Summary
Drosophila har dukket opp som en betydelig modellsystem for å dissekere de cellulære og molekylære grunnlaget for atferdsmessige reaksjoner til alkohol. Her presenterer vi en protokoll for innsamling av alkohol følsomhets data i en circadian kontekst som enkelt kan brukes til andre eksperimenter, og er godt egnet for lågare forskning.
Abstract
Fruktfluer (Drosophila melanogaster) er en etablert modell for både alkohol forskning og circadian biologi. Nylig viste vi at den biologiske klokke modulerer alkohol følsomhet, men ikke dannelsen av toleranse. Her beskriver vi vår protokoll i detalj. Alkohol administreres til fluene hjelp av Flybar. I dette oppsettet er mettet alkohol damp blandet med luftfuktighet i innstilte proporsjoner, og gis til de fluer i fire rør samtidig. Fluer er alet opp under standardiserte forhold for å minimere variasjon mellom replikatene. Tre dager gamle fluer av forskjellige genotyper eller behandlinger anvendes for eksperimentene, fortrinnsvis ved å matche fluer i to forskjellige tidspunkter (f.eks, CT 5 CT og 17) som gjør en direkte sammenligning er mulig. Under eksperimentet blir fluene eksponert i 1 time til den forhåndsbestemte andel av alkoholdamp og antallet fluer som utviser tap av opprettingsrefleks (LORR) eller sedasjon telles hver 5 min. Dataene kan analyseres ved hjelp av tre ulike statistiske tilnærminger. Den første er å bestemme tidspunktet for når 50% av fluene har mistet sin rettende refleks og bruke en analyse av variansen (ANOVA) for å avgjøre om signifikante forskjeller mellom tidspunkter. Den andre er å bestemme prosent fluer som viser Lorr etter et bestemt antall minutter, etterfulgt av en ANOVA analyse. Den siste metode er å analysere hele tiden serie ved hjelp av multivariabel statistikk. Protokollen kan også benyttes til ikke-biologiske eksperimenter eller sammenligninger mellom genotypene.
Introduction
Drosophila melanogaster demonstrere bifasisk atferdsmessige reaksjoner på alkohol en som er analogt til menneskelige reaksjoner på dette stoffet 2,3. Ved førstegangs eksponering for lave konsentrasjoner av alkohol, flyr utstilling økt muskelaktivitet, erstattet av en mangel på motorisk koordinasjon, tap av postural kontroll og rettende reflekser (tap av stabiliserings Reflex: Lorr), og sedasjon (fullstendig mangel på motorisk aktivitet i respons til mekanisk stimulering) som eksponering for alkohol utvikler 4-9. Den endogene biologiske klokke er en sterk modulator av alkohol følsomhet og toksisitet som observeres hos mus 10,11, rotter 12 og 13 mennesker. Nylige fremskritt i Drosophila forskning har vist den biologiske klokke modulerer akutt alkoholfølsomhet, men ikke alkohol toleranse en. De kraftige genetiske metoder tilgjengelige i Drosophila gjennom mutant studier og transgene manipulasjoner av romligog timelig genuttrykk gi et system som tillater rask fremgang i å identifisere de underliggende cellulære og molekylære mekanismer for komplekse atferd. Bruken av Drosophila som en unders verktøyet har tillatt vesentlige fremskritt i forståelsen av alkohol neurobiology som raskt kan oversettes til pattedyr 14-16. For å lette forståelsen av den molekylære mekanismene gjennom hvilke den biologiske klokke modulerer alkohol følsomhet og for jevnt å måle atferdsmessige respons på tvers av cirkadianske tidspunkter, en alkohol administrasjonsprotokollen er egnet for bruk i svakt rødt lys er nødvendig. For Drosophila, kan alkohol administreres gjennom mat-tilskudd for kronisk eksponering eller en pålitelig måte ved administrering av alkohol i form av damp for akutt eksponering. Her beskriver vi en alkohol administrasjon protokoll egnet for vurdering av den biologiske modulering av Tap av opprettingsrefleks (Lorr) 1 samtsedasjon.
Fluer medføres med 12 t: 12 t LD sykluser ved konstant temperatur, og deretter overført til en kontrollert lysregime i 2-5 dager, avhengig av den eksperimentelle spørsmålet. Fluer er utsatt for etanoldamp i en anordning kjent som Flybar. Ved denne anordning, blir kontrollerte mengder luft boblet gjennom vann og alkohol; dampene blir deretter blandet og ledet inn i en ampulle huset fluene. Hver 5 min fluene er scoret for antall som ikke klarer å vise rettende reflekser eller har blitt bedøvet. Lorr prosenter for hvert tidspunkt er beregnet og sammenlignet blant circadian tidspunkter eller mellom stammer av fluer. Enkelheten og påliteligheten av alkohol levering bruker flybar alkohol levering kombinert med atferdsanalysemuligheter gir en betydelig fordel for biologiske eksperimenter utført i mørke omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Montering av flybar
Rasjonale og oversikt: Systemet er utviklet for å administrere kontrollerte prosenter av alkohol damp til fluer. Merk: Figur 1 gir en skjematisk oversikt over den Flybar satt opp som beskrevet nedenfor i tre trinn (montering av luftstrømmen, stilt opp av alkoholen og vann flasker, og montering av observasjons ampuller). Kort sagt blir en jevn luftstrøm deles i to fraksjoner som blir boblet gjennom alkohol og vann, henholdsvis blandes, og administrert til fire observasjons ampuller.
- Montering av Airflow
- Koble et kort stykke fleksibelt silikonslanger til enten bygningen luft eller et akvarium lufter for å skape en enhetlig luftstrøm og delt ved hjelp av en y-kobling. Koble den første gren til den luftstrøm regulator som styrer den totale mengden av luft gjennom systemet (typisk 1000 ml / min i 4 observasjons ampuller).
- Sett en hurtigkobling i andre rørslik at luftstrømmen kan bli avbrutt ved begynnelsen av eksperimentet, uten at det påvirker den kalibrerte luftstrøm. Legg et y-kontakten og koble hver forgrening røret til luftregulatoren.
- Koble slangen til luftstrømmen regulatorer og deretter koble to luftstrømmen meter.
- Oppsett av alkohol og vann flasker
- Legg fleksibel slange til utgangen av luftstrømmen meter og sette inn et tynt glassrør (deler av en ml glass pipetter) med en 90 ° sving inn i slutten av hver rørlengde. Dette vil tjene som innløps-luftstrømmen inn i de vann-og alkohol flasker.
- Plasser gummipropp med to hull gjennom dem inn i flasker fylt med alkohol og vann. Hold begge flasker ved konstant temperatur 2 ° C høyere enn omgivelsestemperaturen ved hjelp av et vannbad. I våre forsøk, blir de miljømessige rom opprettholdt ved 25 ° C, mens den vannbad ved 27 ° C.
- Sett rett glass pipette for enir fjord gjennom gummiproppen og strekker seg inn i fluidet til omtrent 1 cm fra bunnen av flasken.
- Sett en albue-delen av glass-pipette inn i det gjenværende hull i gummiproppen til slutten av glasset er i flukt med bunnen av proppen inne i flasken. Sett denne luftuttaket i en annen lengde på slangen.
- Gjenforene de luftstrømmer ved hjelp av en Y-kobling og bruke en annen lengde av silikonslange for å lede luftstrømmen gjennom en tom blande kolbe eller flaske med bøyde glass pipette seksjoner som er satt inn gjennom en to-hullet gummipropp. Bruk en annen lengde av silikonslanger for uttak blandede luftstrømmen.
- Montering av Observation Vial
- Split utløpsluftstrømmen som kommer ut fra blande-kolben 2-3x å oppnå fire eller åtte mindre strømmer av luft, slik at flere observasjons ampuller kan anvendes i hvert forsøk. Koble den fleksible silikonslanger til observasjon ampuller.
- Sett opp observatipå ampuller ved bruk av tomme ampuller forseglet med en gummikork med to hull gjennom hvilke glass-rør gir et innløp og et utløp for alkoholdamp.
- Dekk til slutten av det første glassrør med netting og holde nettingen på plass ved hjelp av et lite stykke av fleksibelt plastrør. Sett dette rør gjennom det første hullet til det strekker seg til omtrent halve lengden av ampullen. Hvis det er nødvendig, bruker Teflon tape for å få en tettsittende passform.
- Før den andre glassrør også med enden dekket av netting til den er i flukt med den indre kanten av gummiproppen.
- Plasser hetteglassene horisontalt på et hvitt stykke papir for å maksimere kontrast med fluene er svakt rødt lys.
- Bland passende fraksjoner av luftstrømmen boblet gjennom alkohol og luftstrømmen boblet gjennom vann. Overvåke lufttrykket kontinuerlig og foreta justeringer som er nødvendig for å opprettholde ønsket sammenblanding av de luftstrømmer.
