Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En laser-indusert Mouse Modell av kronisk okulær hypertensjon å karakterisere Visuelle defekter

doi: 10.3791/50440 Published: August 14, 2013

Summary

Kronisk okulær hypertensjon er indusert ved hjelp av laser fotokoagulasjon av trabekelverket i mus øyne. Det intraokulære trykket (IOP) er forhøyet i flere måneder etter laserbehandling. Nedgangen av synsskarphet og kontrast følsomhet av forsøksdyr er overvåket ved hjelp av optomotor test.

Abstract

Glaukom, ofte assosiert med forhøyet intraokulært trykk (IOP), er en av de viktigste årsakene til blindhet. Vi har forsøkt å etablere en musemodell av okulær hypertensjon å etterligne humant høyspent glaukom. Her laser belysning brukes på hornhinnen limbus å photocoagulate den vandige strøm, indusere vinkel nedleggelse. Endringene i intraokulært trykk blir overvåket ved hjelp av en etterpå tonometer før og etter laserbehandling. En optomotor atferdsmessige testen brukes til å måle tilsvarende endringer i visuell kapasitet. Representanten resultat fra en mus som utviklet vedvarende IOP heving etter laser belysning vises. En redusert synsskarphet og kontrast følsomhet er observert i dette okulær hypertensjon mus. Sammen introduserer vår studie en verdifull modellsystem for å undersøke neuronal degenerasjon og de underliggende molekylære mekanismer i glaucomatous mus.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Prosedyrer

C57BL/6J mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) er oppvokst ved Northwestern University Animal Care Facility. Alle dyr blir brukt i samsvar med protokoller godkjent av Northwestern University Institutional Animal Care og bruk Committee og konform til retningslinjer for bruk av dyr i nevrovitenskap forskning fra NIH.

En. Laser fotokoagulasjons

Prosedyren for laser fotokoagulasjon er endret fra tidligere publiserte protokoller 5-7.

  1. Anesthetize en 40-60 dager gamle mus av en intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg / kg, Butler Schein Animal Health, OH) og xylazin (10 mg / kg, Lloyd Inc. i Iowa, Shenandoah, IA).
  2. Strekke eleven av høyre øyet av forsøksdyr, ved lokal behandling med en eller to dråper av 1% atropin-sulfat-løsning (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX).
  3. Etter mydriasis, flat ennterior kammer for å øke laser induksjon seks. Sett et glass mikropipette med skarp spiss (World Precision Instruments Inc, Sarasota, FL) inn i fremre plass under spaltelampe (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ) for å tappe ut væske i fremre kammer.
  4. Beherske musen i en plast membran holder (Braintree Sci Inc., MA) og bundet opp på en hjemmelaget plattform (Se figur 1A). Hold musen med restrainer og eksponerer høyre øye på musen til lyskilden bak spaltelampe. Rett høyre øyet av bedøvet mus under spaltelampe.
  5. Mens du holder musen restrainer med begge hender, bruke laser belysningen i hornhinnen limbus hjelp av en Argon laser (Ultima 2000SE, Samstemt, Santa Clara, CA). Lever 80-100 laser flekker (514 nm, 100 mW, 50 ms puls, og 200 mikrometer spot) vinkelrett rundt omkretsen av trabekelverket. De C57BL / 6 mus har pigmentert iris som fungerer som en barriere for noen potential bortkommen energi syv.
  6. Innpode aktuell 0.5% moxifloxacin (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, Texas) på okulær overflate for å desinfisere laser-behandlede området og 0,5% Proparacaine (Bausch & Lomb, Rochester, NY) for å lindre smerte.
  7. Holde dyret på en varmepute (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) for gjenoppretting for omtrent en time før det er helt våken.
  8. Det venstre øye er ubehandlet for å tjene som en kontroll.

2. IOP Målinger

  1. Plasser våken musen inn i et rør for å laste inn i plast membran holder og deretter holde den på plattformen (se figur 2A).
  2. Tillat fem til ti minutter for å la musen bli tilpasset til holderen stilling. Nærmer rebound tonometer (TonoLab, Colonial Medical Supply, Franconia, New Hampshire) til musen øyet før sonden tips er 2-3 mm fra overflaten av hornhinnen 14.
  3. Trykk på målingen knappen for å la sonden spissen treffer midten overflatenav hornhinnen forsiktig. Tre påfølgende sett med seks målinger av intraokulært trykk på det samme øyet blir anskaffet og midlet som IOP av øyet. Den ubehandlede kontrollen øyet er alltid måles først for å få en baseline lesning for laser-behandlede øyet som er målt siden.

