Summary
Drosophila har vist sig som en markant model system til at dissekere de cellulære og molekylære fundament for adfærdsmæssige reaktioner på alkohol. Her præsenterer vi en protokol for indsamling af alkohol følsomhed data i en døgnrytmen sammenhæng, der nemt kan anvendes på andre eksperimenter og er velegnet til bachelor forskning.
Abstract
Bananfluer (Drosophila melanogaster) er en etableret model for både alkohol forskning og døgnrytmen biologi. For nylig viste vi, at døgnrytmen ur modulerer alkohol følsomhed, men ikke dannelsen af tolerance. Her beskriver vi vores protokol i detaljer. Alkohol administreres til fluer ved hjælp af Flybar. I denne opsætning er mættet alkohol damp blandet med befugtet luft i sæt proportioner, og administreres til fluer i fire rør samtidigt. Fluer opdrættes under standardiserede betingelser for at minimere variation mellem replikater. Tre dage gamle fluer af forskellige genotyper eller behandlinger anvendes til forsøgene, fortrinsvis ved at matche fluer to forskellige tidspunkter (f.eks CT 5 og CT 17), hvilket gør direkte sammenligninger. Under eksperimentet er fluer eksponeret i 1 time til den forudbestemte procentdel af alkohol damp og antallet af fluer, der udviser tab af vridningsrefleks (Lorr) eller sedation tælles hver 5 min. De data kan analyseres ved hjælp af tre forskellige statistiske metoder. Den første er at bestemme det tidspunkt, hvor 50% af fluerne har mistet deres opretningsrefleksen og bruge en analyse af varians (ANOVA) for at afgøre, om der er væsentlige forskelle mellem tidspunkter. Den anden er at bestemme den procentvise fluer, der viser Lorr efter et bestemt antal minutter, efterfulgt af en ANOVA-analyse. Den sidste metode er at analysere hele tidsserier hjælp multivariat statistik. Protokollen kan også bruges til ikke-døgnrytmen eksperimenter eller sammenligninger mellem genotyper.
Introduction
Drosophila melanogaster demonstrere dobbeltfasede adfærdsmæssige reaktioner på alkohol 1, som er analoge til de menneskelige reaktioner på dette stof 2,3. Ved første eksponering for lave koncentrationer af alkohol, fluer udviser forøget bevægelsesaktivitet, erstattet af en manglende koordinering motor, tab af postural kontrol og oprettende reflekser (tab af stabilitetsrefleks: Lorr) og sedation (komplet mangel på motorisk aktivitet i svar til mekanisk stimulering) udsættelse for alkohol skrider 4-9. Den endogene døgnrytmen ur er en stærk modulator af alkohol følsomhed og toksicitet som observeret i mus 10,11, rotter 12, og mennesker 13.. Nylige fremskridt i Drosophila forskning har vist, at døgnrytmen ur modulerer akut alkohol følsomhed, men ikke alkohol tolerance 1. De kraftige genetiske metoder til rådighed i Drosophila gennem mutant undersøgelser og transgene manipulationer af rumligeog tidsmæssig genekspression giver et system, der tillader hurtige fremskridt med at identificere de underliggende cellulære og molekylære mekanismer for kompleks adfærd. Brugen af Drosophila som en undersøgende værktøj er tilladt materielle fremskridt i forståelsen af alkohol neurobiologi, som hurtigt kan oversættes til pattedyr 14-16. For at lette forståelsen af de molekylære mekanismer gennem hvilke døgnrytmen ur modulerer alkohol følsomhed og til ensartet at måle adfærdsmæssige reaktioner på tværs af døgnrytmen tidspunkter, en alkohol administration protokol er egnet til anvendelse i svagt rødt lys er påkrævet. For Drosophila kan alkohol administreres gennem fødevarer tilskud til kronisk eksponering eller pålideligt gennem administration af alkohol i form af damp ved akutte eksponeringer. Her beskriver vi en alkohol administration protokol egnet til vurdering af døgnrytmen modulation af tab af vridningsrefleksen (Lorr) 1 samtsedation.