Merk: kontinuerlig driftav flere fly Bar assays i parallell eller til og med et enkelt assay i et lite rom kan føre til en merkbar akkumulering av alkoholdamp. For å unngå fortsatte utgivelsen av alkoholdampen som potensielt kan påvirke forskeren i et lukket rom, må en egnet system for å bli satt på plass som i tilstrekkelig grad fjerner alkohol damp genereres under forsøket. Å fjerne alkoholdamp, koble en 6-12 tommers stykke rør på andre glassrøret som stikker ut fra hvert hetteglass, pakke dem og henvise til en trakt-vakuum system. Forskere bør også sørge for at den eksperimentelle testing rom er tilstrekkelig ventilert.
2. Utarbeidelse av forsøksdyr
Rasjonale og oversikt: Riktig kultur og boliger av fluene vil redusere variasjonen i dataene. Dette oppnås gjennom standardisering og minimering av stress opplevd av fluene. Av den grunn er ingen bedøvelse (CO 2 eller alternativer) som brukes undeng noen av de følgende trinnene i protokollen. Videre bør fluer være alder matchet tvers eksperimenter og tidspunkter for å redusere variabiliteten som er standard for andre atferds analyser inkludert læring og hukommelse eksperimenter 17.
Forskjellige lys: mørke forhold kan brukes for å undersøke funksjonen av det biologiske klokke på adferdsrespons til etanol. For å avgjøre om en døgnrytme eksisterer, kan eksperimenter utføres under en definert LD syklus for å måle ytelsen på spesifikke zeitgeber Times (ZT). ZT 0 representerer daggry og er definert som den tiden av lysene på under LD sykluser, mens ZT 12 er tids lysene er slått av med en 12:12 hr LD syklus. Under konstante betingelser, måler circadian tid (CT) tiden for dyret i fravær av miljøsignaler, det vil si fri-løpende tid, og er knyttet til den tidligere LD entrainment syklus. I villtype Drosophila, reflekterer CT foregå ZT for det første flere dagerss i konstante forhold som free-running circadian periode og rytmer er ~ 24 hr. For å måle circadian modulasjon og eliminere akutte lyseffekter på virkemåten, blir fluene medrevet til lys: mørke syklus, og deretter overført til konstant mørke (DD) før eksperimentene. Biologiske eksperimenter utføres på den andre dagen av DD for å måle ytelsen på spesifikke Circadian Times (CT).
I Drosophila, kontinuerlig lys (LL) forhold resulterer i circadian dysfunksjon med fuktet eller avskaffet molekylære svingninger av kjerne biologiske gener og forstyrrelse av atferds døgnrytme som gjenspeiles av arytmisk bevegelsesaktiviteten 18-21 og arytmisk korttidsminne 17. Protokollen er optimalisert for biologiske undersøkelser, og kan forenkles for andre eksperimenter. Alle biologiske eksperimenter er utført med svakt rødt lys (ambient overhead rødt lys <1 lux på benken toppen, små røde lysene brukes på 12 inches fra rør~ 1 lux lys).
- Bakre fluene ved 25 ° C i henhold 12:12 hr lys: mørke entrainment forhold (LD).
- Samle ferskt eclosed fluer på slutten av dag-lyse periode på dag 1, og lagre dem i 24 timer i henhold til forholdene i LD holder hetteglass inneholdende en liten mengde agar høy konsentrasjon mat å minimalisere mat klebrige. Merk: For å sikre sunne, normalt utviklede fluer er samlet, bare bruke fluer samlet i løpet av de første dagene etter eklosjonshormon starter i en kultur flaske.
- Samle grupper av lag 30 (25-35) flyr ved hjelp av en aspirator på dag 2 mot slutten av den lyse perioden, og overføring til nye holde ampuller.
- Bruk en sterk lyskilde for å dirigere fluer til enden av hetteglasset. Innenfor dette område er det nøyaktige antall fluer i hvert hetteglass ikke kritisk så adferdsobservasjoner er rapportert i prosentandeler med totale antall fluer telles ved slutten av hvert forsøk.
- Oppretthold fluer i henhold DD forholdene ved 25 ° C for to dager.
- På dagen for forsøket, plassere alle fluer som befinner seg i forskjellige tilstander eller andre enn den eksperimentelle oppførsel plass i rommet i minst en time før eksperimentet inkubatorer. Akklimatisering reduserer variasjon pga endringer i temperatur eller fuktighet.