3. Optomotor Test

Synsskarphet og kontrast følsomhet testes 14,15. De to øyne individuelle mus undersøkt separat ved å reversere drivende rist retning, dvs. en klokken drivende rist brukes til å identifisere den visuelle funksjon av venstre øye og en mot klokken drivende rist for høyre øye 16. Hver test tar ca 15 min, og er gjentatt av to observatører uavhengig.

  1. Plasser musen og lar musen til å flytte fritt på en forhøyet plattform omgitt av fire dataskjermer (figur 3A-B).
  2. Sett opp skjermene slik at de vises horisontalt drivende sinusformetrister som visuelle stimuli med midlere luminans på 39 cd / m 2. Den bevegelige retning av risten skal varieres fortløpende mellom med og mot klokken.
  3. Analyser dyrets bevegelser. Dyrets bevegelser i-konsert med drivende rister regnes som "positive" innen 15 sek etter den visuelle stimulus er på, og deretter gradvis økt. Den høyeste respons-Fremlokkende visuelle stimulus er definert som dyrets synsskarphet 17.
  4. Undersøke kontrast følsomhet på tre forhåndsvalgte romlige frekvenser: 0,075, 0,16 og 0,3 sykluser per grad (CPD). Kontrasten terskelen for hvert øye er definert som den laveste kontrast som utløser visuelle respons på pre-fast frekvens. Kontrasten følsomhet er det omvendte av den terskelen 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Som beskrevet i de prosedyrer, er laser-lys rettet mot den trabekelverket i limbale regionen til photocoagulate den vandige utstrømningen, indusere vinkel lukning (fig. 1). Mest lasered øyne viste ingen betydelig fysisk skade, pigment avløsning eller infeksjon, i tråd med tidligere funn seks. Når en liten gruppe mus (mindre enn 5% av alle lasered dyr) viste fysiske tegn på alvorlig skade som punkterte øye baller, alvorlig katarakt, betydelig pigment avløsning, eller blødning, avlivet vi dem umiddelbart. Rundt 30% av lasered øyne utviklet mindre hornhinnen arr, og de fleste av dem igjen innen 1-2 uker etter laserbehandling.

Vi fant forhøyet IOP i nesten hver laser-behandlede øynene fra mer enn hundre mus. Den IOP av eksperimentelle dyr blir overvåket ved hjelp av en etterpå tonometer (figur 2). Figur 2B viser et eksempel på endringer av jegOP før og etter laserbehandling. Før laser behandling, viste IOP grunnlinjene i de to øyne musen ingen forskjell: 15,7 mmHg (høyre) vs 14,7 mmHg (venstre, dag 0, figur 2B). Syv dager etter laser-behandlingen økte IOP av de behandlede (høyre) øyet nesten 2 ganger til 30,7 mmHg, sammenliknet med den ubehandlede øye (15,7 mmHg). Den IOP av laser-behandlede øye forble forhøyet i 26-28 mmHg for ca 4 måneder: ved 4 måneder etter behandling, var gjennomsnittlig IOP av behandlede øyet var 26 mmHg, betydelig høyere enn for ubehandlet venstre øye (16,3 mmHg). Senere har IOP av det behandlede øyet sakte redusert og nådde 18,7 mmHg ved 6 måneder (24 uker) etter avsluttet behandling (ubehandlet øye: 15,3 mmHg). Våre data viser at vedvarende IOP høyde er oppnådd i mer enn fire måneder.

Vi neste bekreftet synstap bruker optomotor test (figur 3). De optomotor testen måler aspekter av romlige visjon via refleksiv head-tracking bevegelser. Figur 3C viser reduksjonen av synsskarphet av dyret undersøkt i figur 2B. Før laser-behandling, viste begge øynene normal synsskarphet (Venstre: 0.375 CPD Høgre: 0,397 CPD; Figur 3C). På to måneder etter laser behandling, visus på høyre øye (forhøyet IOP) redusert betraktelig sammenlignet med venstre kontroll øyet (Venstre: 0,45 CPD Høgre: 0.228 CPD; Figur 3C). Den skarphet i øyet med forhøyet IOP holdt seg lav i 5-6 måneder etter laserbehandling (Venstre: 0.378 CPD Høgre:. 0 258 CPD; Figur 3C). Likeledes er det satt en lavere kontrast følsomheten til høyre øye med økt intraokulært trykk observert (figur 3D). På to måneder etter laserbehandling, forlot kontrasten følsomheten av kontrollen øyet var 6,13, mens den høyre øye var 1,91 på 0.075 CPD. Kontrasten følsomheten av kontrollen venstre øyet var 5,53 og 2,67 ved 0,16 og 0,3 CPD, mens det høyre øyet var 4,28 og 1..45, henholdsvis (figur 3D).

