Summary
만성 안구 고혈압 쥐의 눈 섬유주 레이저 광응고술을 사용하여 유도된다. 안압 (IOP)는 레이저 치료 후 몇 개월 동안 상승합니다. 시력 실험 동물의 대비 감도의 감소는 optomotor 테스트를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다.
Abstract
자주 높은 안압 (IOP)와 관련된 녹내장은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 우리는 인간의 높은 안압 녹내장을 모방하는 안구 고혈압의 마우스 모델을 구축하기 위해 노력했다. 여기에 레이저 조명은 각 폐쇄를 유도 수성 유출 photocoagulate하기 위해 각막 윤부에 적용됩니다. IOP의 변화는 레이저 치료 전후 리바운드 안압계를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. optomotor 행동 테스트는 Visual 용량의 해당 변화를 측정하는 데 사용됩니다. 레이저 조명 후 지속적인 안압 상승을 개발 한 마우스에서 대표적인 결과가 표시됩니다. 시력 저하 및 대비 감도는이 안구 고혈압 쥐에서 관찰된다. 함께, 우리의 연구는 녹내장 쥐에서 신경 세포의 변성 및 기본 분자 메커니즘을 조사하기 위해 중요한 모델 시스템을 소개합니다.
Protocol
절차
C57BL/6J 마우스 (잭슨 연구소, 바 하버, 메인)은 노스 웨스턴 대학교의 동물 관리 시설에서 발생합니다. 모든 동물은 노스 웨스턴 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회와 NIH에서 신경 과학 연구에서 동물의 사용에 대한 지침을 따른다 승인 프로토콜에 따라 사용됩니다.
1. 레이저 광응고술
레이저 광응고술의 절차는 5-7 이전에 발행 된 프로토콜에서 수정됩니다.
- 케타민 (100 ㎎ / ㎏, 버틀러 Schein의 동물 건강, OH)과 xylazine (아이오와, 셰넌 도어의 10 ㎎ / ㎏, 로이드 주식, IA)의 복강 주사로 40 ~ 60 일 이전 마우스를 마취.
- 1 % 아트로핀 황산염 솔루션의 하나 또는 두 방울 (알콘 연구소, 주식 회사, 포트 워스, 텍사스)와 국소 치료로 실험 동물의 오른쪽 눈의 동공을 팽창.
- 산동 후, 평평하게nterior 챔버 레이저 유도는 6 강화한다. 전방 액을 배출 슬릿 램프 아래 전방 공간 (SL-3E, 탑콘, 오클랜드, NJ)에 예리한 끝 (세계 정밀 계측기 Inc의 새러 소타, 플로리다)와 유리 마이크로 피펫을 삽입합니다.
- 플라스틱 콘 홀더 (브레인 과학 주식 회사, MA)에 마우스를 억제하고 (그림 1A 참조) 만든 플랫폼에 묶여. 고정 장치와 마우스를 잡고 슬릿 램프 뒤에 광원 마우스의 오른쪽 눈을 노출합니다. 슬릿 램프에서 마취 마우스의 오른쪽 눈을 맞 춥니 다.
- 두 손으로 마우스 고정 장치를 잡고있는 동안, 아르곤 레이저 (울티마 2000SE, 일관된, 산타 클라라, CA)를 사용하여 각막 윤부에 레이저 조명을 적용합니다. 수직 섬유주의 둘레 80-100 레이저 반점 (514 nm의, 100 mW의 50 밀리 초 펄스, 200 μm의 지점)에 대해 제공합니다. C57BL / 6 마우스는 P에 대한 장벽 역할을 색칠 조리개를 가지고otential 길잃은 에너지 7.
- 주입 국소 0.5 % 목시 플록 사신 (알콘 연구소, 주식 회사, 포트 워스, 텍사스) 레이저 치료 부위와 0.5 %가 Proparacaine이 (바슈롬, 로체스터, NY) 통증을 완화하는 소독하는 안구 표면에.에게
- 완전히 깨어 때까지 약 1 시간 동안 복구를 위해 가열 패드 (태양열 제품 Inc, 보카 레이 톤, 플로리다)에 동물을 유지합니다.
- 왼쪽 눈은 대조군으로 봉사하는 치료입니다.
2. 안압 측정
- 플라스틱 콘 홀더에로드 한 다음 (그림 2A 참조) 플랫폼을 억제하는 튜브에 깨어 마우스를 놓습니다.
- 시간을 5 분 내지는 10 분 마우스 홀더의 위치에 적응하자 할 수 있습니다. 프로브 팁이 떨어져 각막 (14)의 표면 2~3밀리미터 때까지 마우스 눈 리바운드 안압계 (TonoLab, 콜로니얼 의료 공급, 프란 코니아, 뉴햄프셔) 접근.
