Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En Laser-inducerad musmodell av kronisk okulär hypertension för att karaktärisera synfel

doi: 10.3791/50440 Published: August 14, 2013

Summary

Kronisk okulär hypertension induceras med laserfotokoagulation av trabekelverket i mus ögon. Den intraokulära trycket (lOP) är förhöjd i flera månader efter laserbehandling. Minskningen av synskärpa och kontrastkänslighet av försöksdjur övervakas med användning av optomotor testet.

Abstract

Glaukom, ofta förenat med förhöjt intraokulärt tryck (lOP), är en av de främsta orsakerna till blindhet. Vi försökte etablera en musmodell av okulär hypertension för att efterlikna människans hög spänning glaukom. Här laserbelysning appliceras på hornhinnans limbus att photocoagulate det vattenhaltiga utflödet, inducera glaukom. Förändringarna i lOP övervakas med hjälp en rekyl tonometer före och efter laserbehandling. En optomotor beteendemässiga test används för att mäta motsvarande förändringar i visuell kapacitet. Den representativa resultat från en mus som utvecklade ihållande IOP höjd efter laserbelysning visas. En försämrad synskärpa och kontrast känslighet observeras i denna okulära hypertensiva mus. Tillsammans, introducerar vår studie en värdefull modell för att undersöka neuronal degeneration och de bakomliggande molekylära mekanismerna i glaukomatösa möss.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Förfaranden

C57BL/6J-möss (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) höjs vid Northwestern University Animal Care Facility. Alla djur används i enlighet med protokoll som godkänts av Northwestern University Institutional Animal Care och användning kommittén och överensstämmer med riktlinjerna för användning av djur i NeuroscienceForskning från NIH.

Ett. Laserfotokoagulation

Förfarandet i laserfotokoagulation är modifierad från tidigare publicerade protokollen 5-7.

  1. Söva en 40-60 dag gammal mus genom en intraperitoneal injektion av ketamin (100 mg / kg, Butler Schein djurhälsa, OH) och xylazin (10 mg / kg, Lloyd Inc. i Iowa, Shenandoah, IA).
  2. Vidga pupillen i höger öga i försöksdjurens genom topikal behandling med en eller två droppar 1% atropinsulfat lösning (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX).
  3. Efter mydriasis, platta till ennterior kammare att öka laser induktion 6. Sätt i en glasmikropipett med vass spets (World Precision Instruments Inc, Sarasota, FL) in i den främre utrymmet under spaltlampa (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ) för att tappa ut vätskan i den främre kammaren.
  4. Håll fast mus i en plastmembran hållaren (Braintree Sci Inc., MA) och bundna på en hemlagad plattform (se figur 1A). Håll musen med restrainer och exponerar det högra ögat på musen till ljuskällan bakom spaltlampa. Justera det högra ögat av sövda mus under spaltlampa.
  5. Håll musen restrainer med båda händerna, applicera laserbelysning på hornhinnans limbus med en Argon laser (Ultima 2000SE, sammanhängande, Santa Clara, CA). Deliver ca 80-100 laserfläckar (514 nm, 100 mW, 50 ms puls, och 200 ^ m spot) vinkelrätt runt omkretsen av det trabekulära nätverket. De C57BL / 6 möss har pigmenterad iris som fungerar som en barriär för alla potential herrelösa energi 7.
  6. Instill topisk 0,5% moxifloxacin (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX) på den okulära ytan att desinficera laser-behandlade området och 0,5% proparakain (Bausch & Lomb, Rochester, NY) för att lindra smärta.
  7. Håll djuret på en värmedyna (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) för återhämtning för ungefär en timme tills det är fullt vaken.
  8. Det vänstra ögat är obehandlad för att tjäna som en kontroll.

2. LOP Mätningar

  1. Placera vaken musen i ett rör för att lasta in i plasten konen hållaren och sedan hålla den på plattformen (se Figur 2A).
  2. Låt fem till tio minuter för att låta musen får anpassas till innehavaren positionen. Närma rebound tonometern (TonoLab, Colonial Medical Supply, Franconia, NH) till musen ögat tills sondspetsen är 2-3 mm från ytan av hornhinnan 14.
  3. Tryck mätningen för att låta probespetsen tryck på mitten ytanav hornhinnan försiktigt. Tre på varandra följande uppsättningar av sex-mätningar av lOP av samma öga förvärvas och som medelvärde IOP i ögat. Den obehandlade kontrollen ögat mäts alltid först för att få en baslinje läsning för laser-behandlade ögat som mäts nästa.

