Summary
ショウジョウバエは、アルコールに対する行動反応の細胞および分子基盤を解剖するための重要なモデル系として浮上している。ここでは、簡単に他の実験に適用することができ、学部、研究に適してい概日文脈におけるアルコール感度データの収集のためのプロトコルを提示する。
Abstract
ショウジョウバエ（ ショウジョウバエ ） は 、アルコール研究とサーカディアン生物学の両方のために確立されたモデルである。最近、我々は体内時計がアルコール感受性ではなく、耐性の形成を調節することが示された。ここでは詳細に我々のプロトコルについて説明します。アルコールはフライバーを使ってハエに投与される。このセットアップでは、飽和アルコール蒸気が設定割合で加湿された空気と混合され、同時に4本のチューブ中のハエに投与する。ハエは、反復間の変動を最小にするために標準化された条件下で飼育されている。異なる遺伝子型又は治療の三日齢のハエは、好ましくは、直接比較を可能とする2つの異なる時点（ 例えば 、CTおよびCT 17 5）のハエを照合することによって、実験に使用されている。実験中、ハエはアルコール蒸気と反射（LORR）を立ち直りの損失を示すハエの数が予め決めパーセンテージに1時間さらされているか、SEDATIONは5分毎にカウントされます。データは、3つの異なる統計的アプローチを用いて分析することができる。最初は、ハエの50％が彼らの立ち直り反射を失い、有意差が時間点の間に存在するかどうかを決定するために分散分析（ANOVA）を使用していた時刻を決定することである。二つ目はANOVA分析に続いて、指定した時間（分）、後にLORRを示し割合ハエを決定することです。最後の方法は、多変量統計を使用して全体の時系列を分析することである。プロトコルはまた、遺伝子型間の非概実験や比較のために使用することができる。
Introduction
キイロショウジョウバエこの薬2,3に対する人間の応答に類似して、アルコール1に対して二相性の行動反応を示しています。 、および鎮静（応答における運動活性の完全な欠如：アルコールの低濃度への初期暴露されると、運動協調性の欠如、姿勢制御の喪失と立ち直り反射（LORR立ち直り反射の消失）に置き換えられ、展示増加自発運動を飛ぶアルコールへの暴露のような）機械的刺激には4-9進行する。内因性の概日時計は、マウス10,11、ラット12で観察されたように、アルコール感受性と毒性の強い変調器であり、13の人間。 ショウジョウバエ研究の最近の進歩により、体内時計が急性アルコール感受性ではなく、アルコール耐性1を変調を示している。突然変異体の研究と空間のトランスジェニック操作によりショウジョウバエで利用できる強力な遺伝的アプローチおよび時間的な遺伝子発現は、複雑な動作の基礎となる細胞および分子メカニズムを識別するの急速な進歩を可能にするシステムを提供する。調査ツールとしてのショウジョウバエの使用が急速に哺乳類14〜16に変換することができ、アルコール神経生物学を理解する上で実質的な進歩を可能にした。概日時計は、アルコール感受性を調節する分子メカニズムを介しての理解を容易にかつ均一に概日時点横切っ行動応答、暗赤色光の条件下で使用するのに適したアルコール投与プロトコルを測定するために必要とされる。 ショウジョウバエでは、アルコールは、慢性的暴露、または確実に急性曝露のための蒸気の形で、アルコールを投与通る食物の補給を介して投与することができる。ここでは、ロス·オブ·正向反射（LORR）1の概日調節の評価のための適切なアルコールの管理プロトコルを記述するだけでなく、鎮静。
一定の温度で12時間LDサイクル、その後、実験の質問に応じて2〜5日間、制御された光政権に転送：ハエは12時間に同伴されています。ハエは、フライバーとして知られている装置でエタノール蒸気にさらされている。この装置では、空気の制御された量は、水及びアルコールにバブリングされ;蒸気は、次いで、バイアルハウジングハエに混入し向けられる。ハエ分ごとに5は反射神経立ち直りや鎮静になっている表示されない番号を記録する。各時点についてLORRパーセンテージは概日時間ポイント間又はハエの株の間で計算され、比較される。行動分析のオプションと組み合わせるフライバーアルコール配信を使用してアルコール配信のシンプルさと信頼性は、暗い条件下で実施概日の実験のための重要な利点を提供します。
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Protocol
フライの1。組み立て
