Summary
Drosophila heeft zich ontpopt als een belangrijk modelsysteem voor het ontleden van de cellulaire en moleculaire onderbouwing van gedragsreacties op alcohol. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van alcohol gevoelige gegevens in een circadiane context die gemakkelijk kan worden toegepast op andere experimenten en is goed geschikt voor gegradueerdenonderzoek.
Abstract
Fruitvliegen (Drosophila melanogaster) zijn een gevestigd model voor zowel alcohol onderzoek en circadiane biologie. Onlangs hebben we aangetoond dat de circadiane klok moduleert alcohol gevoeligheid, maar niet de vorming van tolerantie. Hier beschrijven we ons protocol in detail. Alcohol wordt toegediend aan het vliegen met de flybar. In deze opstelling wordt verzadigd alcohol damp vermengd met bevochtigde lucht in set proporties, en toegediend aan de vliegen in vier tubes tegelijk. Vliegen zijn gefokt onder gestandaardiseerde omstandigheden om variatie tussen de herhalingen minimaliseren. Drie dagen oude vliegen van verschillende genotypen of behandelingen worden gebruikt voor experimenten voorkeur congruente vliegen twee verschillende tijdstippen (bijv. CT CT 5 en 17) die kunnen vergelijken. Tijdens het experiment zijn vliegen blootgesteld gedurende 1 uur tot het vooraf bepaalde percentage alcohol damp en het aantal vliegen die het verlies van oprichtreflex (lorr) vertonen of sedatie worden geteld om de 5 minuten. De gegevens kunnen worden geanalyseerd met behulp van drie verschillende statistische benaderingen. De eerste is de tijd waarbij 50% van de vliegen de oprichtreflex verloren bepalen en gebruiken van een analyse van de variantie (ANOVA) om te bepalen of significante verschillen tussen tijdstippen. De tweede is om het percentage vliegen die lorr tonen na een bepaald aantal minuten, gevolgd door een ANOVA-analyse te bepalen. De laatste methode is om de hele tijd series met behulp van multivariate statistische analyse. Het protocol kan worden gebruikt voor niet-circadiane experimenten of vergelijkingen tussen genotypen.
Introduction
Drosophila melanogaster demonstreren bifasische gedragsreacties op alcohol 1 die analoog is aan de menselijke reacties op dit medicijn 2,3 zijn. Na de eerste blootstelling aan lage concentraties van alcohol, vliegt vertonen verhoogde bewegingsactiviteit, vervangen door een gebrek aan motorische coördinatie, het verlies van posturale controle en oprichtende reflexen (meer verlies van evenwicht Reflex: lorr), en sedatie (volledige gebrek aan motorische activiteit in reactie mechanische stimulatie) blootstelling aan alcohol vordert 4-9. De endogene circadiane klok is een sterke modulator alcohol gevoeligheid en toxiciteit waargenomen bij muizen 10,11, ratten 12 en 13 mens. Recente ontwikkelingen in Drosophila onderzoek is gebleken dat de circadiane klok moduleert acute alcohol gevoeligheid, maar geen alcohol tolerantie 1. De krachtige genetische benaderingen beschikbaar in Drosophila mutant via studies en transgene manipulaties van de ruimtelijkeen tijdelijke genexpressie tot een systeem dat snelle vooruitgang bij het identificeren van de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen voor complexe gedrag maakt. Het gebruik van Drosophila als onderzoeksinstrument is toegestaan substantiële vooruitgang in het begrip alcohol neurobiologie die snel kunnen worden vertaald naar zoogdieren 14-16. Om het begrip van de moleculaire mechanismen waardoor de circadiane klok moduleert alcohol gevoeligheid te vergemakkelijken en om gedragsreacties over circadiane tijdstippen, een alcohol administratie protocol geschikt zijn voor gebruik bij weinig rood licht gelijkmatig te meten is vereist. Voor Drosophila, kan alcohol worden toegediend via de voeding suppletie voor chronische blootstelling of betrouwbaar door het toedienen van alcohol in de vorm van damp voor acute blootstelling. Hier, een alcohol administratie protocol geschikt zijn voor de beoordeling van de circadiane modulatie van verlies-van-oprichtreflex (lorr) 1 alsmede beschrijven wesedatie.