Tre. Optomotor Test

Synskärpa och kontrast känslighet testas 14,15. De två ögon individuella möss betraktade separat genom omkastning av drivande gittret riktning, det vill säga en medurs drivande gitter används för att identifiera den visuella funktionen för vänster öga och en moturs drivande gittret för det högra ögat 16. Varje test tar ca 15 minuter och upprepas med två observatörer oberoende.

  1. Placera musen och gör musen att röra sig fritt på en upphöjd plattform omgiven av fyra datorskärmar (Figur 3A-B).
  2. Sätt upp skärmar så att de visar horisontellt drifting sinusformadgaller som visuella stimuli med genomsnittlig luminans av 39 cd / m 2. Den rörliga riktningen hos gittret ska växla konsekutivt mellan medurs och moturs.
  3. Analysera djurets rörelser. Djurets rörelser i-konsert med de drivande gitter anses "positiva" inom 15 sekunder efter den visuella stimulansen är på och sedan öka successivt. Den högsta respons-eliciting visuell stimulans definieras som djurets synskärpa 17.
  4. Undersök kontrasten känslighet vid tre förvalda rymdfrekvenser: 0,075, 0,16 och 0,3 cykler per grad (CPD). Kontrasten tröskeln för varje öga är definierad som den lägsta kontrasten som framkallar visuella svar på förhand bestämd frekvens. Kontrasten känslighet är det reciproka värdet av tröskelvärdet 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Som beskrivits i förfarandena, är laserbelysning syftar trabekelverket i limbus regionen att photocoagulate den vattenbaserade utflödet, förmå glaukom (Figur 1). Mest lasered ögon uppvisade ingen signifikant fysiska skador, pigment lossnar eller infektion, vilket överensstämmer med tidigare fynd 6. När en liten grupp av möss (mindre än 5% av alla lasered djur) uppvisade fysiska tecken på allvarliga skador såsom tömda öga bollar, svår katarakt, betydande pigment avskildhet, eller blödning, avlivades vi dem omedelbart. Omkring 30% av lasered ögon utvecklade smärre hornhinnan ärr, och de flesta av dem återvinns inom 1-2 veckor efter laserbehandling.

Vi hittade förhöjt IOP i nästan varje laser-behandlade ögon från mer än hundra möss. Den IOP hos försöksdjur övervakas med en rekyl tonometer (Figur 2). Figur 2B visar ett exempel på de förändringar jagOP före och efter laserbehandling. Före laserbehandlingen visade lOP baslinjer de två ögonen på musen ingen skillnad: 15,7 mmHg (höger) jämfört med 14,7 mmHg (vänster, Dag 0, Figur 2B). Sju dagar efter laser-behandling, ökade lOP hos det behandlade (höger) öga nästan 2-faldigt till 30,7 mmHg, jämfört med det obehandlade ögat (15,7 mm Hg). Den IOP av laser-behandlade ögat fortsatt hög på 26-28 mmHg i ca 4 månader: vid 4 månader efter behandling, var den genomsnittliga trycksänkande av behandlade ögat 26 mmHg, betydligt högre än för obehandlade vänstra öga (16,3 mmHg). Minskade därefter IOP hos det behandlade ögat långsamt och nådde 18,7 mmHg vid 6 månader (24 veckor) efter behandling (obehandlade ögat: 15,3 mmHg). Våra data visar att ihållande IOP höjd har nåtts i mer än 4 månader.

Vi bekräftade nästa visionen förlust med optomotor provet (Figur 3). De optomotor test mäter aspekter av rumsliga visionen via reflexiva head-trAcking rörelser. Fig. 3C visar minskningen av synskärpan hos djuret undersökas i figur 2B. Innan laser-behandling, uppvisade båda ögonen normal synskärpa (Vänster: 0,375 CPD, Höger: 0.397 CPD, figur 3C). Vid två månader efter laserbehandling, minskade synskärpa på höger öga (förhöjt IOP) signifikant jämfört med den vänstra kontrollen ögat (Vänster: 0,45 CPD, Höger: 0.228 CPD, figur 3C). Den synskärpa av ögat med förhöjt IOP fortsatt låg 5-6 månader efter laserbehandling (Vänster: 0,378 CPD, Höger:. 0 258 CPD, figur 3C). På liknande sätt var en lägre kontrast känslighet höger öga med förhöjt lOP observerades (Figur 3D). Vid två månader efter laserbehandling, lämnade kontrasten känslighet kontroll ögat var 6.13, medan det högra ögat var 1,91 på 0,075 CPD. Kontrasten känslighet kontroll vänstra öga var 5,53 och 2,67 vid 0,16 och 0,3 CPD, medan det högra ögat var 4,28 och 1.45, respektive (Figur 3D).

