Summary
Хронический глазной гипертензии индуцируется с помощью лазерной фотокоагуляции трабекулярной сети в мышиных глаз. Внутриглазного давления (ВГД) повышается в течение нескольких месяцев после лазерного лечения. Снижение остроты зрения и контрастной чувствительности экспериментальных животных контролировали с помощью оптомоторных теста.
Abstract
Глаукома, часто связаны с повышенного внутриглазного давления (ВГД), является одной из ведущих причин слепоты. Мы стремились создать модель мыши глазной гипертензии, чтобы имитировать человека высоковольтных глаукомы. Здесь лазерное освещение применяется к лимба роговицы photocoagulate к оттоку, вызывая угол закрытия. Изменения ВГД контролировать с помощью возвратного тонометра до и после лазерной обработки. Оптомоторную поведенческих тестов используется для измерения соответствующие изменения в зрительной работоспособности. Представитель результат от одного мышь, которая разработала устойчивый ВГД высоте после освещения лазера. Снижение остроты зрения и контрастной чувствительности наблюдается в этом глазное гипертонической мыши. Вместе нашего исследования представляет ценный системе модель для изучения дегенерации нейронов и основные молекулярные механизмы в глаукоматозные мышей.
Protocol
Процедуры
C57BL/6J мышей (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) поднимаются на животный Учреждением Северо-Западного университета. Все животные используются в соответствии с протоколами, утвержденными Северо-Западного университета Уходу за животными и использованию комитета и соответствует рекомендации по использованию животных в области нейронаук от NIH.
1. Лазерная коагуляция
Процедура лазерная коагуляция изменяется от ранее опубликованных протоколов 5-7.
- Обезболить 40-60 день старая мышь внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг / кг, Шейн Батлер здоровья животных, OH) и ксилазина (10 мг / кг, Ллойд Инк Айова, Шенандоа, IA).
- Расширить зрачок правого глаза экспериментальных животных на местное лечение с одной или двух капель 1% раствора атропина сульфата (Alcon Labs, Inc, Fort Worth, TX).
- После расширения зрачка, распрямитеnterior камеры для повышения лазерной индукции 6. Вставьте стекло микропипетки с острым наконечником (Всемирного Precision Instruments Inc, Сарасоте, штат Флорида) в переднюю пространство под щелевой лампой (SL-3E, Topcon, Окленд, штат Нью-Джерси), чтобы слить жидкость в передней камере.
- Задержите мышь в пластиковый держатель конуса (Braintree Научно Инк, MA) и связали на домашней платформы (см. рисунок 1а). Держите мышь с фиксатор и выставляет правый глаз мыши, чтобы источник света за щелевой лампой. Совместите правый глаз под наркозом мыши под щелевой лампой.
- Удерживая кнопку мыши фиксатор с обеих рук, применять лазерное освещение для лимба роговицы использованием аргонового лазера (Ultima 2000SE, последовательной, Санта-Клара, Калифорния). Доставка около 80-100 лазерного пятна (514 нм, 100 мВт, 50 мс импульс и 200 мкм месте) перпендикулярно по окружности трабекулярной сети. Мыши C57BL / 6 имеют пигментированные диафрагмой, которая служит в качестве барьера для любых рotential бродячих энергии 7.
- Привить актуальные моксифлоксацин 0,5% (Alcon Labs, Inc, Fort Worth, TX) на поверхности глазного яблока для дезинфекции обработанного лазером области и 0,5% пропаракаина (Bausch & Lomb, Рочестер, Нью-Йорк), чтобы уменьшить боль.
- Держите животное на грелку (Sunbeam Products Inc, Бока-Ратон, штат Флорида) для восстановления около часа, пока она не полностью проснулся.
- Левый глаз необработанными, чтобы служить в качестве контроля.
2. Измерение ВГД
- Наведите мышь проснулась в трубку для загрузки в пластиковый держатель конуса, а затем удержать его на платформе (см. рисунок 2А).
- Разрешить 9:55 минут, чтобы мышь адаптироваться к держателю положение. Подойдите к возвратным тонометром (TonoLab, колониальным Medical Supply, Франконии, Нью-Хэмпшир), чтобы мыши глаза, пока зонд не в 2-3 мм от поверхности роговицы 14.
- Нажмите кнопку измерения, чтобы зонд попал в центр поверхностироговицы мягко. Три последовательных серий шести измерений ВГД на тот же глаз приобретаются и среднее для ВГД на глазу. Необработанный контрольный глаз всегда измеряется первым получить базовые чтения для обработанного лазером глаз, которая измеряется следующим.