Vliegen worden meegevoerd met 12 uur: 12 uur LD cycli bij constante temperatuur en vervolgens overgebracht naar een gecontroleerde lichte regime voor 2-5 dagen, afhankelijk van de experimentele vraag. Vliegen worden blootgesteld aan ethanol damp in een apparaat dat bekend staat als de flybar. In deze inrichting worden gecontroleerde hoeveelheden lucht door water en alcohol; de dampen worden vervolgens gemengd en geleid in een flesje behuizing de vliegen. Elke 5 min de vliegen worden gescoord voor het nummer dat niet wordt weergegeven oprichtende reflexen of zijn geworden verdoofd. Lorr percentages voor elk tijdstip berekend en vergeleken tussen circadiane tijdstippen of tussen stammen van vliegen. De eenvoud en betrouwbaarheid van alcohol aflevering met behulp van de flybar alcohol levering in combinatie met gedrags-analyse opties biedt een significant voordeel voor circadiane experimenten uitgevoerd onder donkere omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vergadering van de flybar
Achtergrond en overzicht: Het systeem is ontworpen om gecontroleerde percentages van alcohol damp te dienen aan vliegen. Opmerking: Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de flybar set-up zoals hieronder beschreven in drie fasen (montage van de luchtstroom, de set-up van de alcohol en water flessen, en montage van de observatie flesjes). Kortom, een constante luchtstroom in twee fracties die worden geleid door alcohol en water respectievelijk gemengd en toegediend aan 4 waarneming injectieflacons.
- Vergadering van de Airflow
- Sluit een kort stuk van flexibele siliconen slang aan beide gebouw lucht of een aquarium beluchter een consistente luchtstroom en split met een y-connector te genereren. Sluit de eerste afslag naar de volumergelaar dat de totale hoeveelheid lucht regelt via het systeem (meestal 1000 ml / min voor 4 observatie flacons).
- Plaats een snelkoppeling in de tweede buiszodat de luchtstroom aan het begin van het experiment kan worden onderbroken zonder dat de gekalibreerde luchtstroom. Voeg een y-connector en sluit iedere vertakking buis om de luchtstroom regelaar.
- Sluit de leidingen om de luchtstroom toezichthouders en vervolgens twee luchtstroom meter verbinden.
- Set-up van de Alcohol en waterflessen
- Toevoegen flexibele slang aan de uitgang van de luchtstroom meter en plaats een dunne glazen buis (delen van 1 ml glazen pipetten) met een 90 ° bocht in het uiteinde van elk buisstuk. Dit zal dienen als de inlaat luchtstroom in het water en alcohol flessen.
- Plaats rubberen stop met 2 gaten door ze in de flessen gevuld met alcohol en water. Houdt beide flessen bij een constante temperatuur 2 ° C lager dan omgevingstemperatuur met behulp van een waterbad. In onze experimenten is de milieu kamer gehandhaafd op 25 ° C, terwijl het waterbad bij 27 ° C.
- Steek de rechte glazen pipet voor de eenir inlaat door de rubber stop en zich in de vloeistof tot ongeveer 1 cm van de bodem van de fles.
- Plaats een elleboog gedeelte glazen pipet in de resterende gat in de rubberen stop tot het einde van het glas gelijk ligt met de onderkant van de stopper in de fles. Plaats dit luchtuitlaat in een ander stukje slang.
- Herenigen de luchtstromen met een y-connector en een andere lengte van siliconen slang aan op de luchtstroom rechtstreeks via een lege mengen kolf of fles met gebogen glazen pipet secties ingebracht via een twee-gaten rubberen stop. Gebruik een andere lengte van siliconen buizen voor de afvoer gemengde luchtstroom.
- Vergadering van de Observation Vial
- Splits de uitlaat luchtstroom die uit het mengen kolf 2-3x 4 of 8 kleinere luchtstromen te vinden zodat meerdere flacons waarneming kan in elk experiment. Sluit de flexibele siliconen slang aan op de observatie flesjes.
- Stel de waarneop flacons met lege injectieflacons afgesloten met een rubberen stop die twee openingen voor de glazen buizen garanderen een inlaat en een uitlaat voor de alcohol damp.
- Bedek het einde van de eerste glazen buis met een net en houden de netten in plaats met behulp van een klein stukje van de flexibele plastic buis. Plaats deze buis door het eerste gat totdat het zich uitstrekt tot ongeveer de halve lengte van de flacon. Indien nodig, gebruik teflon tape om een goede pasvorm te verkrijgen.
- Plaats de tweede glazen buis ook het einde waarop netten tot deze gelijk met de binnenrand van de rubberstop.
- Plaats de injectieflacons horizontaal op een wit stuk papier om het contrast met de vliegen onder gedimd rood licht omstandigheden te maximaliseren.
- Meng geschikte fracties van de luchtstroom geleid door alcohol en de luchtstroom door het water borrelen. Monitor de luchtdruk continu en aanpassingen die nodig zijn om de gewenste menging van de luchtstromen te behouden.