- Lag målinger seks tidspunkter dag (CT 1, 5, 9, 13, 17 og 21) for å teste for circadian modulering av virkemåten.
- Sammenligne flere tidspunkter i løpet av et enkelt sett med atferdseksperimenter for å øke robustheten i eksperimentell design og minimere variabilitet spesifikke for et enkelt eksperiment. For eksempel kan observasjoner av CT 1 CT og 13 oppnås samtidig, dersom to inkubatorer med motsatt lys-mørke tidsplaner benyttes for innblanding.
Merk: Den ovenfor angitte prosedyre beskriver fremstilling av forsøksdyr for analyser utført på biologiske tilstanden til konstant mørke. Forskjellige lys: mørke forhold kan brukes for å undersøke funksjonen av klokkei de atferdsmessige reaksjoner på alkohol. For å avgjøre om en døgnrytme finnes forsøkene kan utføres under en LD syklus for å måle ytelsen på spesifikke zeitgeber Times (ZT). I tillegg kan den protokoll brukes med fluer hevet under konstante lysforhold for eksperimenter testing circadian dysfunksjon. For alternative protokoller som tester fluer plassert i lysforhold, bør atferdsanalyser fortsatt utføres under mørke forhold. Fluer som skal overføres inn i den mørke i 1 time før eksperimentet for å minimalisere variabiliteten atferds på grunn av de akutte virkninger av lys på virkemåten.
Tre. Behavioral Observasjoner
Rasjonale og oversikt: Følgende alkohol administrasjon protokollen er optimalisert for observasjoner i henhold svakt rødt lys tilstand. Den to atferdstiltak Lorr og sedasjon representerer to forskjellige punkter av fly beruselse. Lorr representerer en sen punkt beruselse innlemme tapet of motor og postural kontroll, mens sedasjon tiltak en veldig sen sluttpunkt av beruselse. Genotype-eller døgn modulation kan påvirke disse to tiltakene annerledes; derav en kan ønske å undersøke begge. Kort sagt, blir fluene som er lagt i ampullene blir antallet fluer som viser LORR eller sedasjon mottok hver 5 min under eksponering alkoholdamp, og det totale antall fluer telles ved slutten av forsøket.
- Før du starter forsøket, kjøre luft gjennom systemet (luft boblet gjennom vann og alkohol flasker) i minst 10 min og bruke den tiden til å kalibrere luftstrømmene.
- Koble quick release å stoppe luftstrømmen. Laste fluene i hetteglassene, og koble luftstrømmen og starte tidtakere. Merk: Hvis ikke svarer fluer eller døde fluer er igjen i holding ampuller, kan dette være en indikasjon på stress forhold. Generelt, kan disse forholdene bli mildnet av boliger færre fluer i holding ampuller eller redusere mat klissete ved hjelp av en litenly høyere agar konsentrasjon under matlaging. For optimale atferdsanalyser og minimal variasjon mellom eksperimenter, bør fluer være sunn før eksperimenter.
- For nøyaktig tidtaking, bruke en tidtaker for å holde orden på den totale tiden av alkohol eksponering og bruke et sekund teller-back tidtaker for å markere 5-min intervaller.
- Legg et stykke hvitt papir under ampullene for å øke kontrasten og fly synlighet, spesielt under svake rød lysforhold.
- Kontroller luftstrømmen regelmessig under et eksperiment for å opprettholde et konstant nivå. Vanligvis, når luftmengder har stabilisert seg, at de holder seg stabile under lengden av forsøket.
- Tell antall fluer som har mistet sin rettende refleks gang hvert 5 min for en en-timers periode. Som alkohol følsomheten varierer mellom genotyper og genetiske bakgrunn, kan det være ønskelig å utføre hyppigere vurderinger, eller for å gjennomføre forsøk over en lengre tidsperiode.
- Løft flasken slightly fra overflaten, og retter lyset fra en rødt-lys lommelykt mot papiret bak beholderen. Hold håndholdte røde lykter på en avstand på minst 12 inches til den eksperimentelle hetteglasset for å opprettholde lysnivåer ikke større enn 1 lux for alle eksperimenter er svakt rødt lys.
- Mål lysnivået ved hjelp av en lysmåler for å etablere standarder for alle eksperimenter.
