Summary
Kronik oküler hipertansiyon fare gözünde Trabeküler ağın laser kullanılarak meydana gelir. Göz içi basıncı (GİB) lazer tedavi sonrası birkaç ay boyunca yükselir. Görme keskinliği ve Deney hayvanlarının kontrast duyarlılık azalması optomotor testi kullanılarak izlenir.
Abstract
Sık sık yüksek göz içi basıncı (GİB) ile ilişkili Glokom, körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Biz insan yüksek gerilim glokom taklit etmek oküler hipertansiyon bir fare modeli kurmak için çalıştı. Burada, lazer aydınlatma açı kapanması neden olan, sulu bir çıkış photocoagulate için kornea limbusa uygulanır. GİB değişiklikler lazer tedavi öncesi ve sonrası bir canlanma tonometre ile izlenmektedir. Bir optomotor davranış testi görsel kapasitesi karşılık gelen değişiklikleri ölçmek için kullanılır. Lazer aydınlatma sonra sürekli GİB yükselmesi geliştirilen bir fare temsilcisi sonucu gösterilir. Bir azalmış görme keskinliği ve kontrast duyarlılık bu göz hipertansif fare görülmektedir. Birlikte, Çalışmamızda glokom farelerde nöronal dejenerasyon ve altta yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için değerli bir model sistem tanıttı.
Protocol
Prosedürleri
C57BL/6J fareler (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) Northwestern Üniversitesi Hayvan Bakım Tesisi'nde yetiştirilir. Tüm hayvanlar Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu ve NIH Neuroscience Araştırma Hayvanların Kullanımı kurallara conformed tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde kullanılır.
1. Lazer Fotokoagülasyon
Lazer fotokoagülasyon işlemi 5-7 daha önce yayınlanmış protokollerden değiştirilir.
- Ketamin (100 mg / kg, Butler, Schein Hayvan Sağlığı, OH) ve ksilazin (Iowa Shenandoah, 10 mg / kg 'Lloyd, Inc IA) bir intraperitoneal enjeksiyon sureti ile bir 40-60 günlük fareden anestezisi.
- % 1 atropin sülfat çözeltisi bir ya da iki damlası (Alcon Labs, Inc, Fort Worth, TX) ile topikal tedavi, deney hayvanın sağ gözün gözbebeğinin genişler.
- Midriyazis sonra, bir dümdüznterior odası lazer indüksiyon 6 artırmak için. Ön kamarada sıvı dışarı boşaltmak için yarık lamba altında ön alan (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ) içine sivri ucu (Dünya Hassas Aletler A.Ş., Sarasota, FL) ile bir cam mikropipet takın.
- Plastik bir koni tutucu (Braintree Bilim Inc, MA) fare dizginlemek ve (Şekil 1A bak) bir ev yapımı platformda bağladı. Süzgeç ile fare tutun ve yarık lamba arkasında ışık kaynağı için farenin sağ gözü ortaya çıkarır. Yarık lamba altında anestezi farenin sağ gözü aynı hizaya getirin.
- Iki elinizle fare süzgeç tutarken, bir Argon lazer (Ultima 2000SE, Tutarlı, Santa Clara, CA) kullanılarak kornea limbus için lazer aydınlatma geçerlidir. Dik Trabeküler ağın çevresi 80-100 lazer noktalar (514 nm, 100 mW, 50 msn darbe ve 200 mikron nokta) hakkında sunun. C57BL / 6 fareler herhangi bir p için bir bariyer görevi görür pigmente iris vardurumundaki potansiyel başıboş enerji 7.
- Aşılamak topikal% 0.5 moksifloksasin (Alcon Labs, Inc, Fort Worth, Teksas) lazer ile tedavi edilen alan ve% 0.5 proparakain (Bausch & Lomb, Rochester, NY) ağrı gidermek için dezenfekte oküler yüzey üzerinde.
- Tamamen uyanık kadar yaklaşık bir saat için kurtarma için bir ısıtma yastığı (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) üzerinde hayvan tutun.
- Sol göz bir kontrol olarak hizmet tedavi edilmediğinde.