Opmerking: de continu draaiendevan verschillende Fly Bar assays parallel of zelfs een enkele test in een kleine ruimte kan leiden tot een merkbare accumulatie van alcohol damp. Om voortdurende introductie van alcohol damp die mogelijk de onderzoeker kan beïnvloeden in een afgesloten ruimte te vermijden, dient een adequaat systeem in de plaats die adequaat verwijdert alcohol damp die tijdens het experiment te worden gezet. Aan alcohol dampen te verwijderen, sluit u een 6-12 inch stuk slang op de tweede glazen buis uitsteekt uit elke flacon, bundelen ze en rechtstreeks naar een trechter-vacuümsysteem. Onderzoekers moeten er ook voor zorgen dat de experimentele testen ruimte voldoende geventileerd.
2. Voorbereiding van Proefdieren
Achtergrond en overzicht: De juiste cultuur en huisvesting van de vliegen zal variabiliteit te verminderen in de gegevens. Dit wordt bereikt door middel van standaardisatie en minimalisering van stress ervaren door de vliegen. Daarom is geen verdoving (CO2 of alternatieve) gebruikt During een van de volgende stappen van het protocol. Bovendien moet vliegen vergelijkbare leeftijd over experimenten en tijdstippen van de variabiliteit te minimaliseren als standaard voor andere gedrags-analyses waaronder het leren en het geheugen experimenten 17 zijn.
Verschillende licht: donker omstandigheden kan worden gebruikt om de functie van de circadiane klok in de gedragsreactie ethanol sonde. Om te bepalen of een dagritme bestaat, kan experimenten onder een bepaalde LD cyclus uitgevoerd om te meten op specifieke Zeitgeber Times (ZT). ZT 0 vertegenwoordigt de dageraad en wordt gedefinieerd als de tijd van de lichten op onder LD cycli, terwijl ZT 12 is de tijd lichten worden uitgeschakeld met een 00:12 hr LD cyclus. Onder constante omstandigheden, het circadiane tijd (CT) meet de tijd voor het dier in de afwezigheid van signalen uit de omgeving, dat wil zeggen vrij looptijd, en is gerelateerd aan de vorige LD entrainment cyclus. In wild type Drosophila, CT weerspiegelt de vorige ZT gedurende de eerste dags in constante omstandigheden als vrijlopende circadiane periode en ritmes zijn ~ 24 uur. Om circadiane modulatie meten en acute licht effecten op het gedrag te elimineren, zijn vliegen meegevoerd aan het licht: donker cyclus en vervolgens overgebracht naar constante donkere omstandigheden (DD) voorafgaand aan de experimenten. Circadiane experimenten worden uitgevoerd op de tweede dag van DD om prestaties te meten op specifieke Circadiaanse Times (CT).
In Drosophila, continu licht (LL) omstandigheden leiden tot circadiaanse dysfunctie met vochtige of afgeschaft moleculaire trillingen van kern circadiane genen en verstoring van gedrags circadiane ritmes zoals blijkt uit aritmische bewegingsactiviteit 18-21 en aritmische korte termijn geheugen 17. Het protocol is geoptimaliseerd voor circadiane studies kan worden vereenvoudigd andere experimenten. Alle circadiane experimenten worden uitgevoerd met behulp van gedimd rood licht (omgevingslicht overhead rood licht <1 lux op de bank top, kleine rode lichten gebruikt bij 12 centimeter van buizen~ 1 lux licht).
- Achterzijde de vliegen bij 25 ° C onder 12:12 uur licht: donker meesleuren voorwaarden (LD).
- Verzamel vers eclosed vliegen aan het eind van de dag-lichtperiode op dag 1 en op te slaan voor 24 uur onder LD omstandigheden die flacons met een kleine hoeveelheid hoge concentratie agar voeding voedsel kleverigheid minimaliseren. Opmerking: Om te zorgen voor een gezonde, normaal ontwikkeld vliegen worden verzameld, alleen vliegen binnen de eerste dagen verzameld na verpopping begint in een cultuur fles.
- Verzamel batches van ongeveer 30 (25-35) vliegt met een afzuiger op dag 2 aan het einde van de lichte periode, en transfer naar verse bedrijf flesjes.
- Gebruik een sterke lichtbron te richten vliegen naar het einde van de flacon. Binnen dit bereik, het exacte aantal vliegen per flacon is niet kritisch gedragswaarnemingen worden in procenten van totaal aantal vliegen geteld aan het einde van elk experiment.
- Handhaaf vliegen onder DD omstandigheden bij 25 ° C for twee dagen.
- Op de dag van het experiment eerst alle vliegen ondergebracht in verschillende omstandigheden anders dan de experimentele gedrag ruimte in de kamer ten minste 1 uur voor het experiment incubators. Acclimatisatie vermindert variabiliteit als gevolg van veranderingen in temperatuur of vochtigheid.