Fluer medføres med 12 timer: 12 timer LD cyklusser ved konstant temperatur og derefter overført til en kontrolleret enkel ordning for 2-5 dage afhængig af den eksperimentelle spørgsmål. Fluer udsættes for ethanoldamp i en indretning kendt som Flybar. I denne anordning er kontrollerede mængder af luft bobles gennem vand og alkohol; dampene blandes derefter og ledes ind i et hætteglas indkapsling fluer. Hver 5 min fluerne er scoret for det antal, der undlader at vise oprettende reflekser eller er blevet bedøvet. Lorr procentsatser for hvert tidspunkt beregnes og sammenlignes blandt døgnrytmen tidspunkter eller mellem stammer af fluer. Enkeltheden og pålideligheden af alkohol levering vha. Flybar alkohol levering kombineret med adfærdsmæssige muligheder analyse giver en betydelig fordel for døgnrytmen eksperimenter udført under mørke forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Montering af Flybar
Grundlag og overblik: Systemet er designet til at administrere kontrollerede procentdele af alkohol damp til fluer. Bemærk: Figur 1 giver en skematisk oversigt over Flybar set-up som beskrevet nedenfor i tre faser (samling af luftstrømmen, set-up af alkohol og vandflasker, og montering af observation hætteglas). Kort sagt er en konstant luftstrøm delt i to fraktioner, der er bobles gennem alkohol og vand, henholdsvis blandet, og administreres til 4 observation hætteglas.
- Montering af Airflow
- Tilslut et kort stykke fleksibelt silikone slange til enten bygning luft eller et akvarium belufter til at generere en konsekvent luftstrøm og split ved hjælp af et y-stik. Forbind den første gren af luftstrømmen regulator, der styrer den totale mængde af luft gennem systemet (typisk 1.000 ml / min til 4 observation hætteglas).
- Indsæt en lynkobling i det andet rørsåledes at luftstrømmen kan afbrydes ved begyndelsen af forsøget uden at påvirke den kalibrerede luftstrøm. Tilføj et y-stik og forbinde hver forgrening rør til luftstrømmen regulator.
- Tilslut slangen til luftstrømmen regulatorer og derefter tilslutte to luftstrøm meter.
- Opsætning af alkohol og vand Flasker
- Tilføj fleksibel slange til exit af luftmængden meter og indsætte en tynd glasrør (sektioner af 1 ml glaspipetter) med en 90 ° bøjning ind i enden af hver længde af slangen. Dette vil tjene som luftindløbsstrømmen i vandet og spiritusflasker.
- Placer gummiprop med 2 huller gennem dem i flasker med alkohol og vand. Hold begge flasker ved en konstant temperatur 2 ° C højere end den omgivende lufts temperatur ved hjælp af et vandbad. I vores eksperimenter, den miljømæssige rum, der fastholdes ved 25 ° C, mens vandbad ved 27 ° C.
- Sæt lige glaspipette for enir indløb gennem gummiproppen og strækker sig ind i væsken indtil omkring 1 cm fra bunden af flasken.
- Indsæt et albueafsnit af glas pipette i den resterende hullet i gummiproppen indtil udgangen af glasset flugter med bunden af proppen inde i flasken. Indsæt dette luftudtag i en anden længde af slangen.
- Genforene luftstrømmene ved hjælp af et y-stik og bruge en anden længde af silikoneslanger at lede luftstrømmen gennem en tom blanding kolbe eller flaske med bøjede glaspipette sektioner indsat gennem et to-gennemhullet gummiprop. Brug en anden længde af silikone slange til stikkontakten blandet luftstrøm.
- Forsamling Observation Vial
- Split udløbet luftstrømmen opstå fra blandekammeret kolbe 2-3x til opnåelse af 4 eller 8 mindre strømme af luft, således at flere observation hætteglas kan anvendes i hvert forsøg. Tilslut den fleksible silikone slange til observation hætteglas.
- Opsæt observatipå hætteglas bruger tomme hætteglas forseglet med en gummiprop med to huller, hvorigennem glasrør giver en indgang og en udgang for alkohol damp.
- Dæk udgangen af den første glas med netting og holde netting på plads ved hjælp af et lille stykke af fleksibel plastslange. Indsæt dette rør gennem det første hul, indtil det strækker sig til omtrent halvdelen af længden af hætteglasset. Hvis det er nødvendigt, bruge Teflon tape til at få en lun pasform.
- Sæt det andet glasrør også med enden omfattet af netting, indtil den flugter med den indvendige kant af gummiproppen.
- Placer hætteglassene vandret på et hvidt stykke papir for at maksimere kontrasten med fluerne under dunkle rød lysforhold.
