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Medicine

ビジュアル欠陥を特徴づけるために慢性高眼圧症のレーザー誘起マウスモデル

doi: 10.3791/50440 Published: August 14, 2013

Summary

慢性高眼圧症は、マウスの目に小柱網のレーザー光凝固を使用して誘導される。眼圧(IOP)は、レーザー治療後数ヶ月上昇する。視力と実験動物のコントラスト感度の低下は微細運動テストを使用して監視している。

Abstract

頻繁に上昇した眼圧(IOP)に関連付けられている緑内障は、失明の主要な原因の一つである。我々は、ヒトの高張力緑内障を模倣する高眼圧症のマウスモデルを確立しようとした。ここで、レーザ照射角度を閉塞を誘発する、房水流出をphotocoagulateする角膜輪部に印加される。 IOPの変化はレーザー治療前と後のリバウンド眼圧計を使用して監視している。微細運動行動試験は、視覚能力の対応する変化を測定するために使用される。レーザー照射後に持続IOP上昇を開発1マウスの代表の結果が示されています。視力低下やコントラスト感度は、この眼高血圧マウスにおいて観察される。一緒に、我々の研究では、緑内障マウスで神経変性基礎となる分子メカニズムを調査するために貴重なモデルシステムを導入しています。

Protocol

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手順

C57BL/6Jマウス(ジャクソン研究所、バーハーバー、ME)は、ノースウェスタン大学のアニマルケア施設で発生します。すべての動物は、ノースウェスタン大学制度動物実験委員会およびNIHから神経科学研究における動物の使用に関するガイドラインに準拠することによって承認されたプロトコールに従って使用しています。

1。レーザー光凝固術

レーザー光凝固の手順5-7以前に公表されたプロトコルから変更されている。

  1. ケタミン(100 mg / kgで、バトラーシャインアニマルヘルス、OH)およびキシラジン(10 mg / kgで、アイオワ州、シェナンドーのロイド社、IA)の腹腔内注射することによって40〜60日齢のマウスを麻酔。
  2. 1%硫酸アトロピン溶液の1つまたは2つの滴(アルコン研究所社、フォートワース、テキサス州)で局所処置により実験動物の右眼の瞳孔を拡張させる。
  3. 散瞳後、平らにレーザー誘導6を強化するnterior室。前房内の流体を排出するスリットランプ下前歯スペース(SL-3E、トプコン、オークランド、ニュージャージー州)に鋭い先端(世界プレシジョンインスツルメンツ、サラソタ、フロリダ州)のガラスマイクロピペットを挿入します。
  4. プラスチックコーンホルダー(トリーサイエンス社、MA)でマウスを抑制し( 図1A参照 )自家製プラットフォームに縛ら。拘束とマウスを持ち、スリットランプの後ろに光源にマウスの右目を公開します。スリットランプの下で麻酔したマウスの右眼の位置を合わせます。
  5. 両手でマウスの拘束を保持しながら、アルゴンレーザー(ウルティマ2000SE、コヒーレント、サンタクララ、CA)を使用して、角膜輪部にレーザー照射を適用します。小柱網の周囲に垂直に80-100レーザスポット(514 nmで、100 mWで、50ミリ秒パルス、および200μmのスポット)について配信します。 C57BL / 6マウスは、任意のpに対する障壁として機能する着色された虹彩を有するotential漂遊エネルギー7。
  6. 痛みを和らげるために局所0.5%のレーザー処理面積を消毒するための眼表面上のモキシフロキサシン(アルコンラボ社、フォートワース、テキサス州)と0.5%プロパラカイン(ボシュロム、ロチェスター、NY)を植え付ける。
  7. それは完全に目を覚ましになるまで時間程度回復のための加熱パッド(サンビームプロダクト株式会社、ボカラトン、フロリダ州)の動物を保管してください。
  8. 左目は、コントロールとして機能するように未処理である。