- 프로브 팁의 중심 표면을 칠 수 있도록 측정 버튼을 눌러부드럽게의 각막. 같은 눈의 안압 여섯 측정 연속 3 세트 취득하고 눈의 안압으로 평균입니다. 치료 컨트롤의 눈은 항상 다음 측정 레이저 치료 눈을위한 기준 수치를 얻기 위해 먼저 측정됩니다.
3. Optomotor 테스트
시력 및 대비 감도는 14,15을 테스트합니다. 개인 마우스의 두 눈 표류 격자의 방향을 반대로하여 개별적으로 검토되며, 시계 방향으로 표류 격자가 왼쪽 눈과 오른쪽 눈 16 반 시계 방향으로 표류 격자의 시각적 기능을 식별하는 데 사용됩니다 즉. 각 테스트는 약 15 분 정도 소요 독립적으로 두 관찰자에 의해 반복됩니다.
- 마우스를 놓고 마우스가 네 개의 컴퓨터 모니터 (그림 3A-B)으로 둘러싸인 높은 플랫폼에서 자유롭게 이동할 수 있습니다.
- 그들은 수평 사인 표류 표시되는 있도록 모니터를 설정39 CD / 평방 미터의 평균 휘도 시각적 자극으로 격자. 격자의 이동 방향은 교대로한다 연속적 사이에 시계 방향 및 반 시계 방향으로.
- 동물의 움직임을 분석합니다. 시각적 인 자극에 다음 점차적으로 증가 후 표류 격자와 함께 콘서트에서 동물의 움직임을 15 초 내에 "긍정적"으로 간주됩니다. 가장 높은 응답-이끌어내는 시각적 자극은 동물의 시력이 17로 정의됩니다.
- 0.075, 0.16, 및 학위 당 0.3 회 (CPD) : 세 개의 미리 설정된 공간 주파수에서 대비 감도를 검사합니다. 각각의 눈에 대한 대비 임계 값은 미리 고정 주파수에서 시각적 인 반응을 이끌어 낮은 대비로 정의됩니다. 대비 감도는 임계 값 17의 역수이다.
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Representative Results
절차에서 설명한대로, 레이저 조명은 폐쇄 각 (그림 1)을 유도, 수성 유출 photocoagulate하는 각막 윤부 지역에서 섬유주위한 것입니다. 대부분의 레이저로 눈 앞의 연구 결과 6 일치 유의 물리적 손상, 색소 분리 또는 감염을 전시하지 않습니다. 쥐의 작은 그룹 (모든 레이저로 동물의 5 % 미만)은 수축 눈 공, 심한 백내장, 중요한 색소 분리, 또는 출혈 등 심각한 손상의 물리적 흔적을 전시 할 때, 우리는 즉시 그들에게 안락사. 레이저로 눈의 약 30 %는 사소한 각막 흉터를 개발, 대부분는 1-2 주 레이저 치료 후 내 회복.
우리는 이상의 백 쥐에서 거의 모든 레이저 치료 눈 높은 안압을 발견했다. 실험 동물의 IOP는 리바운드 안압계 (그림 2)를 사용하여 모니터링합니다. 그림 2B는 I의 변화의 한 예를 보여줍니다레이저 치료 전후 OP. 15.7 mmHg로 (오른쪽) 대 14.7 mmHg로 (왼쪽, 0 일, 그림 2B) : 레이저 치료 전에, 마우스의 두 눈의 안압 기준선은 차이가 없었다. 레이저 치료 후 7 일, 치료 (오른쪽) 눈의 안압 치료 눈 (15.7 mmHg로)에 비해 30.7 mmHg로 거의 2 배 증가했다. 레이저 치료 눈의 안압에 대하여 4 개월 동안 26-28 mmHg로에 상승 남아 : 3 개월 치료 후, 치료 눈의 안압은 치료 왼쪽 눈의 (16.3 mmHg로)보다 높은 26 mmHg로이었다. 그 후, 처리 된 눈의 안압이 서서히 감소 및 치료 6 개월 (24 개월) (치료 눈 : 15.3 mmHg로)에서 18.7 mmHg로 도달. 우리의 데이터는 지속적인 안압 상승이 4 개월 이상에서 달성되어 있는지 보여줍니다.
