी में 1.91 थी जबकि दो महीने में लेजर उपचार के बाद, नियंत्रण के विपरीत संवेदनशीलता, आंख 6.13 था छोड़ दिया है. दाहिनी आंख 4.28 और 1 था, जबकि नियंत्रण बाईं आंख के विपरीत संवेदनशीलता, 0.16 और 0.3 सीपीडी में 5.53 और 2.67 था.क्रमश: 45, (चित्रा 3 डी).

चित्रा 1
चित्रा 1. माउस आंखों में जलीय हास्य बहिर्वाह की लेजर photocoagulation. लेजर उपचार के लिए भट्ठा दीपक की (ए) एक तस्वीर. ऑपरेटर restrainer साथ माउस रखती है और उसके बाद भट्ठा दीपक. (ईसा पूर्व) योजनाबद्ध ओर देखने और आंख के सामने से देखने के प्रकाश स्रोत के लिए माउस के दाहिने आंख संरेखित करता है. 80-100 लेजर स्पॉट अधिश्वेतपटल सम्बन्धी नसों और फैली हुई शिष्य के बीच क्षेत्र के लिए लागू कर रहे हैं, जबकि ऑपरेटर दोनों हाथों से माउस restrainers रखती है.

चित्रा 2
चित्रा 2. IOP लेजर उपचार के बाद वृद्धि हुई. (ए) सेटअप एक पलटाव टनमीटर उपयोग कर IOP को मापने के लिए. (बी)लेजर उपचार के बाद एक प्रयोगात्मक माउस के IOP के परिवर्तन. प्रत्येक बिंदु IOP के छह माप की लगातार तीन सेट का औसत है.

चित्रा 3
चित्रा 3. IOP ऊंचाई के साथ दृश्य तीक्ष्णता और विपरीत संवेदनशीलता से कम हो जाती है. Optomotor सेटअप के (ए) योजनाबद्ध ड्राइंग. (बी) के चार आसपास के मॉनिटर पर प्रदर्शित gratings के साथ optomotor तंत्र में केंद्र मंच पर एक माउस. (सी) तीक्ष्णता और विपरीत संवेदनशीलता माउस का चित्रा 2B में जांच की.

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Discussion

हम जानते हैं कि निरंतर आंख का उच्च रक्तचाप से ऊपर रिपोर्ट माउस आँखों में लेजर रोशनी द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. खारा इंजेक्शन मॉडल 18 और नस दाग़ना मॉडल व्यापक microsurgical कौशल की आवश्यकता होती है, जो दोनों के 11 की तुलना में, लेजर रोशनी प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल और आसान है. आम तौर पर हम 2-3 घंटे में 4-6 चूहों के लिए लेजर रोशनी प्रदर्शन कर सकते हैं. निरंतर IOP ऊंचाई हासिल करने के लिए महत्वपूर्ण कदम लेजर रोशनी के लिए लेजर और मापदंडों से पहले सपाट पूर्वकाल कक्ष हैं. Trabecular meshwork के क्षेत्र के लिए लेजर लक्ष्य और आसपास के सिलिअरी शरीर और रक्त वाहिकाओं 6 से चोट को कम करने में मदद की पूर्वकाल चैम्बर में तरल पदार्थ बाहर draining. लेजर के विभिन्न प्रकार के भी सूचित किया गया है, उदाहरण के लिए, कुछ अध्ययनों अंगीय reg में trabecular meshwork के और अधिश्वेतपटल सम्बन्धी नसों को लक्षित करने के लिए 810 एनएम ऊर्जा दालों 7 इस्तेमाल किया 532 एनएम 5,6 और दूसरों की तरंग दैर्ध्य के साथ एक डायोड लेजर का इस्तेमाल कियाआयन. कोण क्षति को अधिकतम करने के लिए, हम 5-7 पहले की रिपोर्ट लेजर मॉडल की तुलना लेजर स्पॉट की संख्या में वृद्धि हुई है. हमारे प्रयोगात्मक सेटअप के साथ, लगभग हर लेजर इलाज माउस के बारे में 60% से अधिक 2 महीने के लिए IOP बुलंद किया था, जो बीच में लेजर उपचार के बाद पहले सप्ताह से IOP के 50% से अधिक वृद्धि की गई थी. इसके विपरीत, माउस आँखों में microbeads की एक intraocular इंजेक्शन एक दो सप्ताह 8 (एक अन्य अध्ययन IOP ऊंचाई 9,10 के एक लंबे समय तक प्रभाव का सुझाव दिया है) के लिए IOP में एक ~ 30% ऊंचाई, और सूरजमुखी मनुष्य में अंगीय और अधिश्वेतपटल सम्बन्धी नसों का रोड़ा बटोर कर सकते हैं सीडी 1 चूहों केवल कुछ ही दिनों 13 के लिए एक तीव्र IOP ऊंचाई प्रेरित किया.

IOP के सही माप माउस आँखों पर लेजर प्रभाव का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है. संज्ञाहरण काफी IOP माप और चूहों के व्यवहार प्रशिक्षण जाग जानवरों 9,19 में कम IOP भिन्नता बदल दिया. इधर, प्रायोगिक पशुओं जी थेIOP के अनुरूप रीडिंग पाने के लिए माप से पहले आराम और संयमित स्थिति के लिए अनुकूल करने के लिए कुछ मिनट iven. IOP माप विश्वसनीय और परीक्षण किया है जो व्यक्ति पर निर्भर नहीं है, पुष्टि करने के लिए, एक ही जानवरों के दो या तीन अलग परीक्षकों और IOP रीडिंग से अपने मतभेदों को 5-15% के भीतर आम तौर पर कर रहे हैं द्वारा जांच की गई.