- Maak waarnemingen op zes tijdstippen per dag (CT 1, 5, 9, 13, 17 en 21) om te testen voor de circadiane modulatie van gedrag.
- Vergelijk verschillende tijdstippen binnen een enkele set van gedragsexperimenten om de robuustheid van de experimentele opzet te verhogen en de variabiliteit te minimaliseren specifiek voor een enkel experiment. Zo kunnen waarnemingen van 1 CT en CT 13 gelijktijdig worden verkregen indien twee incubatoren met tegengestelde licht-donker schema worden gebruikt entrainment.
Opmerking: De bovenstaande procedure beschrijft de bereiding van proefdieren Voor bepalingen in circadiane toestand van constante duisternis. Verschillende licht: donker omstandigheden kan worden gebruikt om de functie van de klok sondein de gedragsreacties op alcohol. Om te bepalen of een dagritme bestaat de experimenten onder een LD cyclus uitgevoerd om te meten op specifieke Zeitgeber Times (ZT). Bovendien kan het protocol worden gebruikt vliegen opgeheven onder constant licht voor experimentele testen circadiaanse dysfunctie. Voor alternatieve protocollen die vliegen gehuisvest in lichte omstandigheden te testen, moet gedrags testen nog worden uitgevoerd onder donkere omstandigheden. Vliegen moeten in het donker gedurende 1 uur overgebracht voorafgaand aan het experiment om gedrags variabiliteit te minimaliseren vanwege de acute effecten van licht op gedrag.
3. Gedragswaarnemingen
Achtergrond en overzicht: De volgende alcohol administratie protocol is geoptimaliseerd voor observaties onder gedimd rood licht. De twee gedragsmaatregelen lorr en sedatie vertegenwoordigen twee verschillende punten van vlieg dronkenschap. Lorr vertegenwoordigt een laat punt van dronkenschap waarin het verlies of motor en posturale controle, terwijl sedatie maatregelen een zeer late eindpunt van intoxicatie. Genotype of circadiaanse modulatie kunnen verschillend deze twee maatregelen van invloed zijn; vandaar kan men willen beide onderzoeken. Kortom, vliegen in de flesjes geplaatst, het aantal vliegen weergeven lorr of sedatie gescoord elke 5 minuten gedurende alcoholblootstelling damp en het totale aantal vliegen geteld aan het einde van het experiment.
- Voordat de proef begon, lopen de lucht door het (lucht door water en alcohol flessen) gedurende ten minste 10 minuten en gebruik die tijd om de luchtstromen kalibreren.
- Koppel de snelspanner om de luchtstroom te stoppen. Laad de vliegen in de flesjes, en sluit de luchtstroom en start de timers. Opmerking: Als reageert vliegen of dode vliegen worden achtergelaten op het bedrijf flesjes, kan dit een indicatie van stress omstandigheden. In het algemeen kunnen deze aandoeningen worden verlicht door huisvesten minder vliegen in het bedrijf flesjes of verminderen voedsel kleverigheid met een lichtely hogere agar concentratie tijdens het bereiden van voedsel. Voor optimale gedragsanalyses en minimale variabiliteit tussen experimenten moeten vliegen gezond voor experimenten.
- Voor nauwkeurige tijd te houden, gebruikt u een timer voor het bijhouden van de totale tijd van de blootstelling alcohol en het gebruik van een tweede telling-back timer om de 5-minuten intervallen markeren.
- Leg een stuk wit papier onder de flesjes om het contrast te verhogen en vliegen zichtbaarheid, vooral onder gedimd rood licht.
- Controleer de luchtstroom regelmatig tijdens een experiment om een constant niveau te houden. In het algemeen, wanneer luchtstromen gestabiliseerd, ze stabiel blijven tijdens de duur van het experiment.
- Tel het aantal vliegen dat hun oprichtreflex eenmaal per 5 minuten hebben verloren voor een hr periode 1. Als de alcohol gevoeligheid varieert tussen genotypen en genetische achtergronden, kan het wenselijk zijn om vaker bepalingen uit te voeren of om de experiment gedurende een langere periode.
- Til de flacon slightly van het oppervlak, en richten het licht van een rood-licht zaklamp in de richting van het papier achter de flacon. Houd de hand-held rode zaklampen op een afstand van ten minste 12 cm aan de experimentele flacon lichtniveaus niet groter dan 1 lux te handhaven voor alle experimenten onder gedimd rood licht.
- Meet lichtniveaus met behulp van een lichtmeter om normen voor alle experimenten vast te stellen.