2. GİB Ölçümler
- Plastik huni tutacağı yüklemek ve daha sonra (Bkz. Şekil 2A) platformu üzerinde dizginlemek için bir tüp içine uyanık fare yerleştirin.
- Beş ila on dakika fareyi sahibi konumuna adapte izin izin verin. Prob ucu uzak kornea 14 yüzeyinden 2-3 mm kadar fare göze ribaund tonometre (TonoLab, Colonial Tıbbi Malzeme, Franconia, NH) yaklaşım.
- Prob ucu merkezi yüzeye vurmak izin ölçüm düğmesine basınhafifçe kornea. Aynı gözün GİB altı ölçümleri üç ardışık takımı satın aldı ve gözün GİB olarak ortalaması alınır. Tedavi edilmeyen kontrol göz her zaman yanında ölçülür lazer ile tedavi edilen göz için bir temel okuma almak için ilk ölçülür.
3. Optomotor Testi
Görme keskinliği ve kontrast duyarlılık 14,15 test edilir. Bireysel farelerin iki göz sürüklenen ızgara yönünü ters çevirerek ayrı ayrı incelenir, bir saat sürüklenen ızgara, sol göz ve sağ göz 16 için saat yönünün tersine sürüklenen ızgara görme fonksiyonu tanımlamak için kullanılır yani. Her test yaklaşık 15 dakika sürer ve bağımsız iki gözlemci tarafından tekrarlanır.
- Fare yerleştirin ve fare dört bilgisayar monitörleri (Şekil 3A-B) ile çevrili yüksek bir platformda serbestçe hareket etmesine izin verir.
- Onlar yatay sinüs sürüklenen göstergesi böylece monitör kurmak39 cd / m 2 ortalama parlaklık ile görsel uyaranlara olarak kafesler. Izgara hareket yönü dönüşümlü olmalıdır ardışık arasında saat yönünde ve saat yönünün tersine.
- Hayvanın hareketlerini analiz edin. Görsel uyaran üzerinde ve sonra yavaş yavaş artan sonra sürüklenen ızgaralar ile uyum içinde hayvanın hareketleri 15 saniye içinde "pozitif" olarak kabul edilir. En yüksek tepki ortaya çıkarmak görsel uyaran hayvanın görme keskinliği 17 olarak tanımlanır.
- 0.075, 0.16, ve derece başına 0.3 devir (dd): Üç önceden seçilmiş mekansal frekanslarda kontrast duyarlılık inceleyin. Her bir göz için kontrast eşiği önceden belirlenmiş sabit bir frekansta görsel yanıtları ortaya çıkarır en düşük kontrast olarak tanımlanır. Kontrast duyarlılık eşiği 17 tersidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gibi prosedürler tarif, lazer aydınlatma açı kapanması (Şekil 1) uyaran, sulu çıkış photocoagulate için limbal bölgede trabeküler ağ hedefleniyor. En Lazerli göz önceki bulgularla 6 tutarlı anlamlı fiziksel hasar, pigment dekolmanı ya da enfeksiyon, sergiledi. Farelerin küçük bir grup (tüm Lazerli hayvanların% 5'inden az) gibi sönük göz topları, ağır katarakt, önemli pigment dekolmanı veya kanama gibi ciddi hasar fiziksel belirtileri sergiledi, biz hemen onları ötenazi. Lazerli gözlerin yaklaşık% 30 küçük kornea izleri geliştirilen ve çoğu 1-2 hafta lazer tedavisi sonrası içinde iyileşti.
Biz yüzden fazla farelerden alınan hemen her lazer ile tedavi edilen gözlerde yüksek GİB bulundu. Deney hayvanlarının GİB bir canlanma tonometre (Şekil 2) kullanılarak izlenir. Şekil 2B I değişikliklerin bir örnek gösterirLazer tedavisi öncesi ve sonrası OP. 15.7 mmHg (sağ) vs 14.7 mmHg (sol, Gün 0, Şekil 2B): lazer tedavisi önce, fare iki göz GİB taban fark gösterdi. Lazer tedavisi sonrası yedi gün, tedavi (sağ) gözün GİB işlenmemiş göz (15.7 mmHg) göre, 30,7 mmHg neredeyse 2 kat artmıştır. Lazer ile tedavi edilen göz GİB yaklaşık 4 ay boyunca 26-28 mmHg yüksek kalmıştır: 4 ay tedaviden sonra, tedavi göz ortalama GİB tedavi edilmezse göz olduğunu (16.3 mmHg) göre anlamlı derecede yüksek 26 mmHg idi. Daha sonra, tedavi gözün GİB yavaş yavaş azalmış ve tedavi sonrası 6 ay (24 hafta) (işlenmemiş göz: 15.3 mmHg) 18.7 mmHg ulaştı. Bizim verilerimiz sürekli GİB artışı fazla 4 ay için elde edilir olduğunu göstermektedir.
Gelecek optomotor testi (Şekil 3) kullanarak görme kaybı doğruladı. Dönüşlü baş-tr ile mekansal görme optomotor test ölçüleri yönlerihareketleri acking. Şekil 3C Şekil 2B incelenen hayvanın görme azalması gösterir. Lazer tedavi öncesi, her iki gözde (:; Sağ 0.375 dd: 0,397 cpd; Şekil 3C Sol) Normal keskinliği sergiledi. İki ayda lazer tedavisi sonrası, sağ göz (yüksek GİB) ve keskinliği önemli ölçüde sol kontrol göz göre azalış (Sol: 0.45 cpd; Sağ: 0,228 cpd; Şekil 3C). Yüksek GİB ile gözün keskinliği (.:;: 0 258 cpd; Şekil 3C Sağ 0,378 cpd Sol) lazer tedavisi sonrası 5-6 ay düşük kalmıştır. Benzer şekilde, yüksek GİB ile sağ göz daha düşük bir kontrast duyarlılık (Şekil 3D) gözlenmiştir. Sağ göz 0.075 cpd de 1.91 iken iki ay lazer tedavisi sonrası, kontrol kontrast duyarlılık, göz 6.13 oldu bıraktı. Sağ göz 4.28 ve 1 iken kontrol sol gözün kontrast duyarlılık, 0.16 ve 0.3 cpd de 5.53 ve 2.67 oldu.Sırasıyla 45, (Şekil 3D).
Şekil 1. Fare gözünde sulu mizah çıkışı laser. Lazer tedavisi için yarık lamba (A) bir fotoğraf. Operatör süzgeç ile fare tutan ve daha sonra yarık lamba. (BC) şematik yan görünüm ve göz önünde-bakış ışık kaynağına fare sağ göz hizalar. 80-100 lazer noktalar episkleral damarlar ve dilate öğrenci arasındaki bölgeye uygulanır ise operatör iki elinizle fare restrainers tutar.
Şekil 2. GİB lazer tedavisi sonrası arttı. (A) Kurulum bir canlanma tonometre ile GİB ölçmek için. (B)Lazer tedavisi sonrası bir deney fare GİB değişiklikler. Her nokta GİB altı ölçümleri üç ardışık takımının ortalamasıdır.