- Bestem antall fluer som har mistet sin rettende refleks ved å bruke et fast trykk til hetteglasset og telle hvor mange fluer unnlate å gjøre rett seg innenfor ca 4 sek. Fluer som viser Lorr kan fortsatt flytte sine bein og vinger, men kan ikke slå seg oppreist.
- På slutten av økten, telle det totale antall fluer i hvert hetteglass.
Merk: Noen ganger kan en enkel flue bli fanget mellom stopperen og siden når lasting flyr inn i de eksperimentelle ampuller. Når dette er gjort i mørket, kan det ikke lett bli lagt merke til, slik det er nødvendig for å telle det totale nummeneh av fluer på slutten av forsøket til riktig beregne prosenter.
I tillegg gir denne fremgangsmåten også kan anvendes for å måle sedering av fluer, noe som representerer en annen atferds endepunkt. Mens sederte fluer har mistet retten refleks, krever sedasjon større alkoholinntak. Adferd, kan sedasjon være preget av fullstendig mangel på tydelig motorisk aktivitet med fluer rester urørlig i hetteglasset etter aa fast springen til hetteglasset. For sedasjon, telle antall fluer som forblir urørlig uten ben vinke etter levering av et fast trykk av hetteglasset. I tillegg kan hetteglasset bli rullet fra side til side for å avgjøre om den enkelte fluer fortsatt beholde sin gripe refleks.
4. Data Analysis
- Bestem den prosent LORR ved hvert tidspunkt vurderes basert på det totale antall fluer i hvert hetteglass.
- Estimat forskjeller mellom døgnrytmen tidspunkter eller påkjenningen ved beregningenng av 50% LORR for hver prøve, som faller innenfor den lineære delen av den sigmoide kurve (se figur 2 nedenfor).
- Alternative statistikk:
- Ved sammenligninger mellom genotypene planlegges, er det ønskelig å analysere hele tidsforløpet ved hjelp av gjentatt tiltak ANOVAand for å bestemme området for tidspunkter at forskjellene er signifikante med post-hoc tester (figur 3). For disse testene, foretrekker vi å bruke en verdi på 0,001. Dette gjør at forskjeller på individuelle eksponeringstider for å bli vurdert, samt forskjeller mellom genotyper i helningen på kurven.
- Forskjeller i følsomhet for kan bestemmes etter bestemte tider av alkohol eksponering for en bestemt reaksjon, for eksempel sedasjon fra den lineære del av grafen (figur 4).
- Forskjeller mellom stammer eller circadian tidspunkter kan beregnes ved hjelp av standard F-statistikk og post-hoc tester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Circadian Modulation of Alcohol Følsomhet bruker 50% Lorr som en markør.
Et representativt eksempel som viser circadian modulering i alkohol følsomhet i løpet av dagen er presentert i figur 2.. LORR ble målt til seks tidspunkter under 2. dag med DD i Canton-S og 50% LORR ble bestemt for hvert tidspunkt. Analyser viste en signifikant effekt av tid på dagen (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 per tidspunkt). The Fisher LSD test viste signifikante forskjeller mellom CT1 vs CT5, CT5 vs CT13, CT5 vs CT17, CT5 vs CT 21, CT9 vs CT13, CT9 vs CT17, og CT9 vs CT 21. Er konsistent Dette resultatet med våre tidligere publiserte resultater 1.
Forskjeller mellom Wild-type og Mutant fluer.
Det andre eksemplet bruker tidsserier for å vise forskjeller i Lorr og sedasjon mellom vill-type Canton-S fluer og flies som bærer en tap-av-funksjon hvitt mutasjon (w 1118) i samme genetiske bakgrunnen (figur 3). W 1118 mutasjon er av spesiell interesse for Drosophila forskere som transgene linjer er ofte laget ved hjelp av disse fluene og mange muterte linjer for biologiske klokke gener har også w 1118 mutasjon. Resultatene er presentert som en tidsserie (fig. 3) med data som vises for hvert 5 min under hele eksponeringstiden. Observasjoner er begrenset til 60 minutter for å unngå effekten av rask toleranse oppbygging 22-24. De w 1118 mutanter viser betydelig redusert LORR følsomhet i respons til etanol damp enn det Canton-S (ANOVA mellom fag F 1,10 = 57,12, p <0,001, n = 6). Betydning forskjeller (a = 0,001) ble funnet i dette forsøket fra min 20 gjennom min 60 (figur 3A w 1118 og Canton-S ble også funnet i frekvensen av sedasjon (ANOVA mellom fagene F 1,10 = 137,301, p <0,001, N = 6). I sedasjon analysen ble det påvist signifikante forskjeller (a = 0,001) funnet i minutter 50, 55, og 60 (Figur 3B). I tillegg til den manglende screening pigmenter i øynene, er w 1118 mutanter også har reduserte nivåer av serotonin, dopamin og histamin 25,26. Disse endringene i biogene aminnivåene kan forklare den endrede følsomhet for etanol i w 1118 mutanter 27,28. Derfor kan kontrollere graden av hvitt til uttrykk i de analyserte genotyper være avgjørende for nøyaktig vurdering av etanol følsomhet.