Figur 1
Figur 1. Laser fotokoagulasjon av den vandige humor utgang i mus øyne. (A) Et bilde av spaltelampe for laserbehandling. Operatøren holder musen med restrainer og deretter justerer høyre øye på musen til lyskilden av spaltelampe. (BC) Skjematisk side-visning og front-visning av øyet. Operatøren holder musen restrainers med begge hender mens 80-100 laser flekker er brukt til området mellom episcleral årer og utvidet pupill.

Figur 2
Figur 2. IOP økt etter laserbehandling. (A) Oppsettet å måle IOP ved hjelp av en rebound tonometer. (B)Endringer av IOP av en eksperimentell mus etter laserbehandling. Hvert punkt er gjennomsnittet av tre påfølgende sett med seks-målinger av IOP.

Figur 3
Figur 3. Reduksjoner av synsskarphet og kontrast følsomhet med IOP høyde. (A) Skjematisk tegning av optomotor oppsett. (B) En mus på midten plattformen i optomotor apparat med gitter som vises på fire omkringliggende skjermer. (C) skarphet og kontrast følsomhet av mus undersøkt i figur 2B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi rapporterer over at vedvarende okulær hypertensjon kan være forårsaket av laser belysning i mus øyne. Sammenlignet med saltvann injeksjon modell 18 og venen cautery modell 11 som begge krever omfattende mikrokirurgisk ferdigheter, er laser belysning forholdsvis enkel og lett å utføre. Vanligvis kan vi utføre laser belysning for 4-6 mus i 2-3 timer. De kritiske skritt for å oppnå vedvarende IOP heving er den fremre kammer utflating før laser og parametrene for laser belysning. Drenering ut væske i fremre kammer lettere å målrette laser til trabekelverket området og minimere skade til nærliggende ciliarkroppen og blodkar seks. Ulike typer laser har også blitt rapportert, for eksempel noen studier brukt en diode laser med bølgelengde på 532 nm 5,6 og andre brukt 810 nm energi pulser 7 for å målrette trabekelverket og episcleral årer i limbale region. For å maksimere den vinkel skade, har vi økt antall laser flekker i forhold til de tidligere rapporterte lasermodeller 5-7. Med vår eksperimentelle oppsettet, hadde nesten hver laser-behandlede mus mer enn 50% økning av IOP av den første uken etter laser behandling, hvorav ca 60% hadde forhøyet IOP for mer enn to måneder. Derimot, kan man intraokulær injeksjon av microbeads inn mus øyne framprovosere en ~ 30% økning i IOP for et par uker 8 (en annen studie antydet en lengre effekt av IOP høyde 9,10), og okklusjon av limbale og episcleral årer i albino CD-en mus bare indusert akutt IOP høyde for et par dager 13.

Den nøyaktige måling av IOP er viktig for å bestemme laser effekter på mus øyne. Anestesi betydelig endret IOP måling og atferdsmessige opplæring av mus redusert IOP variasjon i våken dyr 9,19. Her var de forsøksdyr given noen minutter for å hvile og tilpasse seg behersket posisjon før måling for å få konsistente målinger av IOP. For å bekrefte IOP målingen er pålitelig og ikke avhengig av personen som utførte testen, ble de samme dyrene undersøkt av to eller tre forskjellige testere og deres forskjeller av IOP målinger er vanligvis innenfor 5-15%.

På grunn av variasjonen av varigheten og graden av IOP høyde, har forskjellig RGC tap er rapportert i ulike dyremodeller. For eksempel har en 20% tap av axoner blitt observert i mus øynene med microbeads injeksjon åtte. Rundt 20% av RGCs døde i rotte øyne på seks uker etter laser belysning på trabekelverket, mens rundt 60% av RGCs døde med laser belysning både på trabekelverket og episcleral vener fem. Våre data viste en 20-30% av RGC tap på to måneder etter laser behandling i mus øyne. Likevel, alle disse forskjellige dyremodeller av kronisk osielt hypertensjon uten betydelig betennelse eller skade på andre deler av øynene gir oss mulighet til å måle de langsiktige effektene av okulær hypertensjon på retinal struktur og visuell funksjon over tid.

Å dra nytte av den ikke-invasive karakter av den visuelle analysen atferdsmessige som tillater serielle prøver som en funksjon av endrede forhold, kan endringene av synsskarphet og kontrastfølsomhet overvåkes i flere måneder etter induksjon av okulær hypertensjon. Den optomotor testen gir en rask visuell vurdering av funksjon, dessuten kan de to øyne bli testet hver for seg, noe som i stor grad forenkler våre eksperimenter fordi ett øye av målet mus er laser-behandlet og den andre er intakt som kontrollen. På samme tid, er det bemerket at optomotor refleksen noen ganger er vanskelig å bruke på grunn av den høye aktiviteten og vandrende oppmerksomhet av noen mus 12.

Kombinert med kraften av mus genetiskcs, gir vår modell en ypperlig avlesning med å undersøke de patologiske mekanismer i høyspent glaukom. For eksempel bruker Thy-en-YFP transgene mus, som har et lite antall RGCs merket 10,20-22, kan de dendrittiske strukturelle endringer av enkelte RGCs avbildes i øynene med vedvarende okulær hypertensjon. Vi har vist at dendrittiske degenerasjon av RGCs avhenger av beliggenhet og undergrupper i okulære hypertensive øyne 23. Celle apoptose eller nervecellene signalveier kan videre manipulert in vivo for å identifisere de underliggende molekylære mekanismer av RGC degenerasjon og overlevelse i glaukom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Forfatterne er heltidsansatte i Northwestern University.

Forfatterne fikk ingen midler som ble levert av selskaper som produserer reagenser og instrumenter som brukes i denne artikkelen.

Acknowledgments

Arbeidet i dette papiret har blitt støttet av Dr. Douglas H. Johnson Award for Glaukom Forskning fra American Health Assistance Foundation (XL), William & Mary Greve Special Scholar Award fra Forskningsrådet for å hindre blindhet (XL), den Illinois Society for Prevention of Blindness (HC) og NIH stipend R01EY019034 (XL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
moxifloxacin Alcon Labs, Inc. NDC 0065-4013-03 0.5 %, Rx only
Proparacaine Hydrochloride Bausch Lomb NDC 24208-730-06 0.5 %, Rx only
Ophthalmic Solution USP Bausch Lomb NDC 24208-730-06 .5 %, Rx only
ketamine Butler Schein Animal Health NDC 11695-0550-1 100 mg / kg
xylazine LLOYD Inc. of Iowa NADA 139-236 10 mg / kg
atropine sulfate solution Alcon Labs, Inc. NDC 61314-303-02 1 %, Rx only
Equipment
Slit Lamp, TOPCON Visual Systems Inc SL-3E powered by PS-30A
OptoMotry 1.8.0 virtual CerebralMechanics Inc.
opto-kinetic testing system CerebralMechanics Inc.
Tonometer, TonoLab, for mice Colonial Medical Supply
Heating pad Sunbeam Products Inc 722-810
Argon laser Coherent Inc Ultima 2000SE
DECAPICONE Plastic cone holder Braintree Sci Inc. MDC-200 for mouse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupta, N., Yucel, Y. H. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr. Opin. Ophthalmol. 18, 110-114 (2007).
  2. Quigley, H. A. Neuronal death in glaucoma. Prog. Retin. Eye Res. 18, 39-57 (1999).
  3. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, 816-824 (2009).
  4. Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. J. Glaucoma. 16, 483-505 (2007).
  5. Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 402-410 (2002).
  6. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 4314-4320 (2003).
  7. Grozdanic, S. D. Laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4337-4346 (2003).
  8. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative ophthalmology & visual science. 51, 207-216 (2010).
  9. Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Experimental Eye Research. 92, 512-520 (2011).
  10. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3847-3857 (2012).
  11. Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61, 379-382 (1995).
  12. Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. J. Vis. Exp. (10), e549 (2007).
  13. Fu, C. T., Sretavan, D. Laser-induced ocular hypertension in albino CD-1 mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 980-990 (2010).
  14. Rangarajan, K. V. Detection of visual deficits in aging DBA/2J mice by two behavioral assays. Curr. Eye Res. 36, 481-491 (2011).
  15. Wang, L., et al. Direction-specific disruption of subcortical visual behavior and receptive fields in mice lacking the beta2 subunit of nicotinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 29, 12909-12918 (2009).
  16. Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22, 677-684 (2005).
  17. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 4611-4616 (2004).
  18. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64, 85-96 (1997).
  19. Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 99, 27-35 (2012).
  20. Liu, X., et al. Brain-derived neurotrophic factor and TrkB modulate visual experience-dependent refinement of neuronal pathways in retina. J. Neurosci. 27, 7256-7267 (2007).
  21. Liu, X., et al. Regulation of neonatal development of retinal ganglion cell dendrites by neurotrophin-3 overexpression. The Journal of Comparative Neurology. 514, 449-458 (2009).
  22. Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. The Journal of Comparative Neurology. 451, 115-126 (2002).
  23. Feng, L., et al. Sustained Ocular Hypertension Induces Dendritic Degeneration of Mouse Retinal Ganglion Cells that Depends on Cell-type and Location. Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2013).
En laser-indusert Mouse Modell av kronisk okulær hypertensjon å karakterisere Visuelle defekter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects. J. Vis. Exp. (78), e50440, doi:10.3791/50440 (2013).More

Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects. J. Vis. Exp. (78), e50440, doi:10.3791/50440 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter