Summary
Hipertensão ocular crônica é induzida pelo uso de fotocoagulação a laser da malha trabecular em rato olhos. A pressão intra-ocular (IOP) é elevada durante vários meses após o tratamento com laser. A diminuição da acuidade visual e sensibilidade ao contraste de animais experimentais são monitorados por meio do teste optomotor.
Abstract
Glaucoma, frequentemente associada com a pressão intra-ocular elevada (PIO), é uma das principais causas de cegueira. Buscou-se estabelecer um modelo do rato de hipertensão ocular para imitar alta tensão humana glaucoma. Aqui iluminação laser é aplicado ao limbo corneano para photocoagulate o escoamento do humor aquoso, induzindo fechamento angular. As mudanças de pressão intra-ocular são monitorizadas utilizando um tonómetro rebote antes e após o tratamento com laser. Um teste comportamental optomotor é usado para medir as mudanças correspondentes na capacidade visual. O resultado representante de um rato que desenvolveu elevação da PIO sustentada após a iluminação a laser é mostrado. Uma diminuição da acuidade visual e sensibilidade ao contraste é observado neste rato hipertenso ocular. Juntos, nosso estudo apresenta um modelo de sistema valioso para investigar a degeneração neuronal e dos mecanismos moleculares subjacentes em camundongos portadores de glaucoma.
Protocol
Procedimentos
Camundongos C57BL/6J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) são levantadas a Animal Care Facility da Universidade Northwestern. Todos os animais são utilizados em conformidade com os protocolos aprovados pela Northwestern University Animal Care Institucional e Comitê de Uso e conformados com as orientações sobre o uso de animais em pesquisa Neurociência do NIH.
1. Fotocoagulação a laser
O procedimento de fotocoagulação com laser é modificado a partir de protocolos previamente publicados 5-7.
- Anestesiar um rato de 40-60 dias de idade por uma injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg, Butler Schein Animal Health, OH) e xilazina (10 mg / kg, Lloyd Inc. de Iowa, Shenandoah, IA).
- Dilatar a pupila do olho direito do animal experimental por tratamento tópico com uma ou duas gotas de solução de sulfato de atropina 1% (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX).
- Depois de midríase, achatar a umcâmara nterior para aumentar a indução de laser 6. Insira uma micropipeta de vidro com a ponta afiada (World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL) para o espaço anterior sob a lâmpada de fenda (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ), para drenar o fluido na câmara anterior.
- Contenha o mouse em uma porta-cone de plástico (Braintree Sci Inc., MA) e amarrado em uma plataforma caseiro (veja a Figura 1A). Segure o mouse com limitador e expõe o olho direito do mouse para a fonte de luz por trás da lâmpada de fenda. Alinhe o olho direito do rato anestesiado sob a lâmpada de fenda.
- Enquanto segura o limitador do mouse com as duas mãos, aplique a iluminação a laser para o limbo da córnea utilizando um laser de argônio (Ultima 2000SE, Coherent, Santa Clara, CA). Entregar cerca de 80-100 pontos de laser (514 nm, 100 mW, 50 ms de pulso, e 200 no local im) perpendicularmente ao redor da circunferência da rede trabecular. Os ratinhos C57BL / 6 têm íris pigmentada, que serve como uma barreira para qualquer pOTENCIAIS energia perdida 7.
- Instill tópica de 0,5% de moxifloxacina (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX) na superfície ocular, para desinfectar a zona tratada com laser e proparacaína a 0,5% (Bausch & Lomb de Rochester, NY, EUA), para aliviar a dor.
- Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) para a recuperação de cerca de uma hora até que esteja completamente desperto.
- O olho esquerdo é tratado para servir como controlo.
2. PIO
- Posicione o mouse acordado em um tubo de carregar no porta-cone de plástico e então restringi-lo na plataforma (Figura 2A).
- Permitir que cinco a dez minutos para permitir que o rato se adaptar à posição do suporte. Aproxime-se do tonômetro de rebote (TonoLab, Colonial Medical Supply, Franconia, NH) aos olhos do mouse até a ponta da sonda é de 2-3 mm de distância da superfície da córnea 14.
- Pressione o botão de medição para deixar a ponta da sonda atingir a superfície do centrode córnea suavemente. Três conjuntos consecutivos de seis medições da pressão intra-ocular do olho mesmas são adquiridos e a média calculada como o IOP do olho. O olho de controlo não tratada é sempre medido primeiro para obter uma leitura de linha de base para o olho tratado com laser, que é medida em seguida.
3. Teste Optomotor
Acuidade visual e sensibilidade ao contraste são testados 14,15. Os dois olhos de ratinhos individuais são analisados separadamente, invertendo a direcção ralar deriva, ou seja uma grelha derivação dos ponteiros do relógio é usada para identificar a função visual do olho esquerdo e uma grelha flutuando anti-horário para o olho direito 16. Cada teste demora cerca de 15 minutos e é repetido por dois observadores de forma independente.
- Posicione o mouse e deixar o mouse para mover-se livremente em uma plataforma elevada rodeada por quatro monitores de computador (Figura 3A-B).
- Configure os monitores para que eles exibem horizontalmente à deriva sinusoidalgrades como estímulos visuais com luminância média de 39 cd / m 2. A direção do movimento da grade deve alternar consecutivamente entre em sentido horário e anti-horário.
- Analisar os movimentos do animal. Os movimentos do animal no-show com as grades à deriva são considerados "positivos" no prazo de 15 segundos após o estímulo visual está ligado e, em seguida, aumentada gradualmente. A maior resposta eliciador estímulo visual é definido como a acuidade visual do animal 17.
- Examine a sensibilidade ao contraste em três freqüências pré-selecionadas espaciais: 0,075, 0,16 e 0,3 ciclos por grau (cpg). O limiar de contraste, para cada olho é definido como a menor contraste que provoca respostas visuais com a frequência pré-fixada. A sensibilidade de contraste é o recíproco do limiar 17.
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Representative Results
Tal como descrito nos Procedimentos, iluminação laser é apontado para a malha trabecular na região límbica para photocoagulate o escoamento do humor aquoso, induzindo ângulo fechado (Figura 1). Olhos mais lasered exibiu nenhum dano físico significativo, descolamento pigmento ou infecção, de acordo com os achados anteriores 6. Quando um pequeno grupo de ratos (menos de 5% de todos os animais lasered) apresentaram sinais de danos físicos graves, como bolas deflacionados oculares graves, catarata, descolamento de pigmento significativa, ou sangramento, nós sacrificados imediatamente. Cerca de 30% dos olhos lasered desenvolvido pequenas cicatrizes da córnea, e a maioria deles recuperou dentro de 1-2 semanas após o tratamento com laser.
Encontramos PIO elevada em quase todos os olhos tratados com laser de mais de cem ratos. A PIO de animais experimentais, pode ser controlada por meio de um tonómetro ressalto (Figura 2). Figura 2B mostra um exemplo das alterações do IOP, antes e após o tratamento com laser. Antes do tratamento a laser, as linhas de base de PIO dos dois olhos do rato não mostraram diferença: 15,7 mmHg (direita) vs 14,7 mmHg (esquerda, Dia 0, Figura 2B). Sete dias após o tratamento a laser, a PIO do olho tratada (à direita) aumentou quase duas vezes superior a 30,7 mmHg, em comparação com o olho não tratado (15,7 mmHg). A pressão intra-ocular do olho tratado com laser manteve-se elevada a 26-28 mmHg durante cerca de 4 meses: após 4 meses de tratamento, a PIO média do olho tratado foi de 26 mm Hg, significativamente maior do que a do olho esquerdo não tratado (16,3 mmHg). Posteriormente, a pressão intra-ocular do olho tratado diminuiu lentamente e atingiu 18,7 mmHg em 6 meses (24 semanas) após tratamento (olho não tratado: 15,3 mmHg). Os nossos dados demonstram que a elevação da pressão intra-ocular sustentada é conseguida durante mais de 4 meses.