Circadian Modulation av sedasjon.
I det tredje eksempelet, målte vi hvor mange prosent av Canton-S flyr sedated etter en viss tid for å avgjøre om det er en circadian effekt av alkohol på sedasjon (figur 4). Vi sammenlignet andelen av fluer bedøvet på 40 min (30% alkohol damp) på CT 5 og 17, og resultatene viser at det er betydelig færre sederte fluer i løpet av dagen i forhold til alkohol eksponering i løpet av natten (ANOVA: F 1,20 = 6.21, p = 0,022, N = 10 (CT5) og 12 (CT17)). Fluene nådde ikke 50% sedasjon mark i løpet av timen som observasjonene ble gjort i henhold til våre standard Lorr forhold for å foreta en direkte sammenligning mulig. Observasjoner utover timen er problematisk på grunn av opphoping av rask toleranse 22-24. I dette eksperimentet, ble mindre enn 25% av fluene i hver circadian tidspunkt bedøvet i 40 min, noe som indikerer at det er en forskjell i forkanten sedasjon følsomhet mellom disse grupper. Innsamling av data på dette tidlige tidspunkt i sedasjon er en nyttig anmerketion som forskjeller, men evnen til å bestemme effekten av behandlingen av formen på fordelingen i sedasjon responser er begrenset. For å bestemme om det er forskjell i hele sedasjon fordeling, bør en høyere etanolkonsentrasjon anvendes for å sikre en hurtigere rate av sedasjon.
Figur 1. Den flybar å måle alkohol følsomhet og sedasjon i fruktfluer.
.. Figur 2 representativt eksempel som viser signifikant circadian modulering i alkohol følsomhet i løpet av dagen (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 pr tidspunkt; signifikante forskjeller mellom CT5 vs CT1, CT13, CT17, og CT21 og CT9 vs CT13, CT17, og CT21).
Figur 3. Effekter av alkohol på atferdsmessige reaksjoner er vesentlig forskjellige mellom villtype Canton-S flyr og tap-av-funksjon hvite 1118 mutant fluer. A) Canton-S fluer viser betydelig økt følsomhet for alkohol målt ved Lorr forhold til fluer med samme genetiske bakgrunn bærer den hvite mutasjon (ANOVA mellom fag F 1,10 = 57,12, p <0,001, n = 6). B) Canton-S-fluer er mer utsatt for alkohol sedasjon enn w 1118 mutanter (ANOVA mellom fag F 1,10 = 137,301, p <0,001, N = 6). *p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
. Figur 4 Representative data som sammenligner andelen av Canton-S fluer bedøvet på 40 min mellom CT 5 og CT 17 Wild-type fluer viser signifikant større økning i innledende sedasjon ved CT 17 sammenlignet med CT 5 (ANOVA:. F 1,20 = 6.21, p = 0,022, N = 10 (CT5) og 12 (CT17)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kostnadene ved alkoholmisbruk og alkoholisme for samfunnet er enorm, både i form av menneske 29 og økonomiske kostnader 30,31. Drosophila som modell tilbyr en rask og allsidig system for raskt å undersøke atferdsmessige reaksjoner av et stort antall individer og som sådan har vært mye brukt for både alkohol 5,7,32-34 og circadian forskning 35-37.
Her beskrev vi en grei protokoll for kontrollert inntak av alkohol damp til voksne fluer i henhold til biologiske forhold.