根拠と概要：システムがハエにアルコール蒸気の制御された割合を管理するために設計されています。注： 図1は、フライの概略図にセットアップ三段階（アルコールと水のボトルの空気流、セットアップのアセンブリ、および観察バイアルの組み立て）は、以下に記載されるように提供する。要するに、安定した空気流は、それぞれ、アルコールと水を通して泡立て混合し、4観測バイアルに投与される2つの画分に分割される。
- エアフローの組み立て
- Yコネクタを使用した一貫性のある空気の流れや分割を生成するために、建物の空気や水槽の曝気装置のいずれかに柔軟なシリコンチューブの短い部分を接続します。システム（4観測バイアル通常千ミリリットル/分）を通過する空気の総量をコントロールし、空気流量調節器への最初の分岐を接続します。
- 第二の管にクイックコネクタを挿入します空気流は、較正された空気の流れに影響を与えることなく、実験の開始時に中断することができる。 Yコネクタを追加し、気流調整器に、各分岐チューブを接続してください。
- 気流規制当局にチューブを接続し、2気流メーターを接続します。
- アルコールと水ボトルのセットアップ
- 気流メートルの出口にフレキシブルチューブを追加し、チューブのそれぞれの長さの端部に90°曲げて細いガラス管（1ミリリットルのガラスピペットの各セクション）を挿入します。これは、水とアルコールのボトルへの入口空気流となる。
- アルコールと水で満たされたボトルにそれらを介して2穴にゴム栓を配置します。水浴を用いて周囲温度よりも高い一定温度2℃の両方のボトルを保管してください。水浴は27℃である間に我々の実験では、環境室を25℃に維持されている
- Aのストレートガラスピペットを挿入赤外線は、ゴム栓を介して入口とボトルの底から約1cmまでの流体中に延びている。
- ガラスの終わりはボトル内部ストッパーの下部と同じ高さになるまで、ゴム栓に残っている穴にガラスピペットの肘部分を挿入します。チューブのもう一つの長さが、この空気出口を挿入します。
- Yコネクタを使用して空気の流れを再結合し、2ツ穴ゴム栓を通して挿入曲げガラスピペットのセクションで空の混合フラスコやボトルを通る空気の流れを導くようにシリコンチューブの別の長さを使用しています。コンセント混合気流のためのシリコンチューブの別の長さを使用しています。
- 観測バイアルの組立
- 複数の観測バイアルを各実験で使用できるように、空気の4または8より小さいストリームを得るために混合し、フラスコ2〜3倍から出てくる出口空気流を分割する。観察用バイアルへの柔軟なシリコンチューブを接続します。
- observatiを設定ガラス管は、アルコール蒸気のための入口および出口を提供する介して2つの孔を含有するゴム栓で密封し、空のバイアルを使用してバイアルに。
- ネッティングを有する第1のガラス管の端部を覆い、可撓性プラスチックチューブの小片を用いて所定位置にネッティングを保つ。それはバイアルの約半分の長さに伸びるまで、第1の穴を通って、このチューブを挿入します。必要に応じて、ぴったりとフィットを取得するためにテフロンテープを使用しています。
- それはゴム栓の内側の端と同じ高さになるまでネッティングでカバーの端にも第2のガラス管を挿入します。
- 暗赤色光条件下でハエとのコントラストを最大にするために白い紙の上に水平にバイアルを置きます。
- 気流の適当な画分を混ぜてアルコールに吹き込んや気流が水に吹き込ん。継続的に空気圧を監視し、空気流の所望の混合を維持するために必要に応じて調整を行う。
注：連続運転小さな部屋で、平行または単一のアッセイで複数のフライバーアッセイのアルコール蒸気の顕著な蓄積につながることができます。潜在的に密閉された部屋で研究者に影響を与える可能性があり、アルコール蒸気の継続的なリリースを避けるために、適切なシステムが適切に実験中に生成されたアルコール蒸気を取り除き場所に置かれる必要がある。 、アルコール蒸気を除去し、各バイアルから突出する第2のガラス管にチューブの6-12インチのピースを接続し、それらをバンドルし、漏斗真空システムに向けるために。研究者はまた、実験的な試験室が適切に換気されていることを確認する必要があります。
実験動物の2。準備
根拠と概要：適切な文化やハエのハウジングは、データのばらつきを減らすことができます。これは、ハエが経験したストレスの標準化と最小化によって達成される。そのため、全く麻酔（CO 2または代替）がドゥリを使用しないNGプロトコルの次のステップのいずれか。さらに、ハエは、年齢は学習と記憶の実験17を含む他の行動の分析のための標準である可変性を最小限にするために、実験および時点間で一致させる必要があります。