- Bepaal het aantal vliegen dat hun oprichtende reflex hebben verloren door het aanbrengen van een stevige tik op de flacon en tellen hoeveel vliegen niet om zichzelf recht in ongeveer 4 sec. Vliegen die lorr weer kunnen nog bewegen hun benen en vleugels, maar kunnen zichzelf niet rechtop zetten.
- Aan het eind van de sessie, tel het aantal vliegen per flacon.
Opmerking: Soms kan een vlieg gevangen tussen de stop en de zijkant bij het laden vliegt in de experimentele flesjes. Dit gebeurt in het donker, kan niet gemakkelijk worden opgemerkt dat het noodzakelijk is de totale verdoven tellener vliegen op het einde van het experiment te kunnen percentages berekenen.
Bovendien, deze procedure kan ook worden gebruikt voor sedatie van vliegen, die een andere gedrags eindpunt vertegenwoordigt meten. Terwijl verdoofd vliegen hun recht reflex hebben verloren, sedatie vereist een grotere blootstelling aan alcohol. Gedragsmatig kan verdoving gekenmerkt door het volledig ontbreken van duidelijke motorische activiteit met vliegen resterende roerloos in de flacon volgende aa stevig tik aan de flacon. Voor sedatie, tel het aantal vliegen die roerloos zonder been zwaaien na de uitspraak van een stevige tik van de flacon blijven. Daarnaast kan de flacon worden uitgerold links naar rechts om te bepalen of individuele vliegen nog steeds hun greep reflex.
4. Data Analysis
- Bepaal het percentage lorr op elk tijdstip bepaald op basis van het totale aantal vliegen per flacon.
- Schatting verschillen tussen circadiane tijdstippen of stammen door berekeninng de 50% lorr voor elk monster, die in het lineaire gebied van de sigmoid curve valt (zie afbeelding 2 hieronder).
- Alternatief statistieken:
- Als vergelijkingen tussen genotypen gepland, is het wenselijk om het hele tijdsverloop analyseren met behulp van herhaalde metingen ANOVAand de reeks tijdstippen dat de verschillen significant met Post-hoc tests (figuur 3) bepalen. Voor deze testen we bij voorkeur een a waarde van 0,001 gebruikt. Hierdoor kan aan individuele belichtingstijden ook worden beoordeeld als verschillen tussen genotypen in de helling van de curve.
- Verschillen in gevoeligheid voor kan worden vastgesteld voor bepaalde tijden alcoholblootstelling voor een bepaalde reactie, zoals sedatie van het lineaire gedeelte van de grafiek (figuur 4).
- Verschillen tussen stammen of circadiaanse tijdstippen kan worden geschat met behulp van standaard F-statistieken en tests post-hoc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Circadiane Modulatie van Alcohol Gevoeligheid gebruik van de 50% lorr als een marker.
Een representatief voorbeeld toont circadiane modulatie alcohol gevoeligheid overdag wordt getoond in Figuur 2. Lorr gemeten op zes tijdstippen gedurende de 2 e dag van DD in Canton-S en 50% lorr werd voor elk tijdstip. Analyse toonde een significant effect van de tijd van de dag (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 per tijdstip). De Fisher LSD test toonde significante verschillen tussen CT1 vs CT5, CT5 vs CT13, CT5 vs CT17, CT5 versus CT 21, CT9 vs CT13, CT9 vs CT17 en CT9 versus CT 21. Dit resultaat is consistent met onze eerder gepubliceerde resultaten 1.
Verschillen tussen wild-type en mutante Flies.
Het tweede voorbeeld wordt tijdreeks van verschillen in de lorr en sedatie tussen wild-type Canton-S vliegen en Amst tonenes met een witte mutatie verlies-van-functie (w 1118) in dezelfde genetische achtergrond (figuur 3). De w 1118 mutatie is van bijzonder belang voor Drosophila onderzoekers transgene lijnen worden vaak gemaakt met deze vliegen en vele mutante lijnen voor circadiane klok genen ook w 1118 mutatie. De resultaten worden gepresenteerd als een tijdreeks (figuur 3) gegevens getoond voor elke 5 minuten gedurende de gehele testduur. Zij zijn beperkt tot 60 minuten om de effecten van snelle tolerantie opbouw 22-24 vermijden. De w 1118 mutanten aanzienlijk verminderd lorr gevoeligheid reactie op ethanoldamp dan door Canton-S (ANOVA tussen subjecten F 1,10 = 57,12, p <0,001, n = 6). Significantie verschillen (a = 0.001) werden gevonden in dit experiment van min 20 tot min 60 (figuur 3A w 1118 en Canton-S werden ook gevonden in de mate van sedatie (ANOVA tussen vakken F 1,10 = 137,301, p <0,001, N = 6). In de sedatie assay werden significante verschillen (a = 0,001) gevonden in minuten 50, 55, en 60 (Figuur 3B). Naast het ontbreken van screening pigmenten in hun ogen, ook w 1118 mutanten niveaus van serotonine, dopamine en histamine 25,26 verminderd. Deze veranderingen in biogene amine niveaus kan verantwoordelijk zijn voor de veranderde gevoeligheid voor ethanol in de w 1118 mutanten 27,28. Vandaar regulering van de expressie in de witte bepaald genotypes essentieel voor een nauwkeurige evaluatie van ethanol gevoeligheid.