3. Оптомоторную испытаний
Острота зрения и контрастная чувствительность тестируются 14,15. Два глаза отдельных мышей рассматриваются отдельно в обратном направлении дрейфа решетки; т.е. часовой дрейфующих решетка используется для идентификации зрительной функции левого глаза и против часовой стрелки дрейфующих решетка для правого глаза 16. Каждый тест занимает около 15 минут и повторяется два независимых наблюдателей.
- Наведите и позволяет мыши свободно перемещаться на возвышении окружена четырьмя компьютерными мониторами (рис. 3А-B).
- Настройка мониторов таким образом, что они специально выводить горизонтально дрейфующих синусоидальнойрешетки как визуальные стимулы с средней яркости 39 кд / м 2. Направление движения решетка должна чередоваться между последовательно по часовой стрелке и против часовой стрелки.
- Анализ движения животного. Движений животного в-концерт с дрейфующей решетки считаются "позитивный" в течение 15 секунд после визуального стимула и затем постепенно увеличивается. Наибольшее ответа вызывая визуального стимула определяется как острота зрения животного 17.
- Изучите контрастной чувствительности в трех предварительно выбранных пространственных частот: 0,075, 0,16 и 0,3 циклов на градус (CPD). Порог контрастности для каждого глаза определяется как низкий контраст, который вызывает визуальный ответов на заранее фиксированной частотой. Контрастной чувствительности является обратной величиной порога 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как описано в процедурах, лазерная подсветка направлена на трабекулярной сети в регионе лимбальных photocoagulate оттоку, вызывая угол закрытия (рис. 1). Большинство лазером глаза не проявляли значительный физический ущерб, отряд пигмента или инфекции, в соответствии с предыдущими выводами 6. Когда небольшая группа мышей (менее 5% всех животных лазером) выставлены физические признаки серьезных повреждений, таких как спущенный глазные яблоки, тяжелая катаракта, значительным отрядом пигмента, или кровотечение, мы эвтаназии их немедленно. Около 30% лазером глаза разработаны незначительные роговицы рубцов, и большинство из них восстановлены в течение 1-2 недель после лазерной обработки.
Мы обнаружили повышенное IOP почти во всех обработанных лазером глаза от более чем сто мышей. IOP экспериментальных животных осуществляется с использованием возвратного тонометра (рис. 2). Фиг.2В показан пример изменения яОП до и после лазерной обработки. Перед лазерным лечением, ВГД базах два глаза мыши не показали никакой разницы: 15,7 мм (справа) против 14,7 мм (левый, день 0, рис. 2В). Через семь дней после лазерной обработки, ВГД обработанной (справа) глаз увеличилось почти в 2 раза до 30,7 мм, по сравнению с необработанным глазом (15,7 мм). IOP из обработанного лазером глаз оставались повышенными на 26-28 мм рт.ст. в течение около 4 месяцев: через 4 мес после лечения среднее ВГД обработанной глаз был 26 мм, что значительно выше, чем у необработанной левого глаза (16,3 мм). Впоследствии, ВГД на очищенных глаз медленно снизилась и достигла 18,7 мм рт.ст. в течение 6 месяцев (24 недель) после лечения (необработанная глаза: 15,3 мм ртутного столба). Наши данные показывают, что устойчивое повышение ВГД на достигается в течение более 4 месяцев.
Затем мы подтвердили потерю зрения использования оптомоторную испытания (рис. 3). Оптомоторную тест измеряет аспекты пространственного видения через рефлексивные голова-TRиспользованием ACK движений. Фиг.3С показано снижение остроты зрения животного рассмотрены на рисунке 2B. Перед лазерной обработки, оба глаза выставлены нормального зрения (Слева: 0,375 CPD; Справа: 0,397 CPD, рисунок 3в). В два месяца после лечения лазером, острота зрения правого глаза (повышение ВГД) значительно снизилась по сравнению с левым глазом управления (Влево: 0.45 CPD; Справа: 0,228 CPD, рисунок 3в). Острота глаза с повышенным ВГД оставалась на низком уровне 5-6 месяца после лечения лазером (Слева: 0,378 CPD; Справа:. 0 258 CPD, рисунок 3в). Аналогично, нижний контрастной чувствительности правого глаза с повышенным ВГД наблюдалось (рис. 3D). В два месяца после лечения лазером, контрастной чувствительности управления левый глаз был 6,13, в то время как правый глаз был 1,91 на 0,075 ДСП. Контрастной чувствительности управления левым глазом был 5,53 и 2,67 на 0,16 и 0,3 CPD, в то время как правый глаз был 4,28 и 1.45, соответственно (фиг. 3D).