Fluer dyrket under standardiserte forhold er utsatt for alkohol damp for en time der antall fluer som har mistet sin rettende refleks er scoret hvert 5 min. Protokollen er beskrevet i dette dokumentet er optimalisert for biologiske eksperimenter på grunn av de tilleggskrav for entrainment og boliger under konstante forhold. Ulike tiltak kan være forenklinged for generiske studier ved å fjerne de skritt som er nødvendig for de biologiske eksperimenter som lagring i mørket for minst en dag eller gjør forsøkene er svakt rødt lys. Denne protokollen kan også brukes til å avsløre store antallet fluer på en kontrollert måte i varierende alkoholkonsentrasjoner for etterfølgende biokjemiske og molekylære analyser. For konsistens med andre Drosophila atferdseksperimenter som læring og hukommelse observasjoner, måling av atferdsmessige reaksjoner i svakt rødt lys kan være ønsket selv for ikke-biologiske eksperimenter.
Variasjon mellom uavhengige replikater av eksperimentet kan skjule små forskjeller mellom mutanter eller transgene stammer eller mellom biologiske tidspunkter. Det anbefales derfor å teste ut prøver av flere stammer eller døgnrytmen tidspunkter samtidig (se våre eksempler) slik at "kopi" kan bli lagt til som en tilfeldig variabel for å eliminereEffekten av variasjonen mellom kopier.
Følsomhet for alkohol varierer mellom stammer. Alkohol prosenter (den prosent av luftstrøm boblende gjennom alkohol) må justeres tilsvarende. Som vist i figur 3, fluer bærer den hvite mutasjon er mindre utsatt for virkningen av alkohol eksponering enn villtype Canton-S fluer. For analyse av linjene bærer den hvite mutasjon, kan det være ønskelig å øke andelen av alkohol som fluene er eksponert slik at den utfører de atferdsanalyse i samme tidsrom fra andre eksperimenter som lengre eksponering for alkohol kan resultere i hurtig toleranse utvikling. For ekstremt sensitive mutanter og for eksperimenter der det er nødvendig for å redusere andelen av alkohol som brukes, slik som observert for fluer inneholdende en mutasjon i gul-genet, kan luftmengden må økes for å kalibrere alkohol mettede luftstrømmen nøyaktig. Små økninger eller fellingreases (± 10%) i total luftmengde (gjennomførbar luftstrøm spenner fra 900-1,100 ml / min for fire observasjonshetteglass) synes ikke å ha negativ innvirkning fluene.
Observasjoner utover en time bør unngås når det er mulig på grunn av potensialet for rask toleranse buildup i fluene 22-24 som påvirker alkohol følsomhet. I stedet, bestemme alkoholprosent for hver stamme som resulterer i en omtrentlig 50% Lorr med 30-40 min. Hvis det er nødvendig sammenligning av flere uavhengige stammer, velge et enkelt prosentandel av alkohol som fungerer for alle stammer.
Denne protokollen er svært avhengig av atferdsobservasjoner, så streng overholdelse av en standardisert protokoll er viktig å unngå drift i atferdsobservasjoner over tid. Hvis mulig, bør atferdsobservasjoner utføres slik at observatøren er blind for genotype eller tidspunkt blir testet. For å påvise potensielle skjevhet basert på disse og andre ukjente faktorerer det tilrådelig å undersøke data på en gang kurs og for å kontrollere at observasjonene forblir innenfor samme område gjennom hele forsøksserien.
Den Flybar set-up gir visse fordeler framfor andre metoder for alkohol administrasjon for fluer, spesielt for undergraduate forskere eller biologiske studier på de negative effektene av etanol. En alternativ enhet for å måle effekten av alkohol på motorisk kontroll i fluer er inebriometer, kan en vertikal kolonne i hvilken etanol damp sirkuleres gjennom stigende ledeplater og tap av postural kontroll eller sensitivitet av flue måles ved å bestemme den tid det tar til å falle til bunnen av kolonnen 38,39. Den inebriometer gir en automatisk avlesning av tap-av-postural kontroll og har vist seg verdifull for alkohol forskning i Drosophila 9,22,39,40, men dette adferds paradigmet krever forholdsvis kostbart utstyr, plass for anordningen, og tid til å kalibrereog optimalisere forholdene. Dermed kan inebriometer ikke være godt egnet for mange undergraduate undervisning laboratorier med begrensede budsjetter eller plass, eller for forskere som utfører biologiske analyser. En annen metode for å levere alkohol til fluer og måle sedasjon innebærer å plassere en liten mengde av flytende alkohol på et absorberende materiale, enten på toppen eller i bunnen av en flaske, og deretter å la alkoholen fordamper med tiden 41,42. Ettersom konsentrasjonen av alkoholdamp øker med tiden, kan atferdsrespons bedømmes. Mens denne leveringsmåten er enkel å sette opp, mengden alkohol damp som fluene blir utsatt varierer med tid og forhold. For eksperimentelle spørsmål hvor forskjellene er vurdert i innledende forekomst av sensitivitet eller sedasjon, slik som circadian modulering, er det ønskelig å ha et konstant nivå av alkoholdamp levert til fluene. I tillegg, eksponering av et stort antall fluer til en konstant mengde alkohol exposure, som utføres med Flybar, er ønskelig for den nøyaktige utførelse av nedstrøms cellulære eller biokjemiske analyser. En annen metode for å levere alkohol til fluer vanlige tidlig Drosophila alkohol forskning innblanding av alkoholen i maten som det ble fremstilt. Selv om denne metoden er enkel og krever liten oppsett, er det best egnet for kronisk alkohol eksponering over dager som konsentrasjonen av alkohol forandrer seg med tiden.