Circadiane Modulatie van sedatie.
In het derde voorbeeld, we meten het percentage van de Canton-S vliegt bezadigded na een bepaalde hoeveelheid tijd om te bepalen of er sprake is van een circadiane effect van alcohol op sedatie (figuur 4). We vergeleken de percentage vliegen verdoofde op 40 min (30% alcohol damp) en CT 5 en 17 en de resultaten laten zien dat er beduidend minder verdoofd vliegen gedurende de dag in vergelijking met alcoholblootstelling nachts (ANOVA: F = 1,20 6.21, p = 0.022, N = 10 (CT5) & 12 (CT17)). De vliegen niet de 50% sedatie merk binnen het uur te bereiken als de waarnemingen werden gedaan onder onze standaard lorr voorwaarden om een directe vergelijking mogelijk te maken. Waarnemingen na het uur problematisch vanwege de opbouw van snelle tolerantie 22-24. In dit experiment bleek slechts 25% van de vliegen aan beide circadiaanse tijdstip verdoofd in 40 minuten, wat aangeeft dat er een verschil in voorrand sedatie gevoeligheid tussen deze groepen. Het verzamelen van gegevens op dit vroege moment in sedatie is een nuttig Aanwijsion dat er verschillen bestaan, maar de mogelijkheid om het effect van behandeling te bepalen van de vorm van de verdeling sedatie reacties beperkt. Om te bepalen of er verschil in de gehele sedatie distributie, zou een hogere ethanolconcentratie worden om sneller sedatie waarborgen.
Figuur 1. De flybar aan alcohol gevoeligheid en sedatie in fruitvliegen te meten.
.. Figuur 2 Representatief voorbeeld toont significante circadiane modulatie in alcohol gevoeligheid gedurende de dag (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0.001, N = 6-10 per tijdstip; significante verschillen tussen CT5 vs CT1, CT13, CT17, & CT21 en CT9 vs CT13, CT17 & CT21).
Figuur 3. Effecten van alcohol op gedragsreacties zijn significant verschillend tussen de wild-type Canton-S vliegt en de witte 1118 mutantvliegen verlies-van-functie. A) Canton-S vliegen tonen aanzienlijk toegenomen gevoeligheid voor alcohol, zoals gemeten door lorr vergelijking met vliegt met dezelfde genetische achtergrond die de witte mutatie (ANOVA tussen subjecten F 1,10 = 57,12, p <0,001, n = 6). B) Canton-S vliegen zijn gevoeliger voor alcohol sedatie dan wi 1118 mutanten (ANOVA tussen subjecten F 1,10 = 137,301, p <0,001, n = 6). *p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
. Figuur 4 Representatieve gegevens vergelijkt het percentage Canton-S vliegen verdoofd op 40 minuten tussen 5 en CT CT 17 Wildtype vliegen tonen significant grotere toename in aanvankelijke sedatie CT 17 vergeleken met CT 5 (ANOVA:. F 1,20 = 6.21, p = 0.022, N = 10 (CT5) & 12 (CT17)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kosten van alcoholmisbruik en alcoholisme voor de samenleving is enorm, zowel in termen van menselijke 29 en economische kosten 30,31. Drosophila als model biedt een snelle en veelzijdige systeem om de gedragsreacties van een groot aantal individuen snel te onderzoeken en als zodanig is uitgebreid gebruikt voor zowel alcohol 5,7,32-34 en circadiane onderzoek 35-37.
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de gecontroleerde toediening van alcohol damp volwassen vliegen onder circadiane omstandigheden.
Vliegen gekweekt onder gestandaardiseerde omstandigheden wordt blootgesteld aan alcohol damp gedurende 1 uur waarbij het aantal vliegen die de oprichtreflex verloren gescoord elke 5 minuten. De hierin beschreven protocol geoptimaliseerd voor circadiane experimenten vanwege de aanvullende eisen voor meesleuren en huisvesting onder constante omstandigheden. Verschillende stappen kunnen worden vereened voor generieke studies van die stappen die essentieel zijn voor de circadiane experimenten zoals opslag in het donker gedurende ten minste een dag of het doen experimenten onder gedimd rode licht verwijdert. Dit protocol kan ook worden gebruikt om grote aantal vliegen op een gecontroleerde wijze worden blootgesteld aan variërende concentraties alcohol voor verdere biochemische of moleculaire analyses. Voor de samenhang met andere Drosophila gedragsexperimenten zoals leren en geheugen waarnemingen, metingen van gedragsreacties bij weinig rood licht omstandigheden gewenst kunnen zijn, zelfs voor niet-circadiane experimenten.