Рисунок 1. Лазерная фотокоагуляция оттоку юмора в глаза мышей. (A) фотографию щелевой лампы для лазерного лечения. Оператор держит мышь с фиксатор, а затем выравнивает правый глаз мышь, чтобы источник света щелевой лампы. (BC) Схема вид сбоку и вид спереди части глаза. Оператор держит мышь фиксаторы с обеих рук в то время как 80-100 пятна лазерного наносятся на область между эписклеральной вен и расширение зрачка.
Рисунок 2. IOP увеличилось после лазерного лечения. (A) Установка для измерения ВГД использованием возвратного тонометра. (B)Изменения ВГД на одной экспериментальной мыши после лазерного лечения. Каждая точка соответствовала среднему из трех последовательных серий шести измерений ВГД.
Рисунок 3. Снижение остроты зрения и контрастной чувствительности с повышением ВГД. (А) Схематическое изображение оптомоторную установки. (B) мыши на центральной платформе в оптомоторную аппарат с решетками отображаться на четырех окружающих мониторов. (C) зрения и контрастной чувствительности у мышей исследовали на фиг.2В.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы сообщаем, что устойчивый выше глазной гипертензии может быть вызвано лазерного излучения на мышах глаз. По сравнению с моделью солевые инъекции 18 и модель вены прижигания 11 оба из которых требуют обширные навыки микрохирургических, лазерный освещения является относительно простым и легким для выполнения. Обычно мы можем выполнить лазерное освещение для 4-6 мышей в 2-3 часов. Важные шаги для достижения устойчивого ВГД высота являются уплощение передней камеры до лазера и параметров лазерного излучения. Слив из жидкости в передней камере способствует целевому лазер Площадь губчатой сеткой и свести к минимуму травмы прилегающих цилиарного тела и кровеносных сосудов 6. Различные виды лазерной Сообщалось также, например, в некоторых исследованиях использовали диодный лазер с длиной волны 532 нм 5,6 и другие использовали 810 нм импульсы энергии 7 целевому трабекулярной сети и эписклеральной вен в лимбальных региона. В целях максимального угла повреждения, мы увеличили число лазерных пятна по сравнению с предыдущим отчетным лазерных моделей 5-7. С нашей экспериментальной установки, почти каждый обработанный лазером мышь имела более чем 50%-ное увеличение ВГД в первую неделю после лазерной обработки, среди которых около 60% из них повышенным ВГД более чем на 2 месяца. В противоположность этому, один внутриглазной инъекции микросфер в мышиные глаза может вызвать ~ 30% высоты ВГД в течение нескольких недель 8 (другой исследование показало более длительный эффект ВГД высота 9,10) и окклюзии лимбальных и эписклеральной вены в альбинос CD-1 мышей только индуцированного острого высота ВГД на несколько дней 13.
Точное измерение ВГД играет важную роль в определении лазерные эффекты при наведении мыши глазами. Анестезия значительно изменили измерения ВГД и поведенческий тренинг мышей уменьшить ВГД изменения бодрствующих животных 9,19. Здесь, экспериментальные животные были гИвен несколько минут, чтобы отдохнуть и адаптироваться к сдержанную позицию перед измерением для того, чтобы получить устойчивые показания ВГД. Для подтверждения измерения ВГД надежна и не зависит от человека, который выполнил тест, тех же животных были рассмотрены два или три различных тестеров и их различия показаний ВГД, как правило, в пределах 5-15%.
Из-за изменчивости от продолжительности и степени повышения ВГД, различные RGC потери сообщалось на различных животных моделях. Например, 20% потере аксонов наблюдали у мышей глаза с инъекцией микросферы 8. Около 20% РГК умер в глаза крысы через шесть недель после лазерного освещения в трабекулярной сети, в то время как около 60% РГК умер с лазерным освещением как на трабекулярной сети и эписклеральной вены 5. Наши данные показали 20-30% РГК потери в 2 месяца после лазерного лечения в мышиных глаз. Тем не менее, все эти различные животные модели хронического ососудистой гипертензией без значительного воспаления или повреждения других частей глаза обеспечивают нам возможность измерить долгосрочные последствия глазной гипертензии на структуры сетчатки и зрительных функций с течением времени.
Воспользовавшись неинвазивной природы визуального поведенческого анализа, который позволяет последовательных испытаний в зависимости от изменяющихся условий, изменение остроты зрения и контрастной чувствительности можно контролировать в течение нескольких месяцев после индукции глазной гипертензии. Оптомоторную тест дает экспресс-оценки состояния зрительных функций, кроме того, два глаза могут быть проверены по отдельности, что значительно облегчает наши эксперименты, потому что один глаз целевой мышь лазерного лечения, а другой остается нетронутым в качестве контрольной. В то же время, следует отметить, что оптомоторных рефлекс иногда трудно использовать из-за высокой активностью и блуждающий внимание некоторых мышей 12.