異なる光：暗い場所では、エタノールに対する行動応答した体内時計の機能を調べるために使用することができます。日周リズムが存在するかどうかを判断するために、実験は、特定のZeitgeberタイムズ（ZT）での性能を測定するために定義されたLDサイクル下で行うことができる。 ZT 12時間点灯が12時12分時間のLDサイクルでオフになっている間、ZT 0は、夜明けを表し、LDサイクルの下のライトの時間として定義されます。一定の条件下では、概日時間（CT）は、環境シグナルの非存在下で動物のための時間を計測する、すなわちフリーランニング時間、および前のLDエントレインメントサイクルに関連している。野生型のショウジョウバエでは、CTは、最初の数日の前のZTを反映している一定のフリーランニング概日期間などの条件やリズム中のSは、〜24時間である。暗サイクル実験前に恒暗条件（DD）に転送：概日変調を測定し、行動に急性光の影響を排除するために、ハエは光に連行される。概日の実験は、特定の概日時間（CT）でのパフォーマンスを測定するために、DDの二日目に行われる。
ショウジョウバエでは、連続光（LL）の条件は、不整脈自発運動18〜21と不整脈短期記憶17によって証明されるように概日コア概日遺伝子の湿らまたは廃止分子振動機能障害や行動概日リズムの崩壊につながる。プロトコルは、概日試験のために最適化されており、他の実験のために簡略化することができる。チューブから12インチで使用される小型の赤いライト;すべての概日の実験は、暗赤色灯（周囲オーバーヘッド赤色光<作業台の上に1ルクスを使用して実施している〜1ルクス光）。
- 暗い巻き込み条件（LD）：12時12時間の光の下で25℃、リアはハエ。
- 1日目の日、明期の終わりに新鮮に孵化ハエを収集し、食品の粘着性を最小限に抑えるために、高濃度の寒天食品の少量を含むバイアルを保持している中で、LDの条件で24時間保管してください。注意：ヘルシー、正常に発達ハエを収集するようにするには、羽化が培養瓶の中に開始された後、最初の日以内に収集されたハエを使用しています。
- （25〜35）は、約30のバッチを集めて光の期間の終わりに向かって2日目に吸引器を使用して飛行する、新鮮な保持バイアルに移す。
- バイアルの遠端にハエを指示するために、強力な光源を使用してください。行動観察は、各実験の終わりに計数ハエの総数のパーセンテージで報告されるように、この範囲内で、各バイアル中のハエの正確な数は重要ではない。
- 25°CのFOで、DD条件下でのハエを維持2日間R。
- 実験の日に、さまざまな条件や実験前に少なくとも1時間室温での実験的な行動の部屋以外の保育器に収容されたすべてのハエを置く。順化は、温度や湿度の変化に変動性を低減します。
- 行動の概日調節を試験するための6日目の時点（CT 1、5、9、13、17および21）で観測を行う。
- 実験設計のロバスト性を増加させ、単一の実験に特異的な可変性を最小限にするために行動実験の単一のセット内の複数の時点を比較する。逆の明暗スケジュールの二つのインキュベータを同調するために使用される場合、例えば、CTおよびCT 13 1の観察とを同時に得ることができる。
注：上記の手順は、一定の暗さの概日の条件で実施したアッセイのための実験動物の調製を記載する。別の明：暗条件は、時計の機能をプローブするために使用することができるアルコールに対する行動反応中。日周リズムが実験は、特定のZeitgeberタイムズ（ZT）での性能を測定するために、LDサイクル下で行うことができる存在するかどうかを判断する。さらに、プロトコルは、概日機能障害を試験する実験のための一定の光条件下で飼育ハエと共に使用することができる。光条件に収容されたハエをテストする別のプロトコルのために、行動アッセイは、まだ暗い条件下で実施されるべきである。ハエは、行動上の光の急性影響に対する行動のばらつきを最小化するために実験前に1時間、暗所に移送しなければならない。
3。行動観察
根拠と概要は以下のアルコール投与プロトコルは、暗赤色灯の条件下での観察に最適化されています。 2行動対策LORRと鎮静フライ酩酊2つの異なる点を表す。 LORRは、損失Oを組み込む酩酊の遅い点を表すFモータや姿勢制御、中毒の鎮静措置に対し、非常に遅く、終点。遺伝子型または概日調節が異なるこれら2施策に影響を与える可能性があり;従って、一方は両方を検査したい場合がある。要するに、ハエがバイアル中にロードされ、LORRを表示するハエや鎮静の数は、アルコール蒸気暴露中に5分ごとに記録しており、実験終了時にカウントされたハエの総数。
- 実験を開始する前に、少なくとも10分間（空気は水とアルコールのボトルを通してバブリング）システムを介して空気を実行し、気流を較正するためにその時間を使う。