Variatie tussen onafhankelijke herhalingen van het experiment kan obscure kleine verschillen tussen mutanten of transgene stammen of tussen circadiane tijdstippen. Het wordt daarom aanbevolen om monsters van verschillende stammen of circadiaanse tijdstippen tegelijk (zie onze voorbeelden) zodat 'replica' kan worden toegevoegd als een willekeurige variabele om elimineren deeffect van de variatie tussen de replica.
De gevoeligheid voor alcohol varieert tussen stammen. Alcohol percentages (het percentage van de luchtstroom borrelen door alcohol) moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Zoals gezien in figuur 3, vliegen die de witte mutatie minder gevoelig voor de effecten van blootstelling alcohol dan wildtype Canton-S vliegt. Voor de analyse van lijnen met de witte mutatie kan het gewenst zijn om het percentage alcohol waaraan de vliegen worden blootgesteld vergroten om de gedrags assay voeren in hetzelfde tijdsbestek andere experimenten langere blootstelling aan alcohol kan leiden tot snel tolerantie ontwikkeling. Voor extreem gevoelige mutanten en experimenten waarin het noodzakelijk is het percentage alcohol gebruikt, zoals waargenomen voor vliegen die een mutatie in de gele-gen verminderen, kan de luchtstroom moet worden verhoogd om de alcohol verzadigde luchtstroom te kalibreren. Kleine stijgingen of decemberreases (± 10%) van de totale luchtstroom (werkbare luchtstroom bereik van 900-1,100 ml / min voor 4 observatie flacons) lijken niet te negatieve invloed hebben op de vliegen.
Waarnemingen na 1 uur moeten wegens het potentieel van snelle tolerantie opbouw in de vliegen 22-24 die alcohol gevoeligheid beïnvloedt worden vermeden indien mogelijk. In plaats daarvan, bepalen de alcohol percentage voor elke stam die resulteert in een geschatte 50% lorr met 30-40 min. Als vergelijking van meerdere onafhankelijke stammen nodig is, kies dan een percentage van alcohol die werkt voor alle stammen.
Dit protocol is sterk afhankelijk van gedragsobservaties, dus een strikte naleving van een gestandaardiseerd protocol is essentieel om drift in gedragsobservaties na verloop van tijd te vermijden. Indien mogelijk, moet gedragsobservaties worden uitgevoerd, zodat de waarnemer is blind voor het genotype of tijdstip wordt getest. Om mogelijke vertekening op deze en andere onbekende factoren detecteren,is het raadzaam om de gegevens op een tijdsverloop te onderzoeken en om te controleren of observaties blijven binnen hetzelfde bereik gedurende de experimentele serie.
De flybar set-up biedt een aantal voordelen ten opzichte van andere methoden van alcohol administratie voor vliegen, in het bijzonder voor undergraduate onderzoekers of circadiaanse studies over de negatieve effecten van ethanol. Een alternatieve inrichting voor het effect van alcohol op motorische controle meten vliegen is inebriometer, kan een verticale kolom waarin ethanol damp wordt gecirculeerd door stijgt schotten en het verlies van houdingsregulatie of gevoeligheid van de vlieg worden gemeten door de tijd die naar de bodem van de kolom 38,39 vallen. De inebriometer biedt een geautomatiseerde uitlezing van verlies-van-posturale controle en is waardevol voor alcohol onderzoek in Drosophila 9,22,39,40 bewezen, maar dit gedrag paradigma vereist relatief dure apparatuur, ruimte voor de apparatuur, en de tijd om te kalibrerenen optimaliseren van omstandigheden. Zo kan de inebriometer niet goed geschikt zijn voor veel undergraduate onderwijs laboratoria met een beperkt budget of ruimte, of voor onderzoekers uitvoeren van circadiane assays. Een andere methode voor het leveren alcohol vliegen en meten sedatie omvat het plaatsen van een kleine hoeveelheid vloeistof alcohol op een absorberend materiaal, hetzij boven of onder een flesje waarna men de alcohol verdampen tijd 41,42. Als de concentratie alcohol damp met de tijd toeneemt, kan gedragsreacties worden beoordeeld. Hoewel deze levering methode is eenvoudig op te zetten, de hoeveelheid alcohol damp waaraan de vliegen worden blootgesteld varieert in de tijd en omstandigheden. Voor experimentele vragen waarin verschillen worden beoordeeld startsnelheden gevoeligheid of sedatie, zoals circadiane modulatie, is het wenselijk om een constant niveau alcohol damp geleverd aan de vliegen hebben. Bovendien, de blootstelling van een groot aantal vliegen een constante hoeveelheid alcohol exposure, zoals uitgevoerd bij de flybar, is wenselijk dat de nauwkeurige uitvoering van stroomafwaartse cellulaire en biochemische assays. Een andere methode van het leveren van alcohol te vliegen vaak in het begin van Drosophila alcohol onderzoek betrokken mengen van de alcohol in het voedsel daar hij is opgesteld. Hoewel deze methode is eenvoudig en vereist weinig set-up, is het best geschikt voor chronische blootstelling aan alcohol op dagen als de concentratie van alcohol verandert met de tijd.