В сочетании с силой мыши генетическиCS, наша модель обеспечивает превосходное считывание с которой исследовать патологические механизмы в высоковольтной глаукомы. Например, при использовании Thy-1-YFP трансгенных мышей, который имеет небольшое количество РСК помечены 10,20-22, дендритные структурных изменений отдельных РСК могут быть отображены в глаза с устойчивой глазной гипертензии. Мы показали, что дендритные дегенерации РГК зависит от расположения и подтипы в глазных гипертонический глаз 23. Апоптоз клеток или нейропротекторное сигнальные пути могут быть дополнительно манипулировать в естественных условиях, чтобы определить основные молекулярные механизмы RGC дегенерации и выживаемость при глаукоме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Авторами являются штатными сотрудниками Северо-Западного университета.
Авторы не получили финансирования, который был предоставлен компании, которые производят реактивы и инструменты, используемые в этой статье.
Acknowledgments
Работы, содержащиеся в этой статье была поддержана д-р Дуглас Х. Джонсон премии за научные исследования глаукомы от американского здравоохранения Фонд Содействия (XL), Уильям и Мэри Греве Специальный приз ученый из исследования, чтобы предотвратить слепоту (XL), Иллинойс общество по предотвращению слепоты (HC) и NIH грант R01EY019034 (XL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| moxifloxacin | Alcon Labs, Inc. | NDC 0065-4013-03 | 0.5 %, Rx only |
| Proparacaine Hydrochloride | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | 0.5 %, Rx only |
| Ophthalmic Solution USP | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | .5 %, Rx only |
| ketamine | Butler Schein Animal Health | NDC 11695-0550-1 | 100 mg / kg |
| xylazine | LLOYD Inc. of Iowa | NADA 139-236 | 10 mg / kg |
| atropine sulfate solution | Alcon Labs, Inc. | NDC 61314-303-02 | 1 %, Rx only |
| Equipment | |||
| Slit Lamp, TOPCON | Visual Systems Inc | SL-3E | powered by PS-30A |
| OptoMotry 1.8.0 virtual | CerebralMechanics Inc. | ||
| opto-kinetic testing system | CerebralMechanics Inc. | ||
| Tonometer, TonoLab, for mice | Colonial Medical Supply | ||
| Heating pad | Sunbeam Products Inc | 722-810 | |
| Argon laser | Coherent Inc | Ultima 2000SE | |
| DECAPICONE Plastic cone holder | Braintree Sci Inc. | MDC-200 | for mouse |
References
- Gupta, N., Yucel, Y. H. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr. Opin. Ophthalmol. 18, 110-114 (2007).
- Quigley, H. A. Neuronal death in glaucoma. Prog. Retin. Eye Res. 18, 39-57 (1999).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, 816-824 (2009).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. J. Glaucoma. 16, 483-505 (2007).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 402-410 (2002).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 4314-4320 (2003).
- Grozdanic, S. D. Laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4337-4346 (2003).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative ophthalmology & visual science. 51, 207-216 (2010).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Experimental Eye Research. 92, 512-520 (2011).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3847-3857 (2012).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61, 379-382 (1995).
- Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. J. Vis. Exp. (10), e549 (2007).
- Fu, C. T., Sretavan, D. Laser-induced ocular hypertension in albino CD-1 mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 980-990 (2010).
- Rangarajan, K. V. Detection of visual deficits in aging DBA/2J mice by two behavioral assays. Curr. Eye Res. 36, 481-491 (2011).
- Wang, L., et al. Direction-specific disruption of subcortical visual behavior and receptive fields in mice lacking the beta2 subunit of nicotinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 29, 12909-12918 (2009).
- Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22, 677-684 (2005).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 4611-4616 (2004).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64, 85-96 (1997).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 99, 27-35 (2012).
- Liu, X., et al. Brain-derived neurotrophic factor and TrkB modulate visual experience-dependent refinement of neuronal pathways in retina. J. Neurosci. 27, 7256-7267 (2007).
- Liu, X., et al. Regulation of neonatal development of retinal ganglion cell dendrites by neurotrophin-3 overexpression. The Journal of Comparative Neurology. 514, 449-458 (2009).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. The Journal of Comparative Neurology. 451, 115-126 (2002).
- Feng, L., et al. Sustained Ocular Hypertension Induces Dendritic Degeneration of Mouse Retinal Ganglion Cells that Depends on Cell-type and Location. Investigative Ophthalmology & Visual Science. , (2013).
