Summary
Kronisk okulær hypertension fremkaldes ved hjælp laserfotokoagulation af trabekelværket i muse øjne. Det intraokulære tryk (IOP) er forhøjet i flere måneder efter laserbehandling. Faldet af visuel skarphed og kontrast følsomhed forsøgsdyr overvåges ved hjælp af optomotor testen.
Abstract
Glaukom, ofte forbundet med forhøjet intraokulært tryk (IOP), er en af de førende årsager til blindhed. Vi søgte at etablere en musemodel af okulær hypertension at efterligne human højspænding glaukom. Her laserbelysning påføres hornhindens limbus at photocoagulate den vandige udstrømning, inducere nævervinklet. Ændringerne i IOP overvåges ved hjælp af en rebound tonometer før og efter laserbehandlingen. En optomotor adfærdsmæssige test anvendes til at måle tilsvarende ændringer i visuel kapacitet. Den repræsentativt resultat fra en mus, der udviklede vedvarende IOP elevation efter laserbelysning vises. En nedsat synsstyrke og kontrast følsomhed er observeret i denne okular hypertensive mus. Sammen vores undersøgelse indfører en værdifuld modelsystem til at undersøge neuronal degeneration og de underliggende molekylære mekanismer i glaucomatøse mus.
Protocol
Procedurer
C57BL/6J-mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) er rejst ved Northwestern University Animal Care Facility. Alle dyr anvendes i overensstemmelse med protokoller godkendt af Northwestern University Institutional Animal Care og brug Udvalg og efterleves retningslinjerne for brugen af dyr i Neuroscience Research fra NIH.
1.. Laserfotokoagulation
Proceduren ifølge laserfotokoagulation er modificeret fra tidligere publicerede protokoller 5-7.
- Bedøver en 40-60 dage gammel mus med en intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg / kg, Butler Schein Dyresundhed OH) og xylazin (10 mg / kg, Lloyd Inc. of Iowa, Shenandoah, IA).
- Dilate pupillen i højre øje af forsøgsdyret ved topisk behandling med en eller to dråber 1% atropinsulfat opløsning (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX).
- Efter mydriasis, flade anterior kammer for at øge laser induktion 6.. Indsæt et glasmikropipette med skarp spids (World Precision Instruments Inc, Sarasota, FL) ind i det forreste rum under spaltelampe (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ) for at tømme væsken ud i forkammeret.
- Begrænse musen i en plastik kegle holder (Braintree Sci Inc., MA) og bundet op på en hjemmelavet platform (se figur 1A). Hold musen med harpiksstopperen og udsætter det højre øje af musen til lyskilden bag spaltelampe. Ret højre øje bedøvede mus under spaltelampe.
- Mens du holder musen restrainer med begge hænder, anvende laserbelysning til hornhindens limbus hjælp af en Argon laser (Ultima 2000SE, Sammenhængende, Santa Clara, CA). Levere omkring 80-100 laser spots (514 nm, 100 mW, 50 msek puls og 200 um spot) vinkelret omkring omkredsen af trabekelværket. De C57BL / 6 mus har pigmenteret iris, som fungerer som en barriere for enhver pOTENTIELLE omstrejfende energi 7..
- Instill topisk 0,5% moxifloxacin (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX) på øjets overflade for at desinficere laser-behandlede område og 0,5% proparacain (Bausch & Lomb, Rochester, NY) for at lindre smerter.
- Hold dyr på en varmepude (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) til nyttiggørelse i omkring en time, indtil det er helt vågen.
- Det venstre øje er ubehandlet for at tjene som en kontrol.
2.. IOP Målinger
- Placer vågen musen ind i et rør for at indlæse i Plastskålen holderen og derefter begrænse det på den platform (se figur 2A).
- Tillad fem til ti minutter for at lade musen tilvænnes til indehaveren position. Approach rebound tonometer (TonoLab, Colonial Medical Supply, Franconia, NH) til musen øjet indtil probespidsen er 2-3 mm væk fra overfladen af hornhinden 14.
- Tryk målingen for at lade sondespidsen ramte centrum overfladeaf hornhinden forsigtigt. Tre på hinanden følgende sæt af seks målinger af IOP i det samme øje er erhvervet og gennemsnittet som IOP i øjet. Den ubehandlede kontrolgruppe øje måles altid først at få en baseline læsning for laser-behandlede øje, der er målt siden.
3.. Optomotor Test
Synsstyrke og kontrast følsomhed testes 14,15. De to øjne individuelle mus undersøges separat ved at vende den drivende rist retning, dvs uret drivende gitter anvendes til at identificere den visuelle funktion af venstre øje og en mod uret drivende rist til højre øje 16. Hver test tager omkring 15 minutter og er gentaget af to observatører uafhængigt.