क्योंकि अवधि और IOP ऊंचाई की डिग्री की परिवर्तनशीलता की, विभिन्न RGC हानि विभिन्न पशु मॉडल में सूचित किया गया है. उदाहरण के लिए, axons की एक 20% नुकसान microbeads इंजेक्शन 8 के साथ माउस आँखों में देखा गया है. RGCs के 60% के आसपास trabecular meshwork के और अधिश्वेतपटल सम्बन्धी नसों 5 दोनों पर लेजर रोशनी के साथ मौत हो गई, जबकि RGCs के 20% के आसपास, trabecular meshwork में लेजर रोशनी के बाद छह सप्ताह में चूहे की आँखों में निधन हो गया. हमारे आंकड़े माउस आँखों में लेजर उपचार के बाद 2 महीने में RGC नुकसान की एक 20-30% दिखाया. पुरानी ओ की फिर भी, इन सभी विभिन्न पशु मॉडलमहत्वपूर्ण सूजन या आंखों के अन्य भागों को नुकसान के बिना cular उच्च रक्तचाप हमें समय के साथ रेटिना संरचना और दृश्य समारोह पर आंख का उच्च रक्तचाप की लंबी अवधि के प्रभाव को मापने के लिए क्षमता प्रदान करते हैं.

बदलती परिस्थितियों के एक समारोह के रूप में धारावाहिक परीक्षण की अनुमति देता है कि दृश्य व्यवहार परख की गैर इनवेसिव प्रकृति का लाभ उठाते हुए, दृश्य तीक्ष्णता और विपरीत संवेदनशीलता के परिवर्तन आंख का उच्च रक्तचाप के शामिल होने के बाद महीनों के लिए नजर रखी जा सकती है. optomotor परीक्षण दृश्य समारोह की एक तेजी से मूल्यांकन प्रदान करता है, इसके अलावा, दो आंखें लक्ष्य माउस की एक आंख लेजर इलाज किया है और अन्य नियंत्रण के रूप में बरकरार रह गया है, क्योंकि बहुत से हमारी प्रयोगों की सुविधा है, जो अलग से परीक्षण किया जा सकता है. उसी समय, यह optomotor पलटा कभी कभी उच्च गतिविधि और कुछ चूहों 12 से भटक ध्यान की वजह से उपयोग करने के लिए मुश्किल है कि उल्लेख किया है.

माउस geneti की शक्ति के साथ संयुक्तसीएस, हमारे मॉडल उच्च तनाव मोतियाबिंद में रोग तंत्र की जांच के लिए जो के साथ एक शानदार readout प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, तेरा-1-YFP ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग, जो 10,20-22 लेबल RGCs की एक छोटी संख्या है, व्यक्तिगत RGCs के वृक्ष के समान संरचनात्मक परिवर्तन निरंतर आंख का उच्च रक्तचाप के साथ आंखों में imaged किया जा सकता है. हम RGCs के वृक्ष के समान अध: पतन आंख का उच्च रक्तचाप से ग्रस्त आंखों 23 में स्थान और उपप्रकार पर निर्भर करता है कि प्रदर्शन किया है. सेल apoptosis या न्यूरोप्रोटेक्टिव संकेत दे रास्ते आगे RGC अध: पतन और मोतियाबिंद में अस्तित्व की अंतर्निहित आणविक तंत्र की पहचान करने के लिए vivo में हेरफेर किया जा सकता.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

लेखकों नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय के पूर्णकालिक कर्मचारी हैं.

लेखक इस लेख में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों और उपकरणों का उत्पादन जो कंपनियों द्वारा प्रदान की गई थी कि कोई धन प्राप्त किया.

Acknowledgments

इस पत्र में निहित काम अमेरिकी स्वास्थ्य सहायता फाउंडेशन (एक्स्ट्रा लार्ज), दृष्टिहीनता को रोकने के लिए अनुसंधान से विलियम एंड मैरी ग्रीव विशेष विद्वान पुरस्कार (एक्स्ट्रा लार्ज), से रोग अनुसंधान के लिए डॉ. डग्लस एच. जॉनसन पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया है दृष्टिहीनता की रोकथाम के लिए इलिनोइस सोसायटी (एचसी) और NIH अनुदान R01EY019034 (एक्स्ट्रा लार्ज).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
moxifloxacin Alcon Labs, Inc. NDC 0065-4013-03 0.5 %, Rx only
Proparacaine Hydrochloride Bausch Lomb NDC 24208-730-06 0.5 %, Rx only
Ophthalmic Solution USP Bausch Lomb NDC 24208-730-06 .5 %, Rx only
ketamine Butler Schein Animal Health NDC 11695-0550-1 100 mg / kg
xylazine LLOYD Inc. of Iowa NADA 139-236 10 mg / kg
atropine sulfate solution Alcon Labs, Inc. NDC 61314-303-02 1 %, Rx only
Equipment
Slit Lamp, TOPCON Visual Systems Inc SL-3E powered by PS-30A
OptoMotry 1.8.0 virtual CerebralMechanics Inc.
opto-kinetic testing system CerebralMechanics Inc.
Tonometer, TonoLab, for mice Colonial Medical Supply
Heating pad Sunbeam Products Inc 722-810
Argon laser Coherent Inc Ultima 2000SE
DECAPICONE Plastic cone holder Braintree Sci Inc. MDC-200 for mouse

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References

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Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects. J. Vis. Exp. (78), e50440, doi:10.3791/50440 (2013).

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