A seguir, confirmou a perda de visão através do teste optomotor (Figura 3). Os testes optomotor medidas aspectos da visão espacial através reflexiva cabeça-tracking movimentos. Figura 3C mostra a diminuição da acuidade visual dos animais examinados na Figura 2B. Antes de o tratamento a laser, ambos os olhos exibidos acuidade normal (esquerda: 0,375 cpg; direita: 0,397 cpg; Figura 3C). Em dois meses após o tratamento a laser, a acuidade visual do olho direito (PIO elevada) diminuiu significativamente em comparação com o olho controle esquerdo (Left: 0,45 cpg; direita: 0,228 cpg; Figura 3C). A acuidade do olho com PIO elevada permaneceu baixa em 5-6 meses após o tratamento a laser (esquerda: 0,378 cpg; direita:. 0 258 cpg; Figura 3C). Da mesma forma, observou-se uma menor sensibilidade de contraste do olho direito com PIO elevada (Figura 3D). Em dois meses após o tratamento a laser, a sensibilidade ao contraste do controle olho esquerdo era 6,13, enquanto o olho direito foi de 1,91 a 0,075 cpg. A sensibilidade ao contraste do controle olho esquerdo foi de 5,53 e 2,67 a 0,16 e 0,3 cpg, enquanto o olho direito foi de 4,28 e 1.45, respectivamente (Figura 3D).
Figura 1. Fotocoagulação do escoamento do humor aquoso em olhos de mouse laser. (A) Uma foto da lâmpada de fenda para o tratamento a laser. O operador segura o mouse com limitador e, em seguida, alinha o olho direito do mouse para a fonte de luz da lâmpada de fenda. (BC) Esquema de visão lateral e visão frontal do olho. O operador prende as limitadores do rato com as duas mãos enquanto 80-100 pontos de laser são aplicados à área entre as veias episclerais e a pupila dilatada.
Figura 2. PIO aumentou após o tratamento a laser. (A) A configuração para medir a pressão intra-ocular através de um tonômetro de rebote. (B)Mudanças de PIO de um rato experimental após o tratamento a laser. Cada ponto representa a média de três conjuntos consecutivos de seis medições da pressão intra-ocular.
Figura 3. Diminuição da acuidade visual e sensibilidade ao contraste com a elevação da PIO. (A) Desenho esquemático da configuração optomotor. (B) Um rato na plataforma central no aparelho optomotor com grades exibidas em quatro monitores circundantes. (C) A acuidade e sensibilidade ao contraste do rato examinados na Figura 2B.
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Discussion
Descrevemos anteriormente que a hipertensão ocular sustentada pode ser induzida pela iluminação do laser em olhos de rato. Em comparação com o modelo de injecção de solução salina 18 e o modelo cautério veia 11 ambos os quais requerem extensivas técnicas de microcirurgia, a iluminação laser é relativamente simples e fácil de executar. Normalmente, podemos realizar a iluminação a laser para 4-6 ratos em 2-3 horas. Os passos fundamentais para alcançar elevação da PIO sustentado são a câmara anterior achatamento antes do laser e os parâmetros para a iluminação laser. Drenar o fluido na câmara anterior facilitou alvejar o laser para a área da rede trabecular e minimizar a lesão do corpo ciliar nas proximidades e vasos sanguíneos 6. Também foram relatados Diferentes tipos de lasers, por exemplo, alguns estudos utilizaram um laser de diodo com comprimentos de onda de 532 nm, 5,6 e outros utilizaram pulsos de energia 810 nm 7 para atingir a malha trabecular e veias episclerais no reg limboíons. A fim de maximizar o dano ângulo, aumentamos o número de pontos de laser em comparação com os modelos de laser previamente relatados 5-7. Com a nossa configuração experimental, quase todos os ratos tratados com laser foi mais de 50% de aumento da PIO na primeira semana após o tratamento com laser, entre os quais cerca de 60% tinham PIO elevada por mais de 2 meses. Por outro lado, uma injecção intra-ocular de micropérolas em olhos de rato pode provocar uma elevação ~ 30% da PIO para um par de semanas 8 (outro estudo sugeriu um efeito mais longo de elevação da PIO 9,10), e a oclusão das veias episcleral e límbicas em albino CD-1 camundongos apenas induziu uma elevação aguda da PIO por alguns dias 13.
A medição precisa da PIO é importante para determinar os efeitos do laser em tapetes olhos. Anestesia alterou significativamente a medição da PIO e treinamento comportamental de camundongos reduziu a variação da PIO em animais acordados 9,19. Aqui, os animais experimentais foram gIven alguns minutos para descansar e adaptar-se à posição contido antes da medição, a fim de obter leituras consistentes de PIO. Para confirmar a medida da PIO é fiável e não dependente da pessoa que efectua o ensaio, os mesmos animais foram examinados por dois ou três testadores diferentes e as suas diferenças de valores de Po são geralmente dentro de 5-15%.