- Placer musen og tillade musen til at bevæge sig frit på en forhøjet platform, omgivet af fire computerskærme (fig. 3A-B).
- Opsætning af skærme, så de viser vandret drivende sinusformetriste som visuelle stimuli med en gennemsnitlig luminans på 39 cd / m 2. Den bevægelige retning af gitteret bør alternere konsekutivt mellem med og mod uret.
- Analyser dyrets bevægelser. Dyrets bevægelser i-koncert med drivende riste betragtes som "positive" inden for 15 sekunder efter den visuelle stimulus er tændt, og derefter gradvist øges. Den højeste respons-fremkalde visuelle stimulus er defineret som dyrets synsstyrke 17.
- Undersøg kontrasten følsomhed ved tre forudvalgte rumfrekvenser: 0,075, 0,16 og 0,3 cyklusser per grad (CPD). Kontrasten tærsklen for hvert øje er defineret som den laveste kontrast, der fremkalder visuelle svar på forhånd fast frekvens. Kontrasten følsomhed er det reciprokke af tærsklen 17..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrevet i procedurerne, er laserbelysning rettet mod trabekelværket i limbal regionen til photocoagulate den vandige udstrømning, overtalelse vinkelblokglaukom (Figur 1). De fleste laserbehandlet øjne udviste ingen signifikant fysiske skader, pigment løsrivelse eller infektion, i overensstemmelse med tidligere fund 6.. Når en lille gruppe af mus (mindre end 5% af alle laserbehandlet dyr) udviste fysiske tegn på alvorlige skader såsom deflateret øje bolde, svær grå stær, betydelig pigment løsrivelse, eller blødning, vi aflivet dem straks. Omkring 30% af laserbehandlet øjne udviklede mindre hornhinde ar, og de fleste af dem i løbet af 1-2 uger efter laserbehandling.
Vi fandt forhøjet IOP i næsten hver laser-behandlede øjne fra mere end hundrede mus. IOP af forsøgsdyr overvåges ved hjælp af en rebound tonometer (Figur 2). Figur 2B viser et eksempel på de ændringer i IOP før og efter laserbehandlingen. Før laserbehandling viste IOP basislinje de to øjne mus ingen forskel: 15,7 mmHg (højre) vs 14,7 mmHg (venstre, Dag 0, figur 2B). Syv dage efter laser-behandling steg IOP den behandlede (højre) øje næsten 2-fold til 30,7 mmHg sammenlignet med det ubehandlede øje (15,7 mmHg). Den IOP laser-behandlet øje forblev forhøjede ved 26-28 mmHg for omkring 4 måneder: i 4 måneder efter behandlingen var den gennemsnitlige IOP af behandlede øje 26 mmHg, hvilket er betydeligt højere end for ubehandlet venstre øje (16,3 mmHg). Efterfølgende IOP af det behandlede øje faldet langsomt og nåede 18,7 mmHg ved 6 måneder (24 uger) efter behandling (ubehandlet øjet: 15,3 mmHg). Vores data viser, at vedvarende IOP højde er opnået i mere end 4 måneder.
Vi næste bekræftede synstab vha. optomotor prøve (figur 3). De optomotor test måler aspekter af rumlig vision via refleksive head-tracking bevægelser. Figur 3C viser fald i synsstyrke dyret undersøgt i figur 2B. Før laser-behandling, udviste begge øjne normal skarphed (Venstre: 0,375 CPD, højre: 0,397 cpd; figur 3C). På to måneder efter laserbehandling, den skarphed i det højre øje (forhøjet IOP) faldt betydeligt i forhold til den venstre kontrol øjet (Venstre: 0,45 CPD, højre: 0,228 cpd; figur 3C). Den skarphed i øjet med forhøjet IOP forblev lav på 5-6 måneder efter laser behandling (Venstre: 0.378 CPD, højre:. 0 258 cpd, figur 3C). Tilsvarende blev en lavere kontrast følsomhed i højre øje med forhøjet IOP observeret (figur 3D). På to måneder efter laserbehandling, forlod kontrasten følsomhed kontrol øje var 6.13, mens den højre øje var 1,91 på 0.075 byggevaredirektivet. Kontrasten følsomhed kontrol venstre øje var 5,53 og 2,67 på 0,16 og 0,3 CPD, mens det højre øje var 4,28 og 1.45, (figur 3D).