Mer avanserte, automatiserte metoder er også tilgjengelig for å vurdere bevegelses svar av fluer til alkohol eksponering inkludert video aktivitet opptak og bildeanalyse programvare 7,43. Disse er spesielt kraftig for å vurdere de positive, hyper-aktivering effekten av etanol. Imidlertid kan disse automatiserte metoder være uoverkommelig dyrt for undergraduate forskningsprosjekter eller undervisning laboratorier og kan ikke optimalt designet for analyse av et stort antall fluer i henhold circadian tilstandsjoner (for eksempel videoopptak i mørke omgivelser krever balansert og diffuse infrarød belysning og infrarøde følsomme kameraer). Vi tror at flybar gir en enkel å sette opp, kostnadseffektiv metode for alkohol levering systemet og vurderingen av atferdsmessige reaksjoner på alkohol som er godt egnet til en rekke forhold og laboratorie design.
PROTOKOLL ENDRINGER:
Den protokoll som er beskrevet ovenfor er rettet mot å undersøke effekten av alkohol eksponering på Loss-of-rettende refleks i en circadian sammenheng. Imidlertid kan protokollen enkelt endres til å romme andre typer alkohol eksperimenter.
Undersøke responsen til alkohol under 12 år hr-12 hr Light-Mørk (LD; zeitgeber Tid) forhold: Opprettholde fluer etter 12 timer: 12 hr LD sykle til eksperimentet. Overfør fluene til den mørke omtrent 1 time før forsøket utført i løpet av den lette fasen (ZT 1, 5Og 9) av dagen. Dette vil sikre at den akutte effekten av lyset ikke blander sammen resultatene.
Undersøke responsen til alkohol under konstante lysforhold: Dyrknings fluer under konstante lysforhold resulterer i avbrudd av deres biologiske klokke 18-21 og arytmisk respons på alkohol eksponering en. Fluer kan overføres til den mørke omtrent 1 time før forsøket for at fluene er testet under de samme betingelser som fluer opprettholdt i LD-eller DD-forhold.
Sedasjon: Fluer som er bedøvet kan skilles fra Lorr flyr fordi fluer forbli ubevegelig på bunnen av flasken, mens Lorr fluer vil fortsatt flytte sine vinger, hode og ben. Fluer som utstillings Lorr fortsatt svare med små bevegelser når hetteglasset forstyrret. Sedering av fluer bestemmes av telle antall fluer værende ubevegelig etter at en fast tap til hetteglasset. I tillegg kan rulle av ampullen brukes til å bestemme hvorvidt individuelle fluer fremdeles beholde sin gripe refleks.
Recovery: Den atferdsmessige analysen kan utvides ved å måle utvinning som en ekstra parameter av alkohol respons. Avvikle alkohol eksponering og fortsette å gjøre observasjoner om Lorr hvert 5 min. Fortsett strømmen av fuktet luft gjennom ampuller under utvinning perioder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Finansiering for denne forskningen ble gitt av et program i Neuroscience Award fra Florida State University College of Medicine og støtte fra Institutt for biologisk vitenskap på FSU. Ytterligere finansiering ble gitt av en Grant-i-Aid fra alkohol Beverage Produsentens forskningsfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y-connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature air regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature air regulator mounting bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. Deaths: Final data for 2007. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention: National Center for Health Statistics. (2010).
- The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , Columbia University. (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , Available from: www.medtext.com/hdcn.htm (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. Pfaff, D. W., Kieffer, B. 1129, Blackwell Publishing. 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