- Mix passende fraktioner af luftstrømmen boblet gennem alkohol og luftstrømmen boblet gennem vand. Overvåg lufttrykket løbende og foretage justeringer efter behov for at opretholde den ønskede blanding af luftstrømmene.
Bemærk: Den kontinuerlig driftaf flere Fly Bar analyser parallelt eller endda en enkelt analyse i et lille rum kan føre til en mærkbar ophobning af alkohol dampe. For at undgå tiden frigivelsen af alkohol damp, der potentielt kan påvirke forskeren i et lukket rum, brug for et passende system til at blive sat på plads, der i tilstrækkelig grad fjerner alkohol damp genereres under eksperimentet. For at fjerne alkoholdampe, tilslutte en 6-12 tommer stykke slange på den anden glasrør stikker ud fra hvert hætteglas, bundte dem og direkte til en tragt-vakuum system. Forskerne bør også sikre, at den eksperimentelle test rummet er tilstrækkeligt ventileret.
2.. Udarbejdelse af forsøgsdyr
Grundlag og overblik: Korrekt kultur og boliger af fluerne vil reducere variabiliteten i de data. Dette opnås gennem standardisering og minimering af stress opleves af fluerne. Af denne grund er bedøvelse (CO 2 eller alternativer) anvendes during nogen af de følgende trin i protokollen. Endvidere bør fluer være aldersmatchende tværs eksperimenter og tidspunkter for at minimere variabilitet, som er standard for andre adfærdsmæssige analyser, herunder indlæring og hukommelse eksperimenter 17.
Andet lys: mørke, kan anvendes til at undersøge funktionen af døgnrytmen ur i adfærdsmæssig reaktion til ethanol. At afgøre, om en døgnrytme eksisterer, kan forsøg udføres under en defineret LD cyklus til at måle præstationer på specifikke zeitgeber Times (ZT). ZT 0 repræsenterer daggry og er defineret som det tidspunkt, hvor lys på under LD cyklusser, mens ZT 12 er det tid lysene er slukket med en 00:12 timers LD cyklus. Under konstante betingelser, døgnrytmen tid (CT) måler tid for dyret i mangel af miljømæssige signaler, dvs fritløbende tid, og er relateret til den tidligere LD medrivning cyklus. I vildtype-Drosophila, CT afspejler den tidligere ZT for første flere dags i faste betingelser som den fritløbende døgnrytmen periode og rytmer er ~ 24 timer. For at måle døgnrytmen graduering og fjerne akutte lyseffekter på adfærd, der er fluer indblandet til lys: mørke cyklus og derefter overført til konstante mørke omgivelser (DD) før eksperimenter. Døgnrytmen eksperimenter udføres på andendagen af DD til at måle præstationer på specifikke Circadian Times (CT).
I Drosophila, konstant lys (LL) forhold resulterer i døgnrytmen dysfunktion med afdæmpede eller afskaffet molekylære svingninger i kerne døgnrytmen gener og forstyrrelse af adfærdsmæssige døgnrytmen som det fremgår af arytmiske motorisk aktivitet 18-21 og arytmiske korttidshukommelse 17. Protokollen er optimeret til døgnrytmen undersøgelser og kan forenkles til andre forsøg. Alle døgnrytmen eksperimenter udføres med dæmpet rødt lys (ambient ovenover rødt lys <1 lux på bænken top, små røde lys bruges ved 12 inches fra rør~ 1 lux lys).
- Rear fluerne ved 25 ° C under 12:12 timers lys: mørke medrivning forhold (LD).
- Saml frisk eclosed fluer ved slutningen af den periode, dag-lys på dag 1 og gemme dem i 24 timer under LD betingelser holde hætteglas, der indeholder en lille mængde af høj agarkoncentration mad for at minimere mad klæbrighed. Bemærk: For at sikre sunde, normalt udviklede fluer indsamles, kun bruge fluer indsamlet inden for de første dage efter eclosion starter i en kultur flaske.
- Saml partier af cirka 30 (25-35) fluer ved hjælp af en aspirator på dag 2 i slutningen af det lys periode og overførsel til friske holding hætteglas.
- Brug en stærk lyskilde til at lede fluer til den fjerneste ende af hætteglasset. Inden for dette område, det nøjagtige antal fluer i hvert hætteglas er ikke kritisk adfærdsmæssige observationer er angivet i procenter med antallet af fluer talt ved afslutningen af hvert forsøg.
- Vedligehold fluer under DD forhold ved 25 ° C for to dage.