Figur 1
Figur 1. Laserfotokoagulation av kammarvatten utflöde i mus ögon. (A) Ett foto av spaltlampan för laserbehandling. Operatören håller musen med restrainer och sedan justerar det högra ögat på musen för att ljuskällan i spaltlampan. (BC) Schematisk side-view och front-vy av ögat. Operatören håller musen restrainers med båda händerna medan 80-100 laserfläckar tillämpas på området mellan episklerala vener och dilaterade elev.

Figur 2
Figur 2. IOP ökade efter laserbehandling. (A) Installationsprogrammet att mäta IOP med en rebound tonometer. (B)Förändringar av IOP av en experimentell mus efter laserbehandling. Varje punkt är medelvärdet av tre uppsättningar av sex mätningar av IOP.

Figur 3
Figur 3. Minskningar av synskärpa och kontrast känslighet med IOP höjd. (A) Schematisk ritning av optomotor installationen. (B) En mus i mitten plattform i optomotor apparaten med galler som visas på fyra omgivande monitorer. (C) Den skärpa och kontrast känslighet av mus undersöktes i figur 2B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi rapporterar över den ihållande okulär hypertension kan induceras genom laserbelysning i mus ögon. Jämfört med den injektion av koksaltlösning modellen 18 och venen cautery modell 11 som båda kräver omfattande mikrokirurgiska färdigheter är laserbelysning relativt enkel och lätt att utföra. Vanligtvis kan vi utföra laserbelysning för 4-6 möss i 2-3 timmar. De kritiska stegen för att uppnå uthållig IOP höjd är den främre kammaren plattas innan laser och parametrarna för laserbelysning. Avtappning ut vätskan i den främre kammaren underlättas att rikta lasern till det trabekulära nätverket området och minimera skada på närliggande ciliarkroppen och blodkärl 6. Olika typer av laser har också rapporterats, till exempel, använde vissa studier en diodlaser med våglängden 532 nm 5,6 och andra använde 810 pulser nm energi 7 för att rikta trabekelverket och episklerala vener i limbala regjon. För att maximera den vinkeln skador, har vi ökat antalet laserfläckar jämfört med de tidigare rapporterade lasermodeller 5-7. Med vår experimentuppställning, hade nästan varje laser-behandlad mus mer än 50% ökning av IOP genom den första veckan efter laserbehandlingen, bland vilka ca 60% hade förhöjt IOP för mer än 2 månader. Däremot kan en intraokulär injektion av mikrokorn in mus ögon framkalla en ~ 30% förhöjning i IOP för ett par veckor 8 (annan studie antydde en längre effekt av IOP höjd 9,10), och ocklusion av limbus och episklerala vener i albino CD-1-möss inducerade endast en akut IOP höjd för ett par dagar 13.

En noggrann mätning av IOP är viktigt vid bestämning av laser effekter på mus ögon. Anestesi förändrats avsevärt IOP mätning och beteendevetenskaplig utbildning av möss minskade IOP variation i vakna djur 9,19. Här var de försöksdjur gIven några minuter för att vila och anpassa sig till den återhållsamma läge innan mätningen för att få konsekventa avläsningar av IOP. För att bekräfta IOP mätningen är tillförlitlig och inte beroende av den person som utfört testet, var samma djur granskas av två eller tre olika testare och deras olikheter i IOP avläsningar är generellt inom 5-15%.

På grund av variationen av varaktighet och graden av IOP höjd, har olika RGC förlust rapporterats i olika djurmodeller. Till exempel har en 20% förlust av axoner observerats i mus ögon med mikrokorn injektion 8. Omkring 20% av RGC dog i råtta ögon på sex veckor efter laserbelysning på trabekelverket, medan cirka 60% av RGC dog med laserbelysning både trabekelverket och episklerala vener 5. Våra data visade en 20-30% av RGC förlust på 2 månader efter laserbehandling i mus ögon. Trots alla dessa olika djurmodeller av kronisk oCular hypertoni utan signifikant inflammation eller skada på andra delar av ögonen ger oss möjligheten att mäta de långsiktiga effekterna av okulär hypertension på retinal struktur och visuell funktion över tiden.

Dra nytta av den icke-invasiv art visuella beteende analys som möjliggör seriella tester som en funktion av ändrade förhållanden, kan förändringar i synskärpa och kontrast känslighet övervakas i månader efter induktion av okulär hypertension. Den optomotor test ger en snabb bedömning av visuell funktion, och för övrigt kan de två ögonen provas separat, vilket avsevärt underlättar våra experiment eftersom ett öga på målet musen är laser-behandlad och den andra är kvar intakt som kontroll. Samtidigt, kan det noteras att den optomotor reflex ibland är svårt att använda på grund av den höga aktiviteten och vandrande uppmärksamhet några möss 12.