Devido à variabilidade da duração e do grau de elevação da PIO, a perda de CGR diferente tem sido relatada em diferentes modelos animais. Por exemplo, uma perda de 20% dos axónios tem sido observado em olhos de rato com microesferas de injecção 8. Cerca de 20% das CGRs morreram nos olhos de ratos com seis semanas após a iluminação laser na malha trabecular, ao passo que cerca de 60% de CGRs morreu com iluminação do laser, tanto a rede trabecular e as veias episclerais 5. Os nossos dados mostraram uma perda de 20-30% do RGC aos 2 meses após o tratamento com laser em olhos de rato. No entanto, todos esses diferentes modelos animais de doenças crônicas ohipertensão damente sem inflamação e dano das partes dos olhos significativa nos fornecer o potencial para medir os efeitos de longo prazo da hipertensão ocular sobre a estrutura e função visual da retina ao longo do tempo.
Tomando vantagem da natureza não invasiva do ensaio comportamental visual que permite que os testes em série como uma função da mudança de condições, as alterações de acuidade visual e de sensibilidade de contraste pode ser monitorizada durante meses após a indução da hipertensão ocular. O teste optomotor fornece uma rápida avaliação da função visual e, além disso, os dois olhos pode ser testado em separado, o que facilita enormemente nossas experiências porque um olho do rato alvo é tratado com laser e o outro é deixado intacto como controlo. Ao mesmo tempo, é de notar que o reflexo optomotor às vezes é difícil de usar devido à elevada actividade e que passeiam atenção de alguns ratinhos 12.
Combinado com o poder do rato geneticacs, o modelo proporciona uma leitura soberba com a qual a investigar os mecanismos patológicos em alta tensão glaucoma. Por exemplo, utilizando murganhos Thy-1-YFP transgénicos, que tem um pequeno número de CGRs marcadas 10,20-22, as alterações estruturais dendríticas de CGRs individuais podem ser visualizados em olhos com hipertensão ocular sustentada. Nós demonstramos que a degeneração dendrítica de CGRs depende da localização e subtipos em olhos com hipertensão ocular 23. Apoptose celular ou vias de sinalização neuroprotectores podem ser ainda mais manipulados in vivo para identificar os mecanismos moleculares subjacentes à degeneração das CGR e a sobrevivência em pacientes com glaucoma.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Os autores são funcionários em tempo integral da Universidade de Northwestern.
Os autores não receberam financiamento que foi fornecida por empresas que produzem reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.
Acknowledgments
O trabalho contido neste artigo tem sido apoiada pelo Prêmio Johnson Dr. Douglas H. de Pesquisa Glaucoma da American Assistance Foundation Saúde (XL), o William & Mary Greve Scholar Award Especial da Investigação para Prevenir Cegueira (XL), o Illinois Sociedade para a Prevenção da Cegueira (HC) e NIH conceder R01EY019034 (XL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| moxifloxacin | Alcon Labs, Inc. | NDC 0065-4013-03 | 0.5 %, Rx only |
| Proparacaine Hydrochloride | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | 0.5 %, Rx only |
| Ophthalmic Solution USP | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | .5 %, Rx only |
| ketamine | Butler Schein Animal Health | NDC 11695-0550-1 | 100 mg / kg |
| xylazine | LLOYD Inc. of Iowa | NADA 139-236 | 10 mg / kg |
| atropine sulfate solution | Alcon Labs, Inc. | NDC 61314-303-02 | 1 %, Rx only |
| Equipment | |||
| Slit Lamp, TOPCON | Visual Systems Inc | SL-3E | powered by PS-30A |
| OptoMotry 1.8.0 virtual | CerebralMechanics Inc. | ||
| opto-kinetic testing system | CerebralMechanics Inc. | ||
| Tonometer, TonoLab, for mice | Colonial Medical Supply | ||
| Heating pad | Sunbeam Products Inc | 722-810 | |
| Argon laser | Coherent Inc | Ultima 2000SE | |
| DECAPICONE Plastic cone holder | Braintree Sci Inc. | MDC-200 | for mouse |
References
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