- På dagen for eksperimentet, placere alle fluer opstaldet i forskellige forhold eller andre end den eksperimentelle adfærd rum i rummet i mindst 1 time inden forsøget væksthuse. Akklimatisering reducerer variabilitet på grund af ændringer i temperatur eller fugtighed.
- Foretag observationer på seks tidspunkter om dagen (CT 1, 5, 9, 13, 17 og 21) med henblik på at teste for døgnrytmen graduering af adfærd.
- Sammenlign forskellige tidspunkter inden for et enkelt sæt adfærdsmæssige eksperimenter for at øge robustheden af det eksperimentelle design og minimere variabilitet specifikt for et enkelt eksperiment. For eksempel kan observationer af CT 1 og CT 13 opnås samtidig, hvis to inkubatorer med modstående lys-mørke skemaer anvendes til påvirkelighed.
Bemærk: Ovenstående procedure beskriver fremstillingen af forsøgsdyr for analyser udført i døgnrytmen tilstand konstant mørke. Andet lys: mørke, kan anvendes til at undersøge funktionen af ureti adfærdsmæssige reaktioner til alkohol. At afgøre, om en døgnrytme eksisterer forsøgene kan udføres under en LD cyklus til at måle præstationer på specifikke zeitgeber Times (ZT). Derudover kan den protokol anvendes med fluer rejst under konstante lysforhold til eksperimenter test døgnrytmen dysfunktion. For alternative protokoller der tester fluer opstaldet i lysforhold, bør adfærdsmæssige analyser stadig udføres under mørke forhold. Fluer skal overføres i mørke i 1 time før forsøget for at minimere adfærdsmæssige variabilitet på grund af de akutte virkninger af lys på adfærd.
3.. Observationer af adfærd
Grundlag og overblik: Følgende alkohol administration protokol er optimeret til observationer under dæmpet rødt lys tilstand. De to adfærdsmæssige foranstaltninger Lorr og sedation repræsenterer to forskellige punkter i flue beruselse. Lorr repræsenterer et sent tidspunkt af beruselse inkorporerer tab of motor og postural kontrol, mens sedation foranstaltninger en meget sen slutpunkt for forgiftning. Genotype eller døgnrytmen modulation kan påvirke disse to foranstaltninger forskelligt; derfor kan man ønske at undersøge begge. Kort sagt, fluer lagt i hætteglas, er antallet af fluer udviser Lorr eller sedation scorede hver 5 min under eksponering alkohol dampe, og det samlede antal af fluer optalt ved afslutningen af forsøget.
- Før du starter eksperimentet køre luft gennem systemet (luft bobles gennem vand-og spiritusflasker) i mindst 10 minutter, og bruge den tid til at kalibrere luftstrømmene.
- Afbryd quick release for at stoppe luftstrømmen. Load fluerne i hætteglasset, og tilslut luftstrømmen og starte timere. Bemærk: Hvis der ikke reagerer fluer eller døde fluer er tilbage i beholdningen hætteglas, kan dette være tegn på stress. Generelt kan disse betingelser afhjælpes ved boliger færre fluer i bedriften hætteglas eller faldende mad klæbrighed ved hjælp af en svagly højere koncentration agar under tilberedning af fødevarer. For at opnå optimale adfærdsmæssige analyser og minimal variation mellem eksperimenter bør fluer være sunde forud for eksperimenter.
- For nøjagtig tid at holde, bruge en timer til at holde styr på den samlede tid for alkohol eksponering og bruge en anden count-back timer for at markere 5-minutters intervaller.
- Læg et stykke hvidt papir under de hætteglas for at øge kontrasten og flyve synlighed, især under dårlige rød lysforhold.
- Kontrollér luftmængden regelmæssigt under et eksperiment for at opretholde konstante niveauer. Generelt, når luftstrømmene har stabiliseret sig, de forbliver stabile i længden af eksperimentet.
- Tæl antallet af fluer, der har mistet deres opretningsrefleksen gang hver 5 min for en 1 hr periode. Som alkohol følsomhed varierer mellem genotyper og genetiske baggrunde, kan det være ønskeligt at udføre mere hyppige vurderinger eller til at foretage forsøget i en længere periode.
- Løft hætteglasset slightly fra overfladen, og retter lyset fra en rød lys lommelygte mod papiret bag hætteglasset. Hold håndholdte røde lommelygter i en afstand af mindst 12 inches til den eksperimentelle hætteglasset for at opretholde lysniveauer ikke større end 1 lux for alle eksperimenter under dunkle rød lysforhold.