Kombinerat med kraften av mus genetisktcs, ger vår modell ett utmärkt avläsning som att undersöka sjukdomsmekanismer i hög spänning glaukom. Till exempel, med användning av Thy-1-YFP transgena möss, som har ett litet antal av RGC märkta 10,20-22, kan de dendritiska strukturella förändringar av enskilda RGC skall avbildas i ögonen med fördröjd okulär hypertension. Vi har visat att dendritiska degeneration av RGC beror på läge och undertyper i okulära hypertensiva ögon 23. Cellapoptos eller neuroprotektiva signalvägar kan manipuleras ytterligare in vivo för att identifiera de bakomliggande molekylära mekanismerna för RGC degeneration och överlevnad vid glaukom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Författarna är heltidsanställda av Northwestern University.

Författarna fick ingen finansiering som tillhandahålls av företag som producerar reagens och instrument som används i den här artikeln.

Acknowledgments

Arbetet i denna uppsats har stöd av Dr Douglas H. Johnson Award för Glaukom Research från American Health Assistance Foundation (XL), William & Mary Greve Special Scholar Award från Forskning kring att förebygga blindhet (XL), den Illinois Society för förebyggande av blindhet (HC) och NIH bidrag R01EY019034 (XL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
moxifloxacin Alcon Labs, Inc. NDC 0065-4013-03 0.5 %, Rx only
Proparacaine Hydrochloride Bausch Lomb NDC 24208-730-06 0.5 %, Rx only
Ophthalmic Solution USP Bausch Lomb NDC 24208-730-06 .5 %, Rx only
ketamine Butler Schein Animal Health NDC 11695-0550-1 100 mg / kg
xylazine LLOYD Inc. of Iowa NADA 139-236 10 mg / kg
atropine sulfate solution Alcon Labs, Inc. NDC 61314-303-02 1 %, Rx only
Equipment
Slit Lamp, TOPCON Visual Systems Inc SL-3E powered by PS-30A
OptoMotry 1.8.0 virtual CerebralMechanics Inc.
opto-kinetic testing system CerebralMechanics Inc.
Tonometer, TonoLab, for mice Colonial Medical Supply
Heating pad Sunbeam Products Inc 722-810
Argon laser Coherent Inc Ultima 2000SE
DECAPICONE Plastic cone holder Braintree Sci Inc. MDC-200 for mouse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupta, N., Yucel, Y. H. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr. Opin. Ophthalmol. 18, 110-114 (2007).
  2. Quigley, H. A. Neuronal death in glaucoma. Prog. Retin. Eye Res. 18, 39-57 (1999).
  3. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, 816-824 (2009).
  4. Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. J. Glaucoma. 16, 483-505 (2007).
  5. Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 402-410 (2002).
  6. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 4314-4320 (2003).
  7. Grozdanic, S. D. Laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4337-4346 (2003).
  8. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative ophthalmology & visual science. 51, 207-216 (2010).
  9. Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Experimental Eye Research. 92, 512-520 (2011).
  10. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3847-3857 (2012).
  11. Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61, 379-382 (1995).
  12. Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. J. Vis. Exp. (10), e549 (2007).
  13. Fu, C. T., Sretavan, D. Laser-induced ocular hypertension in albino CD-1 mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 980-990 (2010).
  14. Rangarajan, K. V. Detection of visual deficits in aging DBA/2J mice by two behavioral assays. Curr. Eye Res. 36, 481-491 (2011).
  15. Wang, L., et al. Direction-specific disruption of subcortical visual behavior and receptive fields in mice lacking the beta2 subunit of nicotinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 29, 12909-12918 (2009).
  16. Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22, 677-684 (2005).
  17. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 4611-4616 (2004).
  18. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64, 85-96 (1997).
  19. Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 99, 27-35 (2012).
  20. Liu, X., et al. Brain-derived neurotrophic factor and TrkB modulate visual experience-dependent refinement of neuronal pathways in retina. J. Neurosci. 27, 7256-7267 (2007).
  21. Liu, X., et al. Regulation of neonatal development of retinal ganglion cell dendrites by neurotrophin-3 overexpression. The Journal of Comparative Neurology. 514, 449-458 (2009).
  22. Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. The Journal of Comparative Neurology. 451, 115-126 (2002).
  23. Feng, L., et al. Sustained Ocular Hypertension Induces Dendritic Degeneration of Mouse Retinal Ganglion Cells that Depends on Cell-type and Location. Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2013).
En Laser-inducerad musmodell av kronisk okulär hypertension för att karaktärisera synfel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects. J. Vis. Exp. (78), e50440, doi:10.3791/50440 (2013).More

Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects. J. Vis. Exp. (78), e50440, doi:10.3791/50440 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter