Summary
果蝇已经成为解剖的行为反应，以酒精的细胞和分子基础的一个显著的模型系统。在这里，我们提出了一个协议，用于酒精的敏感性数据的，可以很容易地应用到其他的实验，是非常适合本科生科研昼夜上下文的集合。
Abstract
果蝇（ 果蝇 ）是一种成熟的模式为酒精的研究和昼夜生物。最近，我们发现，生物钟调节酒精的敏感性，但不能耐受的形成。在这里，我们详细描述了我们的协议。酒精是给予使用平衡翼的苍蝇。在这种设置中，饱和酒精蒸气与加湿空气混合比例设置，并给予苍蝇在同时四根管子。苍蝇是为了尽量减少重复之间的差异在标准条件下饲养。三日龄果蝇不同的基因型或治疗方法，所用的实验中，优选通过匹配两个不同的时间点（ 例如 ，CT 5和CT 17）苍蝇进行直接比较成为可能。在实验过程中，苍蝇暴露1小时，以酒精蒸气的预定百分比和苍蝇的数量表现出翻正反射消失（LORR）的损失或sed的振动性进行计数，每5分钟。中的数据可以使用三种不同的统计方法来分析。首先是要确定在哪个苍蝇的50％已失去翻正反射时，使用方差分析（ANOVA）来确定的时间点之间是否存在显著差异。第二个是确定的百分比苍蝇指定的分钟数，后跟一个单因素方差分析后显示翻正反射消失。最后一种方法是分析整个时间序列采用多元统计。该协议也可以用于基因型之间的非生理实验或比较。
Introduction
果蝇表现出双相的行为反应，以酒精1是类似于人类的反应，此药2,3。在初始接触低浓度的酒精，苍蝇展览增加自发活动，由于缺乏运动协调，姿势控制的损失和扶正反射（翻正反射消失的：翻正反射消失）取代，镇静（完全没有响应运动活动机械性刺激）作为暴露于酒精的进展4-9。内源性生物钟是一个强大酒精的敏感性和毒性的调制器在10,11小鼠，大鼠12观察，和人类13。在果蝇研究的最新进展表明，生物钟调节急性酒精的敏感性，但没有酒精的耐受1。通过突变体的研究和空间的转基因操作的强有力的遗传可在果蝇方法和时间上的基因表达提供了一个系统，允许在识别复杂行为的基本细胞和分子机制进展迅速。利用果蝇作为调查工具已经允许在了解酒精神经生物学实质性的进步，可以迅速转化为哺乳动物14-16。为了方便，通过该生物钟调节酒精的敏感性的分子机制的理解，并均匀地测量整个昼夜时间点的行为反应，适于在昏暗的红光条件下使用醇的给药方案是必需的。对于果蝇 ，酒精可通过食物补充对慢性接触或通过可靠的蒸汽急性暴露的形式，行政的酒精管理。在这里，我们描述了适用于失的扶正反射（翻正反射消失）1昼夜调制的评估，以及酒精管理协议镇静。
蝇夹带有12小时：12小时LD周期在恒定的温度和然后转移到控制光制度为2-5天取决于实验的问题。蝇中被称为平衡杆的装置暴露于乙醇蒸气。在该装置中，控制量的空气通过水和醇鼓泡;蒸气，然后混合并定向到小瓶外壳的苍蝇。每5苍蝇分钟被打进了失败，显示扶正反射或已成为镇静的数量。 LORR百分比为每个时间点计算并比较了昼夜时间点或苍蝇的菌株之间。酒精交付使用平衡翼酒精交付并结合行为分析选项的简便性和可靠性提供了黑暗的条件下进行昼夜实验一个显著的好处。
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Protocol
在平衡翼1。大会
基本原理和概况：该系统的设计管理酒精蒸气的控制百分比苍蝇。注意： 图1提供了一示意性的概述的平衡杆设置为三个阶段（空气流的组件，设置在醇和水的瓶子，并观察小瓶组件）下面描述。总之，一个稳定的气流被分成通过酒精和水，鼓泡分别混合，给药于4观察小瓶两个馏分。
- 气流大会
- 连接一段简短的弹性硅胶管连接到无论是建筑物空调或水族箱增氧机来生成使用Y型连接器的稳定的空气流量和分流。连接所述第一分支的空气流量调节器，用于控制空气的总量通过系统（通常千毫升/分钟4观察小瓶）。
- 插入快速连接器在所述第二管使空气流可在实验开始时不影响校准的气流被中断。添加一个Y形连接器和各分支管连接到气流调节器。
- 连接管的气流调节器，然后连接两个气流米。
- 建立了酒精和水的瓶
- 加柔性管来的气流米的出口，然后将细玻璃管（1毫升玻璃移液管部分）与90°弯曲成管的每个长度的末端。这将作为进气空气流进入水和酒精瓶。
- 将橡胶塞与2个孔，通过它们放入盛有酒精和水的瓶子。保持两个瓶在恒温下2℃比使用水浴周围空气的温度更高。在我们的实验中，对环境的室温保持在25℃，同时在水浴是在27℃下
- 将直玻璃吸管的一IR入口穿过橡胶塞和延伸进入所述流体，直至从瓶的底部约1厘米。
- 插入的玻璃移液管肘节成在橡胶塞的剩余孔中，直到该玻璃的端部是与瓶内的止动器的底部齐平。插入管子的另一长度这个出气口。
- 使用Y型连接器团聚空气流，并使用硅胶管的另一长度，通过一个空混合瓶或瓶子通过双孔橡皮塞插入弯曲的玻璃吸管部分，以引导气流。使用硅胶管的另一长度为出口混合气流。
- 观察瓶的大会
- 分割的出口气流从混合箱2-3X新兴取得空气的4或8个更小的流，使多个观测小瓶可以在每个实验中被使用。将柔性硅胶管，以观察小瓶。
- 设置observati使用用橡胶塞含两个孔，通过该玻璃管提供一种用于酒精蒸汽入口和一个出口的密封空小瓶小瓶中。
- 覆盖网的第一玻璃管的端部，用一小片软塑料管保持丝网到位。通过第一孔插入该管，直到它延伸到所述小瓶的大约一半的长度。如果需要，使用铁氟龙胶带，以获得舒适的位置。
- 插入第二玻璃管也与端部覆盖扣除，直到它与橡胶塞的内边缘平齐。
- 水平放置在一个白色纸条的小瓶以最大化与红色的昏暗光线条件下的苍蝇对比度。
- 气流的混合适当的馏分通入酒精和水，通过气流冒泡。连续监测的空气压力，并根据需要来维持空气流的期望的混合进行调整。
注：连续运行几个飞律师分析在一个小房间并行，甚至一个单一的检测可导致酒精蒸气的明显积累。为了避免酒精蒸气的潜在影响，研究者在一个封闭的房间中不断释放，相应的系统需要到位的充分消除了实验过程中产生酒精蒸气。要删除的酒精蒸气，连接6-12英寸的管件上的第二玻璃管从每个小瓶突出，捆绑他们，并直接向漏斗真空系统。研究人员也应确保实验测试房间充分通风。
2，准备实验动物
基本原理和概况：适当的文化和苍蝇的住房将减少变异中的数据。这是通过标准化的应力经历了苍蝇和最小化来实现。出于这个原因，没有麻醉（CO 2或替代品）用于杜里纳克任何协议的步骤如下。此外，苍蝇应该是年龄匹配的整个实验时间点为是标准的其他行为的分析，包括学习和记忆的实验17，尽量减少可变性。
不同的光：暗光条件下可以用来探测生物钟在乙醇的行为反应的功能。如果要判断一个昼夜节律存在，可以实验下一个定义LD周期内执行特定Zeitgeber时报（ZT）来衡量性能。 ZT 0代表黎明和被定义为下LD循环灯的时间，而ZT 12是时候关灯用12:12小时LD周期。在恒定的条件下，昼夜时间（CT）测量时间为动物在没有环境信号， 即自由运行时间，并且是与前面的LD夹带周期。在野生型果蝇 ，CT反映的是前ZT第几个天恒定的条件下作为自由运行的昼夜周期和节奏s为〜24小时。为了测量昼夜调制和消除行为急性光效，苍蝇夹带光：暗循环，然后转移至恒暗光条件下（日）之前的实验。生理实验对DD的第二天进行特定的昼夜时间（CT）来衡量绩效。
在果蝇中，连续光（LL）条件下导致生理功能障碍的核心昼夜节律基因和破坏行为的昼夜节律就证明了心律失常自发活动18-21和心律失常短期记忆17湿布或废止分子振荡。该协议被优化用于昼夜节律的研究，并且可以简化用于其它实验。红色的小灯在12英寸的管道使用;所有生理实验使用的是昏暗的红光（环境头顶红灯<1勒克斯的台式进行〜1勒克斯光）。
- 在25°C下12点12分小时光照后的苍蝇：黑暗夹带条件（LD）。
- 收集新鲜eclosed苍蝇在第1天的日光期末，并将它们存储为LD条件下24小时的控股含有少量的高浓度琼脂食物，尽量减少食物粘性小瓶。注：为了确保健康，发育正常果蝇收集，只能用苍蝇在第一天收集羽化后开始在培养瓶。
- 收集约30（25-35）批次苍蝇使用吸气第2天向光期结束，并转移到新的控股瓶。
- 使用强光源直接苍蝇小瓶的尽头。在此范围内，如行为观察的报告形式与苍蝇在每个实验结束时计数的总数的百分比苍蝇在每个小瓶中的确切数目并不重要。
- 保持苍蝇DD条件下，在25°C FOS两个天。
- 在实验当天，将收纳在不同的条件或孵化比实验行为室在室内放置至少1小时，在实验之前，其他所有的苍蝇。驯化减少了可变性，由于温度变化或湿度。
- 为了测试行为的昼夜调制使得在一天（CT 1，5，9，13，17和21）六个时间点的观测。
- 在单一组的行为学实验，增加实验设计的鲁棒性和可变性的具体最小化到一个单一的实验比较多的时间点。例如，CT 1和CT 13观测可同时获得如果两个孵化器具有相对的光 - 暗时间表用于夹带。
注：以上介绍的准备实验动物在不断的黑暗昼夜条件下进行试验。不同的光：暗光条件下可以用来探测时钟的功能在行为反应的醇。如果要判断一个昼夜节律存在的实验可以在一个周期LD在特定Zeitgeber时报（ZT）进行衡量绩效。此外，该协议可以用于在恒定光照条件下进行实验测试生理功能障碍引发苍蝇。对于测试苍蝇装在光照条件下的替代方案，行为分析仍应黑暗条件下进行。苍蝇应该转移到黑暗1小时的实验之前，对行为的变异减少因光线对行为的急性影响。
3，行为观察
基本原理和概况：以下酒精的给药方案进行了优化昏暗的红光条件下的观察。这两种行为的措施翻正反射消失和镇静代表飞醉的两个不同的点。 LORR代表解酒的后期结合点的损失Øf电机和姿势控制，中毒而镇静措施很晚终点。基因型或生理调节可能会影响这两项措施有所不同;因此人们可能希望同时检查。总之，苍蝇在小瓶加载，蝇显示LORR或镇静的数量进行评分中的酒精蒸气曝光每隔5分钟，和苍蝇在实验结束时计算的总数。
- 在实验开始前，通过系统（通过水和酒精瓶空气鼓泡）下至少10分钟运行的空气，并使用该时间来校准气流。
- 断开快速释放停止气流。加载苍蝇在小瓶中，并重新气流并启动定时器。注意：如果反应迟钝或苍蝇死苍蝇留在控股小瓶，这可能是反映应力条件。在一般情况下，这些条件可以由容纳在所述保持小瓶苍蝇更少或使用轻微减少食物的粘性可以减轻食物制备过程中LY更高的琼脂浓度。为了获得最佳的行为分析和实验之间的最小变异，苍蝇应该是之前的实验健康。
- 为了获得准确的计时，使用一个定时器来保持酒精暴露的总时间的轨道，并使用第二计数计时器回为纪念5分钟的间隔。
- 下方放置小瓶一张白纸可以提高对比度，飞的知名度，尤其是在昏暗的红灯条件。
- 定期检查气流实验过程中保持恒定的水平。通常，一旦气流稳定后，它们在实验的长度期间保持稳定。
- 计数的苍蝇已失去正位反射一次，每5分钟进行1小时内的数目。作为醇敏感性的基因型和遗传背景之间变化，这可能是可取的，以执行更频繁的评估或作实验的时间较长。
- 将样品瓶slightlY从表面上看，和直接从红光手电朝着小瓶后面的纸张的光。保持手持红色手电筒在该实验瓶中的距离至少为12英寸到维持清淡水平不低于1勒克斯更大的暗淡红光条件下的所有实验。
- 使用测光表来建立所有实验的标准测量光照水平。
- 确定苍蝇已失去翻正反射施加自来水公司向小瓶，并计算有多少苍蝇未能在大约4秒合适自己的号码。这显示LORR苍蝇可能仍然把他们的腿和翅膀，但不能把自己的正直。
- 在会议结束时，计数的苍蝇在每个小瓶的总数。
注意：有时，单个苍蝇可能装载时飞入试验小瓶制动器和侧之间被捕获。因为这是在黑暗中进行，它可能不容易发现，所以有必要计算总麻木蝇呃在实验过程中正确计算百分比的末端。
此外，该程序也可被用来测量镇静苍蝇，它代表一个不同的行为端点。而镇静剂苍蝇失去了正确的反射，镇静需要更大的酒精暴露。行为上，可以镇静的特点是完全没有明显的运动功能具有以下AA自来水公司向小瓶苍蝇一动也不动在小瓶中。镇静，计数苍蝇依然没有腿挥舞着小瓶的坚定水龙头下面一动不动交付的数量。此外，小瓶可以卷起一边到另一边，以确定个别苍蝇是否仍保留其敛反射。
4，数据分析
- 确定百分比LORR在每个基于苍蝇在每个小瓶中的总数评估的时间。
- 通过calculati昼夜的时间点或品系间的差异估算纳克的50％LORR对于每个样品，它落在S形曲线的线性部分内（见下面的图2）。
- 另类统计：
- 如果计划的基因型之间的比较，希望采用重复测量ANOVAand确定的时间点的范围内，该差异与事后测试显著（ 图3）分析整个时间过程。对于这些测试，我们优选使用0.001的值。这允许在单个曝光时间的差异进行评估，以及在该曲线的斜率基因型之间的差异。
- 在对灵敏度的差异可为酒精暴露于如从图中（ 图4）的直线部分的镇静特定响应的特定的时间来确定。
- 菌株或昼夜时间点之间的差可以使用标准的F统计量和事后测试来估计。
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Representative Results
酒精的敏感性，使用的50％翻正反射消失为标志的昼夜调制。
一个典型的例子显示，白天昼夜调制在酒精的敏感性示于图2。LORR在进行DD在广州-S中的第 2天测量在六个时间点，50％翻正反射消失为每个时间点确定。分析表明，一天中的时间显著作用（ANOVA：F 5,45 = 7.39，P <0.001，N = 6-10每个时间点）。费雪LSD检验表明CT1之间的显著差异与CT5，CT5与CT13，CT5与CT17，CT5与CT 21，九号货柜码头与CT13，九号货柜码头与CT17，和九号货柜码头与CT 21，这个结果是一致的与我们以前的发布结果1。
之间的差异野生型和突变果蝇。
第二个示例使用时间序列显示在翻正反射消失的差异和野生型广-S苍蝇和FLI的镇静ES携带功能丧失的突变白色（W 1118），在相同的遗传背景（ 图3）。 瓦特1118突变是特别感兴趣的果蝇研究人员为转基因株系使用这些苍蝇和生物钟基因突变多线也有瓦特1118突变常常产生。该结果表示为一个时间序列（ 图3）与所示为在整个暴露期间，每隔5分钟的数据。观察被限制为60分钟，以避免快速耐受22-24建设的影响。在W 1118的突变体显示响应乙醇蒸汽显著减少翻正反射消失的灵敏度比不广-S（单因素方差分析受试者氟咯之间= 57.12，P <0.001，n = 6）。显着性差异（α= 0.001）被发现在本实验从20分钟至60分钟（ 图3A 瓦特1118和广-S差异（方差分析受试者氟咯 = 137.301，P <0.001之间，n = 6）。在镇静测定中，显著差异（α= 0.001）被发现在50分钟，55和60（ 图3B）。除了 缺少在他们的眼睛筛分颜料时， 瓦特1118的突变体还具有降低的血清素，多巴胺和组胺25,26的水平。这些变化在生物胺的水平可能占在W 1118的突变体27,28的敏感性改变成乙醇。因此，控制白表达的测定基因型的水平可以是用于乙醇灵敏度的准确评估至关重要。
镇静昼夜调制。
在第三个例子，我们测量了广州 - S的百分比稳重苍蝇的时间，以确定是否有酒精对镇静昼夜效果（ 图4）一组量d后。我们比较了苍蝇的CT 5和17镇静剂在40分钟（30％的酒精蒸气）的百分比，结果显示在夜间较酒精暴露，有白天有显著减少镇静苍蝇（方差分析：F 1,20 = 6.21，P = 0.022，N = 10（CT5）及12（CT17））。苍蝇没有在一小时内达到50％的大关镇静的观察结果，以便作出直接比较可能我们的标准翻正反射消失的条件下进行。超越时间的观察是有问题的原因是快速耐受22-24堆积。在该实验中，苍蝇在任一昼夜时间点小于25％的镇静剂，在40分钟，这表明有这些基团之间的前缘镇静灵敏度的差。在这一点早在镇静收集数据是一个有用的indicat离子是存在差异，但是，以确定在镇静响应的分布的形状处理的效果的能力是有限的。以确定是否有一个在整个镇静分布差异，有较高的乙醇浓度应被用来确保更快的速度镇静。
图1。测量酒精的敏感性和镇静在果蝇的平衡杆。
。图2显示白天显著昼夜调制在酒精的敏感性代表性的例子 （方差分析：F 5,45 = 7.39，P <0.001，N = 6-10每个时间点; CT5与CT1，CT13，CT17，CT21及九号货柜码头，并与CT13，CT17，CT21和）之间的显著差异。
在行为反应的酒精图3。效果是野生型广-S苍蝇和丧失功能的白色1118突变果蝇A）广州-S苍蝇表明酒精显著提高灵敏度由LORR测量相比， 之间的显著不同苍蝇具有相同遗传背景携带白色突变（ANOVA科目F之间1,10 = 57.12，P <0.001，n = 6），B）广州-S苍蝇更容易受到酒精的镇静比瓦特1118突变体（ANOVA主体之间氟咯= 137.301，P <0.001，n = 6）。 *P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。
图4比较广，S的比例代表数据苍蝇在镇静剂5的CT和CT 17之间40分钟的野生型果蝇表现出显著更大的增加初始镇静的CT 17相比，CT 5（方差分析：F 1,20 = 6.21，P = 0.022，N = 10（CT5）及12（CT17））。
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Discussion
酒精滥用和酒精中毒的社会成本是巨大的，无论是在人类29和经济成本方面30,31。 果蝇为模型提供了一个快速和灵活的系统可快速检查了大量个人的行为反应，因此已被广泛地用于这两种醇5,7,32-34和昼夜节律研究35-37。
在这里，我们描述了一个简单的协议，用于酒精蒸汽成蝇昼夜条件下的控制管理。
苍蝇在标准条件下培养暴露于酒精蒸气1小时期间，苍蝇已失去翻正反射的次数进行评分，每5分钟。这里所描述的协议是用于昼夜实验，因为对夹带和住房在恒定条件下的附加要求进行了优化。各个步骤可以simplifi通过去除这些步骤，这对于昼夜实验，如存储在黑暗中至少一天或做昏暗的红光条件下的实验必不可少版仿制研究。这个协议也可以用于大量苍蝇以受控方式的处于不同的酒精浓度为后续的生化或分子分析。为了与其他果蝇行为学实验，如学习和记忆的观察，在红色的昏暗光线条件下的行为反应测量的一致性，即使对于非生理实验可能不理想。
实验独立重复之间的差异可以掩盖突变体或转基因株系之间或昼夜时间点之间的微小差异。因此，建议以多株或昼夜时间点同时测试样品（查看我们的例子），使'复制品'可以添加一个随机变量，以消除副本之间的变化的影响。
对酒的菌株之间变化。酒精百分比（气流通过醇鼓泡的百分比）需要进行相应的调整。正如图3，苍蝇携带的白色突变是不太容易受到酒精暴露的影响比野生型广-S苍蝇。用于承载白突变系的分析，它可能是可取的，以增加乙醇中，向其中蝇露出的百分比，以便于其它实验相同的时间帧来执行行为分析更长暴露于酒精可导致快速耐受发展。对于极度敏感的突变体和用于实验，其中有必要减少醇的使用比例，如观察到的果蝇中含有黄色基因的突变，该气流可能需要增加准确校准醇饱和的气流。小的增加或减速reases（±10％）的总气流（气流可行的范围从900-1,100毫升/分钟4观察瓶）似乎并没有苍蝇产生负面影响。
因为快速耐受建设苍蝇22-24从而影响酒精敏感度的潜力超过1小时的观察，应尽量避免。相反，确定酒精含量为每一株，结果在大约50％翻正反射消失30-40分钟。如果需要多个独立的菌株进行比较，选择酒精是适用于所有品种单一百分比。
该协议在很大程度上取决于行为观察，所以严格遵守标准化的协议是必不可少的，以避免在行为观察随着时间的漂移。如果可能的话，行为观察应该执行使得观察者忽视被测试的基因型或时间点。为了检测基于这些和其他未知因素的潜在偏差，最好是检查在一个时间过程中的数据，并验证观察整个实验系列保持相同的范围内。
该平衡翼的建立提供了一定的优势酒精摄入等方法对苍蝇，特别是本科生的研究人员或乙醇的负面影响生理研究。备用设备以测量苍蝇酒精对电机控制的效果是inebriometer，其中乙醇蒸汽通过上升的折流板和姿势控制或苍蝇的灵敏度的损失分发的垂直柱可通过确定所花费的时间进行测量下降到塔38,39的底部。该inebriometer提供缺失型姿势的控制的自动读出并已被证明为醇的研究在果蝇 9,22,39,40有价值的，但这个行为范式需要相对昂贵的设备，用于该设备的空间和时间来校准并优化条件。因此，inebriometer可能不适合许多本科教学实验室预算有限或空间，或为研究人员进行昼夜检测。提供醇苍蝇和测量镇静的另一种方法包括将少量液体酒精对吸湿材料，不论是在顶部或在一个小瓶的底部，然后使该醇以蒸发随时间41,42。作为与时间的酒精蒸气的浓度增加时，行为反应进行评估。而这个发送方法很容易建立，醇蒸气中，向其中苍蝇暴露量随着时间和条件而变化。用于实验的问题，其中差额在灵敏度或镇静的初始速率，例如昼夜调制评估，这是可取的酒精蒸气输送到的苍蝇的恒定水平。此外，大量的苍蝇暴露于酒精exposur恒定量E，作为与平衡杆进行的，是理想的下游细胞或生物化学测定的精确性能。提供酒精的苍蝇常见于早期的果蝇酒精研究的另一种方法涉及的酒精混入食物，因为它准备。虽然这种方法是简单和需要很少的设置，它是最适合用于慢性酒精暴露过天，作为随时间变化的酒精浓度。
更先进的，自动化的方法也可用于评估苍蝇的自发反应，酒精接触，包括视频活动记录和图像分析软件7,43。这些都是评估的乙醇阳性，超活化作用特别强大。然而，这些自动化的方法可能是本科生科研项目或教学实验室昂贵，不得优化设计，根据昼夜条件大量苍蝇分析行动（ 例如 ，黑暗条件下的视频捕捉，需要平衡和弥漫红外照明和红外感光摄像头等）。我们认为，平衡杆提供了一种易于设置，具有成本效益的方法，醇递送系统和行为反应的醇是非常适合于各种条件和实验设计的评估。
协议改进：
上述协议旨在探讨酒精暴露对的扶正反射损耗 - 在昼夜方面的影响。然而，该协议可以很容易地修改，以适应其他类型的酒精实验。
检查下12小时，12小时明暗对酒精的反应（LD; Zeitgeber时间）条件 ：保持苍蝇下12小时：12小时LD循环，直到实验。在轻相（ZT 1,5进行实验前转移苍蝇黑暗约1小时和9的一天）。这将确保光的急性效果不混杂的结果。
检查在恒定光照条件下对酒精的反应 ：培养苍蝇在恒定光照条件下的结果在他们的生物钟18-21和心律失常回应酒精暴露1的中断。苍蝇可以被转移到黑暗中约1小时，在实验前，使苍蝇都相同的条件蝇维持在LD或DD条件下进行测试。
镇静 ：被注射镇静剂苍蝇可以从翻正反射消失分开苍蝇，因为苍蝇保持不动的小瓶的底部，而翻正反射消失苍蝇仍会将自己的翅膀，头部和腿部。苍蝇的展览LORR仍与细微动作作出反应时，小瓶受到干扰。苍蝇的镇静是由计数站稳后的剩余苍蝇一动不动的数量来确定TAp到小瓶。此外，将小瓶中的滚动可以用来确定个人的苍蝇是否仍保留其敛反射。
恢复：该行为测定可以通过测定回收的醇反应的附加 参数进行扩展。停止酒精暴露，并继续作出有关的翻正反射消失，每隔5分钟观察结果。继续加湿空气通过小瓶在恢复期间的流动。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
资助这项研究是由一个程序从佛罗里达州立大学医学院和生物科学系于前苏联的支持提供了神经科学奖。额外的经费是由格兰特在急救从酒精饮料制造商的研究基金提供的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y-connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature air regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature air regulator mounting bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini flashlights with red filters | Mag-light |
References
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