Figur 1. Laserfotokoagulation af den vandige humor udstrømning i muse øjne. (A) Et foto af spaltelampe for laserbehandling. Operatøren holder musen med harpiksstopperen og derefter justerer det højre øje af musen til lyskilden af spaltelampe. (BC) Skematisk sideperspektiv og forfra af øjet. Operatøren holder musen restrainers med begge hænder, mens 80-100 laser pletter påføres området mellem episclerale vener og forstørrede elev.
Figur 2. IOP steg efter laserbehandling. (A) Opsætningen til at måle IOP ved hjælp af en rebound tonometer. (B)Ændringer i IOP i en eksperimentel mus efter laserbehandling. Hvert punkt er gennemsnittet af tre på hinanden følgende sæt af seks målinger af IOP.
Figur 3. Fald i synsskarphed og kontrast følsomhed med IOP elevation. (A) Skematisk tegning af optomotor setup. (B) En mus på midten platform i optomotor apparat med riste vises på fire omkringliggende skærme. (C) Den skarphed og kontrast følsomhed af mus behandlet i figur 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterer over at vedvarende okulær hypertension kan induceres ved laserbelysning i muse øjne. Sammenlignet med saltvand injektion model 18 og venen cautery model 11 begge kræver omfattende mikrokirurgiske færdigheder er laserbelysning forholdsvis enkel og let at udføre. Normalt kan vi udføre laserbelysning til 4-6 mus i 2-3 timer. De kritiske skridt til at opnå vedvarende IOP elevation er forkammeret udfladning før laser og parametrene for laserbelysning. Tømning væsken ud i forkammeret lettes at målrette laseren til trabekelværket området og minimere skade på nærliggende ciliære legeme og blodkar 6.. Forskellige typer af laser er også rapporteret, for eksempel brugte nogle undersøgelser en diode laser med bølgelængde på 532 nm 5,6 og andre brugte 810 nm energi pulser 7 at målrette trabekelværket og episclerale vener i limbal region. For at maksimere den vinkel skader, har vi øget antallet af laser pletter i forhold til de tidligere rapporterede laser modeller 5-7. Med vores forsøgsopstilling, havde næsten hver laser-behandlet mus mere end 50% stigning i IOP ved den første uge efter laserbehandling, blandt hvilke omkring 60% havde forhøjet IOP i mere end 2 måneder. Derimod kan en intraokulær injektion af mikroperler i mus øjne fremkalde en ~ 30% forhøjelse i IOP for et par uger 8 (anden undersøgelse foreslog en længere virkning af IOP elevation 9,10), og okklusion af limbal og episcleral vener i albino CD-1-mus kun inducerede en akut IOP elevation for et par dage 13..
Nøjagtig måling af IOP er vigtig i fastlæggelsen laser effekter på mus øjne. Anæstesi signifikant ændret IOP måling og adfærdsmæssige uddannelse af mus reduceret IOP variation i vågen dyr 9,19. Her er de forsøgsdyr blev given et par minutter for at hvile og tilpasse sig tilbageholdende position før måling for at få konsistente aflæsninger af IOP. For at bekræfte IOP målingen er pålidelig og ikke afhængig af den person, der udførte testen blev de samme dyr undersøgt af to eller tre forskellige testere og deres forskelligheder i IOP aflæsninger er generelt inden for 5-15%.
På grund af variabilitet af varigheden og graden af IOP elevation, har forskellig RGC tab blevet rapporteret i forskellige dyremodeller. For eksempel har en 20% tab af axoner blevet observeret i mus øjne med mikroperler injektion 8. Omkring 20% af rGCS døde i rotte øjne på seks uger laserbelysning på trabekelværket, mens omkring 60% af rGCS døde med laserbelysning både trabekelværket og episclerale vener 5. Vores data viste en 20-30% af RGC tab på 2 måneder efter laserbehandling i muse øjne. Alligevel alle disse forskellige dyremodeller for kroniske ocular hypertension uden betydelig inflammation eller skade på andre dele af øjnene giver os mulighed for at måle de langsigtede effekter af okulær hypertension på retinal struktur og visuel funktion over tid.
Drage fordel af den ikke-invasive karakter af den visuelle adfærdsmæssige assay, der tillader serielle test som en funktion af skiftende betingelser, kan ændringer i visuel skarphed og kontrast følsomhed monitoreres for måneder efter induktionen af okulær hypertension. Den optomotor test giver en hurtig vurdering af visuel funktion, og desuden kan de to øjne testes separat, hvilket i høj grad letter vores eksperimenter, fordi det ene øje af målet mus er laser-behandlede og den anden efterlades intakt som kontrollen. Samtidig skal det bemærkes, at optomotor refleks undertiden er vanskeligt at bruge på grund af den høje aktivitet og vandrer opmærksomhed af nogle mus 12.
Kombineret med magt muse genetiskcs, vores model giver en fantastisk udlæsning med til at undersøge de patologiske mekanismer i high-tension glaukom. For eksempel, ved hjælp af Thy-1-YFP transgene mus, som har et lille antal af rGCS mærket 10,20-22, kan de dendritiske strukturelle ændringer af individuelle rGCS afbildes i øjnene med vedvarende okulær hypertension. Vi har vist, at den dendritiske degenerering af rGCS afhænger placering og undertyper i okulære hypertensive øjne 23. Celleapoptose eller neurobeskyttende signalveje kan yderligere manipuleres in vivo til at identificere de underliggende molekylære mekanismer i RGC degeneration og overlevelse i glaukom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Forfatterne er fuldtidsansatte i Northwestern University.
Forfatterne modtaget nogen finansiering, som blev leveret af virksomheder, der producerer reagenser og instrumenter, der anvendes i denne artikel.
Acknowledgments
Det arbejde, der er indeholdt i dette papir er blevet støttet af Dr. Douglas H. Johnson Award for Glaukom Research fra det amerikanske Health Assistance Foundation (XL), William & Mary Greve Special Scholar Award fra forskning for at forebygge blindhed (XL), den Illinois Society for forebyggelse af blindhed (HC) og NIH tilskud R01EY019034 (XL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| moxifloxacin | Alcon Labs, Inc. | NDC 0065-4013-03 | 0.5 %, Rx only |
| Proparacaine Hydrochloride | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | 0.5 %, Rx only |
| Ophthalmic Solution USP | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | .5 %, Rx only |
| ketamine | Butler Schein Animal Health | NDC 11695-0550-1 | 100 mg / kg |
| xylazine | LLOYD Inc. of Iowa | NADA 139-236 | 10 mg / kg |
| atropine sulfate solution | Alcon Labs, Inc. | NDC 61314-303-02 | 1 %, Rx only |
| Equipment | |||
| Slit Lamp, TOPCON | Visual Systems Inc | SL-3E | powered by PS-30A |
| OptoMotry 1.8.0 virtual | CerebralMechanics Inc. | ||
| opto-kinetic testing system | CerebralMechanics Inc. | ||
| Tonometer, TonoLab, for mice | Colonial Medical Supply | ||
| Heating pad | Sunbeam Products Inc | 722-810 | |
| Argon laser | Coherent Inc | Ultima 2000SE | |
| DECAPICONE Plastic cone holder | Braintree Sci Inc. | MDC-200 | for mouse |
References
- Gupta, N., Yucel, Y. H. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr. Opin. Ophthalmol. 18, 110-114 (2007).
- Quigley, H. A. Neuronal death in glaucoma. Prog. Retin. Eye Res. 18, 39-57 (1999).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, 816-824 (2009).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. J. Glaucoma. 16, 483-505 (2007).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 402-410 (2002).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 4314-4320 (2003).
- Grozdanic, S. D. Laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4337-4346 (2003).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative ophthalmology & visual science. 51, 207-216 (2010).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Experimental Eye Research. 92, 512-520 (2011).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3847-3857 (2012).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61, 379-382 (1995).
- Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. J. Vis. Exp. (10), e549 (2007).
- Fu, C. T., Sretavan, D. Laser-induced ocular hypertension in albino CD-1 mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 980-990 (2010).
- Rangarajan, K. V. Detection of visual deficits in aging DBA/2J mice by two behavioral assays. Curr. Eye Res. 36, 481-491 (2011).
- Wang, L., et al. Direction-specific disruption of subcortical visual behavior and receptive fields in mice lacking the beta2 subunit of nicotinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 29, 12909-12918 (2009).
- Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22, 677-684 (2005).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 4611-4616 (2004).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64, 85-96 (1997).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 99, 27-35 (2012).
- Liu, X., et al. Brain-derived neurotrophic factor and TrkB modulate visual experience-dependent refinement of neuronal pathways in retina. J. Neurosci. 27, 7256-7267 (2007).
- Liu, X., et al. Regulation of neonatal development of retinal ganglion cell dendrites by neurotrophin-3 overexpression. The Journal of Comparative Neurology. 514, 449-458 (2009).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. The Journal of Comparative Neurology. 451, 115-126 (2002).
- Feng, L., et al. Sustained Ocular Hypertension Induces Dendritic Degeneration of Mouse Retinal Ganglion Cells that Depends on Cell-type and Location. Investigative Ophthalmology & Visual Science. , (2013).