- 空気の流れを停止するクイックリリースを外します。バイアル中にハエをロードし、空気の流れを再接続し、タイマーを開始します。注：応答しないか死んハエ、ハエ、保持バイアル中に残っている場合、これはストレス条件の指標とすることができる。一般に、これらの条件は、保持バイアルに少ないハエを収容又は僅かなを用いて食品の粘着性を減少させることによって緩和することができる調理中のLY高い寒天濃度。最適な行動解析と実験の間の最小の変動のために、ハエは実験前に、健康でなければなりません。
- 正確な時間管理のために、アルコール暴露の総時間を追跡し、5分間隔をマークするために第2カウントバックタイマを使用する1つのタイマーを使用。
- 特に暗赤色灯の条件下では、コントラストを向上させ、視認性を飛ぶためにバイアルの下に白い紙を置きます。
- 一定のレベルを維持するために、実験中に定期的に空気の流れを確認してください。気流が安定した後、一般的に、彼らは実験期間中に安定した状態を保つ。
- 1時間の期間ごとに5分に一度、その立ち直り反射を失ったハエの数を数える。アルコール感度が遺伝子型および遺伝的背景の間で変化するように、より頻繁な評価を実行したり、長時間の実験を行うことが望ましい場合がある。
- バイアルslightlを持ち上げ表面からY、バイアルの背後に紙に向かって赤ライト懐中電灯からの光を演出します。暗赤色光条件下ですべての実験に1ルクスを超えない光レベルを維持するために、実験的なバイアルに少なくとも12インチの距離で、手持ちの赤懐中電灯を保管してください。
- すべての実験のための基準を確立するために照度計を用いた光のレベルを測定します。
- バイアルにしっかりとタップを適用することにより、その立ち直り反射を失ったハエの数を決定し、約4秒以内に自分を正しくすることができないどのように多くのハエ数える。 LORRを表示するハエはまだ彼らの足と羽を動かすかもしれないが、直立自らをオンにすることはできません。
- セッションの最後に、各バイアル中のハエの総数を数える。
注：実験バイアルにハエをロードする際に時折、単一のハエは、ストッパーとサイドの間に挟まれてもよい。これは暗所で行われているように、全麻痺をカウントする必要があるので、それは容易に気付かれなくてもよい正しくパーセンテージを計算するために実験終了時ハエの小胞体。
さらに、この手順は、異なる行動のエンドポイントを表しハエの鎮静を測定するために使用されてもよい。鎮静ハエが自分の権利反射を失ったが、鎮静、より大きなアルコール露出を必要とします。行動的に、鎮静はハエがバイアルにAA事務所タップ次のバイアル中に動か残りと見かけの運動活性の完全な欠如によって特徴づけることができる。鎮静のために、動かない足がバイアルをしっかりタップで次の配信を振っていないと残っているハエの数を数える。さらに、バイアルは、個々のハエはまだ彼らのグラブ反射を維持するかどうかを判断するために左右にロールバックすることができます。
4。データ解析
- 各バイアル中のハエの総数に基づいて評価し、各時点での割合LORRを決定します。
- calculatiによる概日時点または株の違いを推定するシグモイド曲線の直線部分内にある各サンプルの50％LORRを、（下の図2を参照）ngの。
- 代替統計：
- 遺伝子型間の比較を計画している場合は、差が（ 図3）事後検定で有意であること時点の範囲を決定するために、反復測定ANOVAandを用いて全体の時間経過を分析することが望ましい。これらの試験のために、我々は0.001の値を使用することを好む。これは、個々の露光時間での差は、曲線の傾きの遺伝子型間の差異と同様に評価することを可能にする。
- 感度の差は、このようなグラフの直線部分（ 図4）から鎮静などの特定の応答のアルコール暴露の特定の時間のために決定することができる。
- 株または概日時点間の差異は、標準的なF-統計および事後検定を用いて推定することができる。
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Representative Results
マーカーとして50％LORRを使用してアルコール感度の概日調節。
日中のアルコール感度の概日変調を示す代表例を図2に示す。LORRはカントン-SにおけるDDの第 2日の間に6の時点で測定し、50％LORRを各時点について決定した。 （：F 5,45 = 7.39、p <0.001、N = 6-10時間当たりの時点ANOVA）の分析は、一日の時間の有意な効果を示した。フィッシャーのLSD検定は、この結果は一貫している。CT5、CT13対CT5対CT1、CT17対CT5、コネチカット州21対CT5、CT13、CT17対CT9、およびCT 21対CT9対CT9との間に有意な差が認められた私たちの以前に発表された結果と1。