Şekil 3,. GİB artışı ile görme keskinliği ve kontrast duyarlılığı azalır. Optomotor kurulum (A) şematik çizimi. (B) dört çevreleyen monitörlerde görüntülenen kafesler ile optomotor cihazı merkez platformda bir fare. (C) keskinliği ve kontrast duyarlılık fare Şekil 2B de incelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz sürekli oküler hipertansiyon üzerinde rapor fare gözünde lazer aydınlatma ile uyarılabilir. Tuzlu enjeksiyon modeli 18 ve damar koter modeli geniş mikrocerrahi beceri gerektiren her ikisi de 11 ile karşılaştırıldığında, lazer aydınlatma gerçekleştirmek için oldukça basit ve kolaydır. Genellikle 2-3 saat içinde 4-6 fareler için lazer aydınlatma gerçekleştirebilirsiniz. Sürekli GİB artışı elde etmek için önemli adımlar lazer aydınlatma için lazer ve parametreleri önce düzleştirme ön kamara bulunmaktadır. Trabeküler ağ alanına lazer hedef ve yakın siliyer cisim ve kan damarları 6 yaralanmasına en aza indirmek için kolaylaştırdı ön kamarada sıvı dışarı boşaltılması. Lazer farklı türleri de bildirilmiştir, örneğin, bazı çalışmalar limbal reg trabeküler ağ ve episkleral damarlar hedef 810 nm enerji darbeleri 7 kullanılan 532 nm 5,6 ve diğer dalga boyu ile bir diyot lazer kullanılmaktadıriyon. Açı zarar maksimize etmek için, biz 5-7 önce bildirilen lazer modellere göre lazer noktalar sayısı artmıştır. Bizim deney düzeneği ile, hemen hemen her lazer ile tedavi edilen fare yaklaşık% 60 fazla 2 ay GİB yüksek olan aralarında lazer tedavisi, sonra ilk hafta GİB% 50'den fazla artış vardı. Buna karşılık, fare gözlerinin içine mikro biri göz içi enjeksiyon birkaç hafta 8 (Başka bir çalışmada GİB artışı 9,10 daha uzun bir etkisi önerilen) için GİB bir ~ 30% yükseklik ve albino limbal ve episkleral damar tıkanıklığı temin edebilirsiniz CD-1 farelerine sadece birkaç gün 13 için bir akut IOP yüksekliği arttırmaktadır.
GİB doğru ölçüm fare göze lazer efektleri belirlemede önemlidir. Anestezi önemli ölçüde GİB ölçümü ve farelerin davranış eğitimi uyanık hayvanlarda 9,19 azalma GİB değişim değiştirdi. Burada, deney hayvanları g vardıGİB tutarlı okuma almak için ölçümden önce dinlenmek ve ölçülü konumuna uyum için birkaç dakika iven. GİB ölçümü güvenilir ve test yapılan kişiye bağlı değildir onaylamak için, aynı hayvanların iki veya üç farklı test ve GİB okuma farklılıklarını% 5-15 içinde genellikle tarafından incelendi.
Çünkü süresi göz içi basıncı yükseklik derecesi değişkenliği nedeniyle, farklı RGC dökülmesi farklı hayvan modellerinde bildirilmiştir. Örneğin, aksonların bir% 20'lik bir mikro-enjeksiyon 8, fare gözünde görülmüştür. RGCs yaklaşık% 60 trabeküler ağ ve episkleral damarlar 5 hem de lazer aydınlatma ile hayatını kaybetti RGCs yaklaşık% 20, trabeküler ağ de lazer aydınlatma sonra altı hafta sıçan gözünde öldü. Bizim veri fare gözünde lazer tedavisi sonrası 2 ay RGC kaybı% 20-30 gösterdi. Kronik O Bununla birlikte, bütün bu farklı hayvan modelleriönemli inflamasyon veya gözlerin diğer bölgelerine zarar vermeden küler hipertansiyon bize zamanla retina yapısı ve görme fonksiyonu üzerinde oküler hipertansiyon uzun vadeli etkileri ölçmek için potansiyel teşkil etmektedir.
Değişen koşullara bir fonksiyonu olarak seri testleri sağlayan görsel davranış testinin non-invaziv doğa yararlanarak, görme keskinliği ve kontrast duyarlılık değişiklikleri oküler hipertansiyon indüksiyon sonrası ay boyunca izlenebilir. Optomotor testi görme fonksiyonu hızlı bir değerlendirme sağlar, dahası, iki göz hedef fare bir göz lazer tedavi ve diğer kontrol olarak değişmeden kalır çünkü büyük ölçüde deneyler kolaylaştıran, ayrı ayrı test edilebilir. Aynı zamanda, bu optomotor refleks bazen yüksek aktivite ve bazı fareler 12 dolaşıp ilgi nedeniyle kullanımının zor olduğunu kaydetti.
Fare geneti gücü ile birliktecs, bizim modeli yüksek gerilim glokomda patolojik mekanizmaları araştırmak için ile mükemmel bir okuma sağlar. Örneğin, Thy-1-YFP transgenik fareler kullanarak, hangi 10,20-22 etiketli RGCs az sayıda vardır, tek tek RGCs dendritik yapısal değişiklikler sürekli oküler hipertansiyon gözlerde görüntülenebilir. Biz RGCs dendritik dejenerasyon göz hipertansif gözünde 23 yere ve alt bağlı olduğunu göstermiştir. Hücre apoptoz veya nöroprotektif sinyal yolları daha RGC dejenerasyon ve glokom hayatta kalma altında yatan moleküler mekanizmaları tanımlamak için in vivo olarak manipüle edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Yazarlar Northwestern Üniversitesi tam zamanlı çalışanlarıdır.