2。 IOP測定

  1. プラスチックコーンホルダーにロードしてから、( 図2A参照 )プラットフォーム上でそれを抑制するためのチューブに目を覚まして、マウスを置きます。
  2. マウスホルダー位置に適応し得るように5〜10分待ちます。プローブ先端が離れて角膜14の表面2〜3ミリメートルになるまでマウスの目にリバウンド眼圧計(TonoLab、コロニアルメディカルサプライ、フランコニア、ニューハンプシャー州)に近づく。
  3. プローブ先端が中心面を打つように、測定ボタンを押すと、静かに角膜の。同じ目のIOPの6測定の3つの連続した​​セットが目のIOPとして取得し、平均化されます。未処理の対照の眼は、常に次の測定されレーザー治療目のベースライン値を得るために最初に測定されます。

3。微細運動テスト

視力とコントラスト感度は、14,15をテストされます。個々のマウスの両眼は、漂流格子方向を反転させることにより別々に検討されている。時計回りに漂流格子が左眼と右眼16についての反時計回りに漂流格子の視覚機能を識別するために使用され、即ち 。各テストは約15分かかり、独立して、二人の観察者によって繰り返される。

  1. マウスを置き、マウスは、4つのコンピュータのモニタ( 図3A-B)に囲まれた高架プラットフォーム上で自由に移動することができます。
  2. 彼らは水平正弦​​漂流表示されるようにモニターを設定39 CD / m 2での平均輝度の視覚刺激として格子。格子の移動方向が交互べき 連続して右回りと左回りの間。
  3. 動物の動きを分析します。視覚刺激がオンになった後、徐々に増加した後、漂流格子と、コンサートでは、動物の動きを15秒以内 "ポジティブ"とみなされます。最高応答惹起する視覚刺激は、動物の視力17として定義されています。
  4. 0.075、0.16、そして1度当たり0.3サイクル(CPD):3つの事前選択された空間周波数でのコントラスト感度を調べます。各眼用コントラスト閾値は、予め固定周波数での視覚的応答を誘発する最も低いコントラストとして定義される。コントラスト感度は、しきい値17の逆数である。

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Representative Results

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の手順で説明するように、レーザー照明は角度の閉鎖( 図1)を誘導、房水流出をphotocoagulateに輪部地域における小柱網を目指している。ほとんどのレーザ書込み目は以前の所見6と一致し、有意な物理的な損傷、顔料剥離や感染症を示さなかった。マウスの小グループ(すべてのレーザ書込み動物の5%未満)などの収縮眼球、重度の白内障、大幅な顔料剥離や出血などの重篤な損傷の物理的な兆候を示したとき、我々はすぐに安楽死。レーザ書込み目の約30%がマイナー角膜瘢痕を開発し、それらのほとんどはレー​​ザー治療後1〜2週間以内に回復した。

私たちは、百以上のマウスから、ほぼすべてのレーザー処理した目に高いIOPを見つけました。実験動物のIOPがリバウンド眼圧計( 図2)を用いて監視される。 図2Bは、Iの変化の一例を示すレーザー治療前後OP。 15.7 mmHgの(右)対14.7 mmHgの(左、0日目、 図2B):レーザー治療の前に、マウスの両眼のIOPベースラインは、差はみられなかった。レーザー治療後の七日は、処理された(右)の目のIOPは、未処理の眼(15.7 mmHgの)に比べ、30.7 mmHgのとほぼ2倍に増加。 4ヶ月治療後に、治療目の平均IO​​Pは未処理の左眼(16.3 mmHgの)のそれよりも有意に高く、26 mmHgであった:レーザー処理した目は、約4ヶ月間26-28 mmHgの上昇にとどまったIOPその後、処理された目のIOPはゆっくりと減少し、治療後6ヶ月(24週)(未処理の目:15.3 mmHgの)で18.7 mmHgのに達した。我々のデータは、持続的なIOPの標高が4ヶ月以上で達成されることを示している。

我々は次の微細運動試験( 図3)を使用して視力喪失を確認した。再帰頭-TR経由空間ビジョンの微細運動テスト対策の面動きを肯定応答(ACK)。 図3Cは、図2Bに調べた動物の視力の低下を示しています。レーザー治療の前に、両方の目が(:;右0.375 CPD:0.397 CPD; 図3C左)通常の視力を示した。二ヶ月でレーザー治療後、右目(高架IOP)の視力が大幅に左コントロール眼と比べて減少した(左:0.45 CPD;右:0.228 CPD; 図3C)。高架IOPで目の視力レーザー治療後5-6ヶ月で低いまま(左:0.378 CPD;右:0 258 CPD; 図3C)。同様に、高いIOPと右眼の下のコントラスト感度( 図3D)が観察された。右目は0.075 CPDで1.91であった一方、二ヶ月のレーザー治療後で、制御左眼のコントラスト感度は、6.13であった。右目が4.28と1だったしながらコントロール左眼のコントラスト感度は、0.16と0.3 CPDで5.53と2.67であった。それぞれ45、( 図3D)。

図1
図1。マウスの目の房水流出のレーザー光凝固。レーザー治療のためのスリットランプの(A)の写真。オペレータは、拘束とマウスを保持し、その後、スリットランプの光源に、マウスの右眼の位置を調整します。(BC)の眼の概略側面図と正面。 80-100レーザースポットが強膜上静脈と散大瞳孔の間の領域に適用されている間オペレータは両手でマウスの規制部を保持しています。

図2
図2。 IOPはレーザー治療後に増加した。(A)セットアップがリバウンド眼圧計を用いてIOPを測定する。(B)レーザー治療後の1の実験マウスのIOPの変化。各点は、IOPの6測定の3つの連続した​​組の平均値である。

図3
図3。 IOP上昇と視力とコントラスト感度の減少。()微細運動セットアップの模式図。4周囲のモニタに表示された格子と微細運動装置の中央プラットフォーム上(B)マウス。(C)視力とコントラスト感度マウスの図2Bに検討した。

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Discussion

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我々は、持続的な高眼圧症上記のレポートは、マウスの目にレーザー照射によって誘導することができる。生理食塩水の注入モデル18および広範顕微スキルを必要とする、どちらも静脈焼灼モデル11に比べて、レーザー照射は、実行するために、比較的シンプルで簡単です。通常、私たちは2〜3時間で4-6マウス用レーザー照射を行うことができます。持続的な眼圧上昇を達成するための重要なステップは、レーザーとレーザー照射のためのパラメータの前に平坦化前房です。小柱網領域にレーザを標的と周辺の毛様体および血管6への損傷を最小限にするために容易に前房に流体を排出する。レーザの異なるタイプも報告されている、例えば、幾つかの研究では、角膜輪部レジスタに小柱網と強膜上静脈を対象とする810nmのエネルギーパルス7を用い532nmの5,6および他の波長を有するダイオードレーザを使用したイオン。角度損傷を最大限にするために、我々は以前に報告されたレーザ5-7モデルと比較してレーザスポットの数が増加している。我々の実験によると、ほぼすべてのレーザ処理されたマウスは約60%以上の2ヶ月間IOPの上昇したそのうちレーザー治療後最初の週IOPの50%以上増加した。これとは対照的に、マウスの目にマイクロビーズの一つ眼内注射は、数週間8(別の研究では、眼圧上昇9,10の長い効果を推奨)、およびアルビノで輪部と強膜上静脈の閉塞のためにIOPで〜30%の上昇を引き出すことができますCD-1マウスは、数日間だけ13の急性IOP上昇を誘導した。

IOPの正確な測定は、マウスの眼に対するレーザーの効果を決定する上で重要である。麻酔が大幅IOP測定を改変したマウスの行動の訓練は目を覚まし、動物9,19におけるIOPのばらつきを減少させた。ここでは、実験動物gであったIOPの一貫性のある測定値を得るために、測定の前に休み、拘束位置に適応するために数分iven。 IOP測定は信頼性が高く、テストを実行した人に依存していないことを確認するには、同じ動物は、2つまたは3つの異なるテスターとIOPの読みのその違い5〜15%内に一般的にすることによって調べた。

なぜなら期間とIOPの上昇の程度のばらつきが、異なるRGC損失が異なる動物モデルで報告されている。例えば、軸索の20%の損失は、マイクロインジェクション8を有するマウスの眼で観察されている。のRGCの約60%は小柱網と強膜上静脈5の両方でレーザー照射で死亡している間のRGCの約20%が、小柱網におけるレーザー照射後6週間後にラットの目に死亡した。我々のデータは、マウスの目にレーザー治療後2ヶ月でRGC損失の20〜30%を示した。慢性のoそれにもかかわらず、これらすべての動物モデル重要な炎症や目の他の部分に損傷を与えることなく、cular高血圧は私たちに時間をかけて網膜の構造と視覚機能に高眼圧症の長期的な効果を測定するための可能性を提供します。

変化する条件の関数として連続検査を可能にする視覚的な行動アッセイの非侵襲的な性質を利用して、視力、コントラスト感度の変化は、高眼圧症の誘導後ヶ月間監視することができる。微細運動テストは、視覚機能の迅速な評価を提供し、さらに、二つの目は、ターゲットマウスの片目がレーザー処理され、その他は、コントロールとしてそのまま残されているので非常に我々の実験を容易に、別々にテストすることができます。同時に、それは微細運動の反射が時々高活性のために使用することは困難であり、一部のマウス12の注目をさまようことに留意されたい。

マウス遺伝子組の力と組み合わせるCS、我々のモデルは、高眼圧緑内障の病理学的メカニズムを調査するとともに優れた読み出しを提供しています。例えば、汝-1-YFPトランスジェニックマウスを用いて、標識されたRGC 10,20-22を少数を有する、個々のRGCの樹枝状構造の変化は、徐高眼圧症と目に撮像することができる。我々は、網膜神経節細胞の樹状変性が眼高血圧目23内の位置とサブタイプに依存することを実証した。細胞アポトーシスや神経保護シグナル伝達経路は、さらに緑内障におけるRGC変性と生存の根本的な分子メカニズムを識別するために、生体内で操作することができます。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

著者は、ノースウェスタン大学のフルタイムの従業員です。

著者は、この記事で使用する試薬や楽器を生み出す企業によって提供されたNOの資金を受け取っていません。

Acknowledgments

この論文に含まれている作品は、アメリカの健康支援財団(XL)、失明を防止するための研究からウィリアム&メアリーグレーヴェ特別奨学生賞(XL)、から緑内障研究博士ダグラス·H.ジョンソン賞によってサポートされています失明予防のためのイリノイ州協会(HC)とNIH助成R01EY019034(XL)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
moxifloxacin Alcon Labs, Inc. NDC 0065-4013-03 0.5 %, Rx only
Proparacaine Hydrochloride Bausch Lomb NDC 24208-730-06 0.5 %, Rx only
Ophthalmic Solution USP Bausch Lomb NDC 24208-730-06 .5 %, Rx only
ketamine Butler Schein Animal Health NDC 11695-0550-1 100 mg / kg
xylazine LLOYD Inc. of Iowa NADA 139-236 10 mg / kg
atropine sulfate solution Alcon Labs, Inc. NDC 61314-303-02 1 %, Rx only
Equipment
Slit Lamp, TOPCON Visual Systems Inc SL-3E powered by PS-30A
OptoMotry 1.8.0 virtual CerebralMechanics Inc.
opto-kinetic testing system CerebralMechanics Inc.
Tonometer, TonoLab, for mice Colonial Medical Supply
Heating pad Sunbeam Products Inc 722-810
Argon laser Coherent Inc Ultima 2000SE
DECAPICONE Plastic cone holder Braintree Sci Inc. MDC-200 for mouse

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References

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Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects. J. Vis. Exp. (78), e50440, doi:10.3791/50440 (2013).More

Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects. J. Vis. Exp. (78), e50440, doi:10.3791/50440 (2013).

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