野生型および変異ハエとの違い。
第二の例は、野生型カントン-SのハエとFLI間LORRおよび鎮静の違いを示すために時系列を使用しています同じ遺伝的背景（ 図3）に（1118 W）の機能喪失白い変異を有するES。トランスジェニック系統は、多くの場合、またW 1118変異を有するこれらのハエや概日時計遺伝子のための多くの突然変異系統を使用して作成されるようにW 1118変異は、ショウジョウバエの研究者に特に重要である。結果は、全露光期間毎に5分間、示したデータとの時系列（ 図3）として提示される。観測は急速公差の蓄積22-24の影響を回避するために60分に制限されている。 wは1118変異体た（p <0.001、被験者F 1,10 = 57.12の間のANOVA、N = 6）カントン-Sが行うよりも、エタノール蒸気に応答して有意に減少LORR感度を表示する。有意差（= 0.001）は20分から60分（ 図3aを介して、この実験で発見された1,10 = 137.301間のANOVA、P <0.001、N = 6）1118 Wおよびカントン-Sとの違いも鎮静の割合で発見された。鎮静アッセイにおいて、有意な差（= 0.001）は50分、55で発見された、及び60（ 図3B）。彼らの目にスクリーニング顔料の欠如に加えて、1118ワットの変異体はまた、セロトニン、ドーパミンおよびヒスタミン25,26のレベルが低下している。生体アミンのレベルのこれらの変化は、W 1118の突然変異体27,28におけるエタノールへの感受性の変化を説明することができる。従って、アッセイにおける遺伝子型白色発現レベルを制御するエタノール感受性の正確な評価のために必須であり得る。
鎮静の概日調節。
第三の例では、カントン-Sの割合が落ち着いたハエ測定鎮静に対するアルコールの概日効果（ 図4）が存在するかどうかを判断するために設定された時間が経過する後D。 = F 1,20：我々は、CT 5と17で40分（30％アルコール蒸気）で鎮静ハエの割合を比較した結果は、夜間（ANOVA中にアルコール暴露と比較して有意に少ない鎮静ハエは日中があることを示している6.21、P = 0.022、N = 10（CT5）＆12（CT17））。観測は直接の比較を可能にするために当社の標準LORR条件で行われたようにハエは一時間以内に50％の鎮静マークに達しなかった。時間を超えた観測は急速な公差22〜24の蓄積に問題がある。この実験では、概日の時点のいずれかでハエの25％未満は、これらのグループ間の前縁鎮静感度に差があることを示す、40分間鎮静させた。鎮静におけるこの初期の時点でのデータを収集すると便利indicatです差が存在するイオンは、しかしながら鎮静応答に分布の形状に対する処置の効果を決定する能力が制限される。全体鎮静分布に差があるかどうかを決定するために、より高いエタノール濃度は、鎮静のより速い速度を確保するために使用されるべきである。
図1。ショウジョウバエのアルコール感度と鎮静を測定するためのフライ。
。。図2、日中のアルコール感受性の大幅な概日の変調を示す代表的な例 （ANOVA：F 5,45 = 7.39、P <0.001、N =時点当たり6-10; CT13、CT17、CT21＆対CT1、CT13対CT5、CT17、CT21＆とCT9の間に有意差）。
。A）カントン-Sハエはに比べLORRによって測定されたアルコールに有意に増加した感受性を示す野生型カントン-Sはハエや機能喪失白い1118変異型ハエとの間で、図3。行動反応に対するアルコールの影響が大きく異なる 白い突然変異運ぶ同じ遺伝的背景（F 1,10 = 57.12対象間で分散分析を、P <0.001、N = 6）。B）カントン-Sのハエは被験者間1118変異体（ANOVA Wよりアルコールの鎮静の影響を受けやすいとのハエF 1,10 = 137.301、p <0.001、N = 6）。 *P <0.05、** P <0.01、***はp <0.001。
。CT 5とCT 17間の40分で鎮静カントン-Sハエの割合を比較した図4に、代表的なデータを野生型ハエはANOVA（コネチカット5に比べて、CT 17時の初期鎮静において有意に大きな増加を実証：F 1,20 = 6.21、P = 0.022、N = 10（CT5）＆12（CT17））。
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Discussion