Yazarlar bu makalede kullanılan reaktifler ve aletleri üreten firma tarafından sağlanan NO fon aldı.
Acknowledgments
Bu yazıda yer alan çalışma Amerikan Sağlık Yardım Vakfı (XL), Körlük Engellenir Research William & Mary Greve Özel Scholar Ödülü (XL), gelen Glokom Araştırma Dr Douglas H. Johnson Ödülü tarafından desteklenmiştir Körlük Önlenmesi için Illinois Derneği (HC) ve NIH hibe R01EY019034 (XL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| moxifloxacin | Alcon Labs, Inc. | NDC 0065-4013-03 | 0.5 %, Rx only |
| Proparacaine Hydrochloride | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | 0.5 %, Rx only |
| Ophthalmic Solution USP | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | .5 %, Rx only |
| ketamine | Butler Schein Animal Health | NDC 11695-0550-1 | 100 mg / kg |
| xylazine | LLOYD Inc. of Iowa | NADA 139-236 | 10 mg / kg |
| atropine sulfate solution | Alcon Labs, Inc. | NDC 61314-303-02 | 1 %, Rx only |
| Equipment | |||
| Slit Lamp, TOPCON | Visual Systems Inc | SL-3E | powered by PS-30A |
| OptoMotry 1.8.0 virtual | CerebralMechanics Inc. | ||
| opto-kinetic testing system | CerebralMechanics Inc. | ||
| Tonometer, TonoLab, for mice | Colonial Medical Supply | ||
| Heating pad | Sunbeam Products Inc | 722-810 | |
| Argon laser | Coherent Inc | Ultima 2000SE | |
| DECAPICONE Plastic cone holder | Braintree Sci Inc. | MDC-200 | for mouse |
References
- Gupta, N., Yucel, Y. H. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr. Opin. Ophthalmol. 18, 110-114 (2007).
- Quigley, H. A. Neuronal death in glaucoma. Prog. Retin. Eye Res. 18, 39-57 (1999).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, 816-824 (2009).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. J. Glaucoma. 16, 483-505 (2007).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 402-410 (2002).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 4314-4320 (2003).
- Grozdanic, S. D. Laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4337-4346 (2003).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative ophthalmology & visual science. 51, 207-216 (2010).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Experimental Eye Research. 92, 512-520 (2011).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3847-3857 (2012).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61, 379-382 (1995).
- Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. J. Vis. Exp. (10), e549 (2007).
- Fu, C. T., Sretavan, D. Laser-induced ocular hypertension in albino CD-1 mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 980-990 (2010).
- Rangarajan, K. V. Detection of visual deficits in aging DBA/2J mice by two behavioral assays. Curr. Eye Res. 36, 481-491 (2011).
- Wang, L., et al. Direction-specific disruption of subcortical visual behavior and receptive fields in mice lacking the beta2 subunit of nicotinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 29, 12909-12918 (2009).
- Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22, 677-684 (2005).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 4611-4616 (2004).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64, 85-96 (1997).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 99, 27-35 (2012).
- Liu, X., et al. Brain-derived neurotrophic factor and TrkB modulate visual experience-dependent refinement of neuronal pathways in retina. J. Neurosci. 27, 7256-7267 (2007).
- Liu, X., et al. Regulation of neonatal development of retinal ganglion cell dendrites by neurotrophin-3 overexpression. The Journal of Comparative Neurology. 514, 449-458 (2009).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. The Journal of Comparative Neurology. 451, 115-126 (2002).
- Feng, L., et al. Sustained Ocular Hypertension Induces Dendritic Degeneration of Mouse Retinal Ganglion Cells that Depends on Cell-type and Location. Investigative Ophthalmology & Visual Science. , (2013).