우리는 다음 optomotor 테스트 (그림 3)를 사용하여 시력 상실을 확인했다. 재귀 머리-TR을 통해 공간의 비전 optomotor 시험 대책 측면운동을 응답 (ACK). 그림 3C는 그림 2B에서 검토 동물의 시력 감소를 보여줍니다. 레이저 치료 전에 두 눈은 (:; 오른쪽 0.375 CPD : 0.397 CPD; 그림 3C 왼쪽) 정상 시력을 보였다. 두 달에 레이저 치료 후, 오른쪽 눈 (높은 IOP)의 시력이 크게 왼쪽 컨트롤 아이에 비해 감소 (왼쪽 : 0.45 CPD; 오른쪽 : 0.228 CPD; 그림 3C). 높은 안압과 눈의 시력이 (. :; 0 258 CPD; 그림 3C 오른쪽 0.378 CPD 왼쪽) 레이저 치료 후 5~6개월에서 낮은 남아 있었다. 마찬가지로, 높은 안압과 오른쪽 눈의 낮은 대비 감도 (그림 3D) 관찰되었다. 오른쪽 눈이 0.075 CPD에서 1.91 동안 두 달에 레이저 치료 후, 컨트롤의 대비 감도는 눈이 6.13이었다 떠났다. 오른쪽 눈이 4.28 1 동안 컨트롤 왼쪽 눈의 대비 감도, 0.16 및 0.3 CPD에서 5.53와 2.67이었다.각각 45, (그림 3D).
그림 1. 마우스 눈에서 수성 유머 유출의 레이저 광응고술. 레이저 치료 슬릿 램프 (A) 사진. 운영자는 고정 장치와 마우스를 보유하고 세극등. (BC) 도식 사이드 뷰와 눈의 전면보기의 광원에 마우스의 오른쪽 눈을 맞 춥니 다. 80-100 레이저 반점 상공 막 정맥과 동공 사이의 영역에 적용하는 동안 운전자는 양손으로 마우스 restrainers을 보유하고 있습니다.
그림 2. IOP는 레이저 치료 후 증가 하였다. (A) 설치 리바운드 안압계를 이용하여 안압을 측정 할 수 있습니다. (B)레이저 치료 후 한 실험 쥐의 IOP의 변화. 각 점은 IOP의 여섯 측정 연속 3 세트의 평균입니다.
그림 3. 안압 상승과 시력 및 대비 감도의 감소. optomotor 설정의 (A) 도식 그리기. (B) 네 주변의 모니터에 표시되는 격자와 optomotor 장치의 중앙 플랫폼에서 마우스입니다. (C) 시력 및 대비 감도 마우스 그림 2B로 하였다.
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Discussion
우리가 지속적인 안압 위의 보고서는 마우스 눈에서 레이저 조명에 의해 유도 될 수있다. 식염수 주입 모델 18 정맥 소작 모델 광범위한 미세 기술을 필요로 둘 다 11에 비해, 레이저 조명 수행 할 비교적 간단하고 쉽습니다. 보통 우리는 2-3 시간에서 4-6 생쥐 레이저 조명을 수행 할 수 있습니다. 지속적인 안압 상승을 달성하기 위해 중요한 단계 레이저 조명 레이저 매개 변수 앞에 납작 전방이다. 섬유주 영역에 레이저를 대상으로 근처 모양체 혈관 6 부상을 최소화하기 위해 촉진 전방 액을 배출. 레이저의 종류도보고되고있다, 예를 들어, 일부 연구는 각막 등록에 섬유주 및 상공 막 정맥을 대상으로 810 nm의 에너지 펄스 7를 사용하여 532 nm의 5,6과 다른 파장의 다이오드 레이저를 사용하여이온. 각 피해를 극대화하기 위해, 우리는 5-7 이전에보고 된 레이저 모델에 비해 레이저 반점의 수를 증가하고있다. 우리의 실험 장치로, 거의 모든 레이저 치료 마우스 약 60 %가 2 개 이상 개월 안압 상승했다 그중 레이저 치료 후 첫 주에 의해 안압이 50 % 이상 증가했다. 대조적으로, 마우스 눈에 마이크로 비드 한 안압 주입은 몇 주 8 조 (다른 연구는 안압 상승 9,10의 이상 적용 제안)에 대한 안압 ~ 30 % 상승, 그리고 흰둥이의 각막과 상공 막 정맥의 폐색을 유도 할 수 CD-1 마우스 만 몇 일 13 급성 안압 상승을 유발.
IOP의 정확한 측정은 마우스 눈에 레이저 효과를 결정하는 것이 중요합니다. 마취는 크게 안압 측정과 쥐의 행동 교육 깨어있는 동물 9,19의 감소 안압 변화를 변경. 여기서, 실험 동물 g이었다IOP의 일관된 수치를 얻기 위해 측정 전에 휴식과 절제의 위치에 적응하는 데 몇 분 정도 iven. 안압 측정이 신뢰할 수 있고 테스트를 수행 한 사람에 의존하지 확인하려면, 같은 동물은 두 개 또는 세 개의 다른 테스터와 안압 측정 값의 차이점 5-15 %에서 일반적으로 관찰 하였다.
때문에 기간과 안압 상승의 정도의 변화의 다른 RGC 손실은 다른 동물 모델에서보고되었다. 예를 들어, 축삭의 20 % 손실은 마이크로 비드 분사 8에서 마우스 눈에서 관찰되었다. RGCs의 60 %가 섬유주 및 상공 막 정맥 5에서 모두 레이저 조명으로 사망하면서 RGCs의 20 %는 섬유주에 레이저 조명 후 6 주에 쥐의 눈에서 죽었다. 우리의 데이터는 마우스 눈에서 레이저 치료 후 2 개월에서 RGC 손실의 20 ~ 30 %를 보였다. 만성 오의 그럼에도 불구하고, 모든 다른 동물 모델중요한 염증이나 눈의 다른 부분에 손상없이 cular 고혈압은 우리에게 시간이 지남에 따라 망막 구조와 시각적 기능에 안구 고혈압의 장기 효과를 측정 할 수있는 가능성을 제공합니다.
변화하는 상황의 함수로 시리얼 테스트를 할 수 있습니다 시각적 행동 분석의 비 침습 특성을 활용, 시력 및 대비 감도의 변화는 안구 고혈압의 유도 후 몇 개월 동안 모니터링 할 수 있습니다. optomotor 시험은 시각 기능의 신속한 평가를 제공하며 또한, 두 눈은 대상 마우스의 한쪽 눈은 레이저 치료이며, 다른 하나는 제어로 그대로 유지되기 때문에 크게 우리의 실험을 용이하게 개별적으로 테스트 할 수 있습니다. 동시에, 그것은 optomotor 반사 때때로 높은 활동과 일부 쥐 12의 방황 관심으로 인해 사용하기 어려운 것을 지적합니다.
마우스 유 전적으로의 힘과 결합CS, 우리의 모델은 높은 안압 녹내장에서 병리학 메커니즘을 조사하는 데 탁월한 판독을 제공합니다. 예를 들어, 아낌없이-1-YFP 형질 전환 마우스를 사용, 이는 10,20-22 레이블 RGCs의 작은 숫자를 가지고, 각각의 RGCs의 돌기 구조적인 변화는 지속적인 안구 고혈압과 눈을 이미지화 할 수 있습니다. 우리는 RGCs의 돌기 변성 안구 고혈압의 눈 23 위치 및 하위 유형에 따라 달라집니다 것을 증명하고있다. 세포 사멸이나 신경 신호 전달 경로는 더욱 RGC 변성과 녹내장 생존의 기본 분자 메커니즘을 식별하는 생체 내에서 조작 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
저자는 노스 웨스턴 대학의 풀 타임 직원입니다.
저자는이 문서에 사용 된 시약 및 장비를 생산하는 업체가 제공 한 어떠한 자금을받지 않았다.
Acknowledgments
이 문서에 포함 된 작품은 미국의 건강 보조 재단 (XL), 실명을 방지하기 위해 연구에서 윌리엄 & 메리 그레베 특별 장학생 수상 (XL)에서 녹내장 연구 박사 더글러스 H. 존슨 수상에 의해 지원되었다 실명 예방 일리노이 학회 (HC)와 NIH 부여 R01EY019034 (XL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| moxifloxacin | Alcon Labs, Inc. | NDC 0065-4013-03 | 0.5 %, Rx only |
| Proparacaine Hydrochloride | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | 0.5 %, Rx only |
| Ophthalmic Solution USP | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | .5 %, Rx only |
| ketamine | Butler Schein Animal Health | NDC 11695-0550-1 | 100 mg / kg |
| xylazine | LLOYD Inc. of Iowa | NADA 139-236 | 10 mg / kg |
| atropine sulfate solution | Alcon Labs, Inc. | NDC 61314-303-02 | 1 %, Rx only |
| Equipment | |||
| Slit Lamp, TOPCON | Visual Systems Inc | SL-3E | powered by PS-30A |
| OptoMotry 1.8.0 virtual | CerebralMechanics Inc. | ||
| opto-kinetic testing system | CerebralMechanics Inc. | ||
| Tonometer, TonoLab, for mice | Colonial Medical Supply | ||
| Heating pad | Sunbeam Products Inc | 722-810 | |
| Argon laser | Coherent Inc | Ultima 2000SE | |
| DECAPICONE Plastic cone holder | Braintree Sci Inc. | MDC-200 | for mouse |
References
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