アルコール乱用と社会のアルコール依存症のコストは両方の29人的·経済的コストの面で、途方もないです30,31。 ショウジョウバエをモデルとして急速に多数の個体の行動反応を調べるため、高速で汎用性の高いシステムを提供しています、そのように広くアルコール5,7,32-34及び概日研究35-37の両方に使用されてきた。
ここでは、概日条件下では、成人のハエにアルコール蒸気の制御された投与のための簡単なプロトコルを説明した。
標準化された条件下で培養ハエは、その立ち直り反射を失ったハエの数は5分毎に記録している間、1時間、アルコール蒸気にさらされている。ここに説明されたプロトコルがあるため一定の条件の下で同調し、住宅に関するその他の要件の概日の実験のために最適化されています。様々なステップはsimplifiすることができます例えば、少なくとも1日または暗赤色光条件下で実験を行うための暗闇の中でストレージとして概日の実験のために不可欠なこれらのステップを除去することにより、一般的な研究のためのED。このプロトコルはまた、その後の生化学的または分子分析のためのアルコール濃度を変化させるように制御様式で、ハエが多数を露出させるために使用することができる。このような学習や記憶の観察など、他のショウジョウバエ行動実験との一貫性を保つため、暗赤色灯状態での行動応答の測定でも非概日の実験のために望ましいことがある。
実験の独立した反復実験間の変動は、突然変異体またはトランスジェニック系統間または概日時点間の小さな違いを曖昧にすることができます。したがって、「レプリカ」は排除するために、ランダム変数として添加することができるように（我々の例を参照）、同時に複数の株または概日時点のサンプルを試験することが推奨されるレプリカ間変動の影響。
アルコールに対する感受性は菌株間で変化する。アルコールの割合（アルコールバブリング空気流の百分率）に応じて調整する必要がある。 図3に見られるように、野生型カントン-Sハエよりもアルコール曝露の影響を受けにくい、白色変異を有するハエ。 白色変異を有する株の解析のためには、急速な耐性をもたらすことができるアルコールに長い暴露のような他の実験と同じ時間枠内での行動分析を行うようにハエが露出されるアルコールの割合を増加させることが望ましい場合がある開発。極めて感受性変異のために、それが使用されるアルコールの割合を減少させる必要のある実験のために、 黄色の遺伝子に変異を含むハエについて観察などの、空気流は、空気流を正確に飽和アルコールを較正するために増加しなければならないことがある。小さな増加または12月合計気流中reases（±10％）（実行可能な気流の範囲は900〜1,100の4観測バイアルml /分）がマイナスのハエに影響を与えていないようです。
1時間を超えての観察が原因のアルコール感受性に影響するハエ22〜24の急速な公差の蓄積の可能性を可能な限り避けるべきである。その代わりに、30〜40分で約50％LORRになり各菌株のためのアルコール割合を決定。複数の独立した株の比較が必要な場合は、すべての株のために働くアルコールの単一の割合を選択します。
このプロトコルは、行動観察に大きく依存するため、標準化されたプロトコルを厳守は時間をかけて行動観察でドリフトを避けるために不可欠です。可能な場合は、観察者がテストされている遺伝子型または時点に盲目になるように、行動観察を行うべきである。これらおよび他の未知の要因に基づいてバイアス電位を検出するために、それは時間のコース上のデータを調べると、観測は実験シリーズ全体で同じ範囲内にとどまることを検証することをお勧めします。
フライバーのセットアップは、特に学部の研究者やエタノールの悪影響に関する概日の研究のために、ハエのためのアルコール投与の他の方法に比べていくつかの利点を提供します。ハエにおけるモータ制御に対するアルコールの効果を測定するための代替装置がinebriometer、エタノール蒸気は上昇バッフルを通って循環された垂直柱であり、姿勢制御又はハエの感受性の喪失は、それがかかる時間を決定することによって測定することができる列38,39の底に落下する。 inebriometerは喪失姿勢制御の自動化された読み取りを提供し、 ショウジョウバエ 9,22,39,40のアルコール研究のための貴重な証明していますが、この行動のパラダイムは比較的高価な機器、装置のためのスペース、およびキャリブレーションするための時間を必要とすると条件を最適化します。このように、inebriometerは限られた予算やスペースを持つ多くの学部の教育研究室のための、または概日アッセイを実施する研究者に適していないかもしれません。ハエにアルコールを提供し、鎮静を測定する別の方法は、上部にあるまたはバイアルの底部でのいずれかの吸収性材料上の液体少量のアルコールを確定した後、アルコールを蒸発させる時間41,42とを可能にすることを含む。