Meer geavanceerde, geautomatiseerde methoden zijn ook beschikbaar voor de beoordeling van motorische reacties van vliegen naar alcohol blootstelling inclusief video-opname en activiteit beeldanalysesoftware 7,43. Deze zijn bijzonder krachtig voor het beoordelen van de positieve, hyper-activerende effecten van ethanol. Toch kunnen deze geautomatiseerde methodes onbetaalbaar voor undergraduate onderzoeksprojecten of onderwijs laboratoria en kan niet optimaal worden ontworpen voor de analyse van een groot aantal vliegen onder circadiane voorwaardenties (bijvoorbeeld video-opname onder donkere omstandigheden vereist evenwichtige en diffuse infrarood verlichting en infrarood gevoelige camera's). Wij zijn van mening dat de flybar biedt een eenvoudig op te zetten, kostenefficiënte methode voor alcohol levering systeem en de beoordeling van gedragsreacties op alcohol die is goed geschikt voor een verscheidenheid van aandoeningen en laboratorium ontwerpen.
PROTOCOL WIJZIGINGEN:
De hierboven beschreven protocol is gericht op het onderzoeken van het effect van blootstelling alcohol op de verlies-van-Oprichtproef-Reflex in circadiane context. Toch kan het protocol eenvoudig worden aangepast om andere soorten alcohol experimenten tegemoet.
Het onderzoeken van de reactie op alcohol onder de 12 uur-12 uur licht-donker (LD; Zeitgeber Tijd) voorwaarden: Handhaaf vliegen tot 12 uur: 12 uur LD cyclus tot het experiment. Breng de vliegen naar de donkere ongeveer 1 uur voordat het experiment tijdens de lichte fase (ZT 1, 5En 9) van de dag. Dit zal ervoor zorgen dat de acute effect van licht niet de resultaten wordt verstorende.
Het onderzoeken van de reactie op alcohol onder constante lichtomstandigheden: Het kweken van vliegen onder constante licht resulteert in de verstoring van hun circadiane klok 18-21 en aritmische reacties op blootstelling aan alcohol 1. Vliegen kan worden overgedragen aan het donker ongeveer 1 uur voor het experiment, zodat de vliegen worden getest onder dezelfde omstandigheden als vliegen gehandhaafd LD of DD omstandigheden.
Sedatie: Vliegen die worden verdoofd kan worden gescheiden van lorr vliegt omdat vliegen blijven roerloos op de bodem van de flacon, terwijl lorr vliegt nog steeds bewegen hun vleugels, hoofd en benen. Vliegt die tentoonstelling lorr nog reageren met subtiele bewegingen als de flacon wordt verstoord. Sedatie van vliegen wordt bepaald door het tellen van het aantal vliegen onbeweeglijk blijven na een stevige tap aan de flacon. Daarnaast kan rollen van de flacon worden gebruikt om te bepalen of individuele vliegen nog steeds hun greep reflex.
Terugwinning: Het gedrag test kan worden verlengd door het meten herstel als extra parameter alcohol respons. Staak blootstelling alcohol en blijven maken opmerkingen over de lorr elke 5 minuten. Ga door met de stroom van bevochtigde lucht door de flacons tijdens herstelperiodes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Financiering voor dit onderzoek werd verstrekt door een Program in Neuroscience Award van de Florida State University College of Medicine en steun van de afdeling Biologische Wetenschappen aan FSU. Aanvullende financiering werd verstrekt door een Grant-in-Aid van Onderzoek Fonds de Alcohol Beverage fabrikant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y-connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature air regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature air regulator mounting bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. Deaths: Final data for 2007. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention: National Center for Health Statistics. (2010).
- The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , Columbia University. (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , Available from: www.medtext.com/hdcn.htm (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. Pfaff, D. W., Kieffer, B. 1129, Blackwell Publishing. 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