経時アルコール蒸気の濃度が増加するにつれて、行動反応を評価することができる。この配送方法は、セットアップが簡単ですが、ハエが露出している、アルコール蒸気の量は、時間と条件によって異なります。差異は、例えば、概日変調のような感受性または鎮静の初期速度、で評価された実験的な質問については、ハエに送達アルコール蒸気の一定レベルを有することが望ましい。さらに、アルコールexposur一定量にハエの大量の被ばくeは、フライで行うように、下流の細胞または生化学的アッセイの正確な性能のために望ましい。初期のショウジョウバエアルコール研究に共通のハエにアルコールを送達する別の方法は、それを準備したように食品中にアルコールを混合することを含ん。この方法は簡単で、ほとんどのセットアップが必要になりますが、それは時間とともにアルコール変化の濃度として日間の慢性アルコール露光に最も適しています。
より洗練され、自動化された方法は、ビデオの活動記録と画像解析ソフト7,43含むアルコール暴露にハエの運動反応を評価するために用意されています。これらは、エタノールのプラス、超活性化の効果を評価するために特に強力である。しかし、これらの自動化された方法は、学部研究プロジェクトや教育機関のために法外に高価であり、最適サーカディアン条件の下でハエの大量の分析のために設計されない場合がありますtions（ 例えば 、暗条件下でのビデオキャプチャがバランスを必要とし、赤外照明と赤外線感度カメラを拡散）。私たちは、フライは、アルコール供給システム条件および実験室の設計のさまざまな適していアルコールに行動反応を評価するためのコスト効率の高い方法でアップの設定が容易に得たと判断している。
プロトコルの変更：
上記のプロトコルは、ロスオブ立ち直りレフ概日文脈で上のアルコール曝露の影響を調べることを目的としている。しかしながら、このプロトコルは容易にアルコール実験の他のタイプに対応するように変更することができる。
12時間〜12時間の明暗条件下でアルコールへの応答を調べる（LD; Zeitgeber時間）の条件は ：12時間の下でハエを維持：12時間LDサイクルを実験まで。光位相（ZT 1、5時に行った実験の前に暗い約1時間にハエを転送、および9）の日の。これは、光の急性効果が結果を交絡されていないことを保証する。
彼らの体内時計18〜21とアルコール暴露1に不整脈応答の混乱に一定の照明条件の結果で培養ハエ： 一定の光条件下でのアルコールへの応答を調べる 。ハエがLD又はDD条件で維持ハエと同じ条件下で試験されるように、ハエは、実験前に約1時間暗所に転送することができる。
鎮静 ：LORRはまだ彼らの翼を移動し、頭と足ハエながらハエは、バイアルの底に動か残っているため鎮静ているハエはLORRから飛んで分離することができる。バイアルを乱されたとき展示LORRはまだ微妙な動きで応答していることを飛ぶ。ハエの鎮静は、当社TA後に動か残りハエのカウント数によって決定されるバイアルにP。さらに、バイアルのローリングは、個々のハエはまだ彼らのグラブ反射を保持するかどうか決定するために使用することができます。
回復：行動アッセイはアルコール応答の追加パラメータとして回復を測定することによって拡張することができる。アルコール露出を中止し、LORRごとに5分に関する観測を作り続けています。回復期間中にバイアルを通して加湿された空気の流れを継続する。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究のための資金は、フロリダ州立大学医学部の大学と旧ソ連の生物科学省からのサポートから神経科学賞は、プログラムによって提供された。追加資金は、補助金のアルコール飲料メーカーの研究基金から提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y-connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature air regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature air regulator mounting bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini flashlights with red filters | Mag-light |
References
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