- Måle lysniveauet ved hjælp af en lysmåler til at etablere standarder for alle eksperimenter.
- Bestem antallet af fluer, der har mistet deres oprettende refleks ved at anvende en fast tap til hætteglasset og tælle, hvor mange fluer undlader at rette sig inden for ca 4 sek. Fluer der viser Lorr stadig kan flytte deres ben og vinger, men kan ikke vende sig selv oprejst.
- Ved slutningen af sessionen, tælle det samlede antal fluer i hvert hætteglas.
Bemærk: Indimellem kan en enkelt flue blive fanget mellem proppen og den side ved lastning flyver ind i de eksperimentelle hætteglas. Da dette sker i mørke, kan det ikke umiddelbart bemærket, så det er nødvendigt at tælle den samlede følelsesløsis af fluer ved slutningen af forsøget korrekt beregne procenter.
Desuden er denne fremgangsmåde også kan anvendes til at måle sedering af fluer, som repræsenterer en anden adfærdsmæssige slutpunkt. Mens sederet fluer har mistet deres ret refleks, sedation kræver større alkohol eksponering. Adfærdsmæssigt kan sedation være præget af den fuldstændige mangel på tilsyneladende motorisk aktivitet med fluer resterende ubevægelig i hætteglasset efter aa firma hanen til hætteglasset. For sedation, tælle antallet af fluer, der forbliver ubevægelig uden ben vinke efter leveringen af en fast tap af hætteglasset. Derudover kan hætteglasset rulles side til side for at afgøre, hvorvidt de enkelte fluer stadig bevare deres opsigtsvækkende refleks.
4.. Dataanalyse
- Bestem procentdelen Lorr på hver gang vurderet baseret på det totale antal fluer i hvert hætteglas.
- Estimere forskelle mellem døgnrytmen tidspunkter eller stammer fra udregningerng 50% Lorr for hver prøve, der falder inden for den lineære del af sigmoid kurve (se figur 2 nedenfor).
- Alternative statistik:
- Hvis der er planlagt sammenligninger mellem genotyper, er det ønskeligt at analysere hele tidsforløbet hjælp gentagne målinger ANOVAand at bestemme området for tidspunkter at forskellene er betydelige med post-hoc test (figur 3). For disse tests, vi foretrækker at bruge en en værdi på 0,001. Dette giver forskelle på de enkelte eksponeringstider skal vurderes, samt forskelle mellem genotyper i kurvens hældning.
- Forskelle i følsomhed til kan bestemmes for bestemte tidspunkter af alkohol eksponering for en bestemt respons, såsom sedation fra den lineære del af grafen (figur 4).
- Forskelle mellem stammer eller døgnrytmen tidspunkter kan estimeres ved hjælp af standard F-statistik og post-hoc-tests.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Døgnrytmen Modulation af alkohol følsomhed ved hjælp af 50% Lorr som markør.
Et repræsentativt eksempel, der viser døgnrytmen graduering i alkohol følsomhed i løbet af dagen er beskrevet i figur 2.. Lorr blev målt til seks tidspunkter i løbet af 2. dag i DD i Canton-S og 50% Lorr blev bestemt for hvert tidspunkt. Analyse viste en signifikant effekt af tidspunktet på dagen (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 per tidspunkt). Fisher LSD test viste signifikante forskelle mellem CT1 vs CT5, CT5 vs CT13, CT5 vs CT17, CT5 vs CT 21, CT9 vs CT13, CT9 vs CT17, og CT9 vs CT 21. Dette resultat er i overensstemmelse med vores tidligere offentliggjorte resultater 1.
Forskelle mellem Vild-type og Mutant fluer.
Det andet eksempel bruger tidsserier for at vise forskelle i Lorr og smertestillende midler mellem vildtype Canton-S fluer og Flies bærer et tab af funktion hvid mutation (w 1118) i den samme genetiske baggrund (Figur 3). W 1118 mutationen er af særlig interesse for Drosophila forskere transgene linier ofte er skabt ved hjælp af disse fluer og mange mutant linjer for døgnrytmen ur gener har også w 1118 mutationen. Resultaterne er præsenteret som en tidsserie (figur 3) med data vist for hver 5 min i hele eksponeringsperioden. Observationer er begrænset til 60 minutter for at undgå virkningerne af hurtig tolerance oprustning 22-24. W 1118 mutanter viser signifikant reduceret Lorr følsomhed reaktion på ethanoldamp, end Canton-S (ANOVA mellem emner F 1,10 = 57,12, p <0,001, N = 6). Blev fundet Betydning forskelle (a = 0,001) i dette eksperiment fra min 20 gennem min 60 (figur 3A w 1118 og Canton-S blev også fundet i antallet af sedation (ANOVA mellem fag F 1,10 = 137,301, p <0,001, n = 6). I sedation assay, blev fundet signifikante forskelle (a = 0,001) i minutter 50, 55 og 60 (figur 3B). Ud over manglen på screening pigmenter i deres øjne, også w 1118 mutanter har reduceret niveau af serotonin, dopamin og histamin 25,26. Disse ændringer i biogene amin niveauer kan forklare den ændret følsomhed over for ethanol i den w 1118 mutanter 27,28. Derfor kan styre niveauet af hvide ekspression i de analyserede genotyper være afgørende for nøjagtig vurdering af ethanol følsomhed.
Døgnrytmen Modulation af sedation.
I det tredje eksempel målte vi den procentdel af Canton-S flyver adstadigd efter et fast beløb af tid til at afgøre, om der er en døgnrytmen effekten af alkohol på sedation (Figur 4). Vi sammenlignede den procentdel af fluer bedøvet ved 40 min (30% alkohol damp) ved CT 5 og 17, og resultaterne viser, at der er signifikant færre bedøvede fluer i løbet af dagen i forhold til alkohol eksponering i løbet af natten (ANOVA: F 1,20 = 6.21, p = 0,022, n = 10 (CT5) & 12 (CT17)). Fluerne nåede ikke 50% sedation mærket inden for en time, da de observationer blev gjort under vores standard Lorr betingelser for at foretage en direkte sammenligning mulig. Observationer uden for timen er problematiske på grund af ophobning af hurtig tolerance 22-24. I dette eksperiment var mindre end 25% af fluerne i begge døgnrytmen tidspunkt bedøvet ved 40 min, hvilket indikerer, at der er en forskel i forkant sedation følsomhed mellem disse grupper. Indsamling af data på dette tidlige tidspunkt i sedation er et nyttigt indication der er forskelle, men evnen til at bestemme virkningen af behandling på formen af fordelingen i sedation reaktioner er begrænset. At afgøre, om der er forskel i hele sedation distribution, bør en højere ethanolkoncentration anvendes til at sikre en hurtigere hastighed på sedation.
Figur 1.. Den Flybar til at måle alkohol følsomhed og sedation i bananfluer.
.. Figur 2. Et repræsentativt eksempel viser signifikant døgnrytme graduering i alkohol følsomhed i løbet af dagen (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 pr tidspunkt; signifikante forskelle mellem CT5 vs CT1, CT13, CT17, CT21 & og CT9 vs CT13, CT17, CT21 &).
Figur 3.. Virkninger af alkohol på adfærdsmæssige reaktioner er signifikant forskellig mellem vildtype Canton-S fluer og tabet af funktion hvide 1118 mutant fluer. A) Canton-S fluer viser signifikant øget følsomhed over for alkohol som målt ved Lorr forhold til flyver med samme genetiske baggrund bærer hvide mutation (ANOVA mellem emner F 1,10 = 57,12, p <0,001, N = 6). B) Canton-S fluer er mere modtagelige for alkohol sedation end W 1118 mutanter (ANOVA mellem fag F 1,10 = 137,301, p <0,001, N = 6). *p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
. Figur 4. Repræsentative data, der sammenligner andelen af Canton-S fluer bedøvet på 40 min mellem CT 5 og CT 17 Wild-type fluer viser signifikant større stigning i indledende sedation hos CT 17 sammenlignet med CT 5 (ANOVA:. F 1,20 = 6.21, p = 0,022, n = 10 (CT5) & 12 (CT17)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omkostningerne ved alkoholmisbrug og alkoholisme for samfundet er enorme, både i form af menneskelige 29 og økonomiske omkostninger 30,31. Drosophila som model tilbyder en hurtig og alsidigt system til hurtigt at undersøge de adfærdsmæssige reaktioner i et stort antal personer, og som sådan har været flittigt brugt til både alkohol 5,7,32-34 og døgnrytmen forskning 35-37.
Her beskrev vi en enkel protokol til kontrolleret administration af alkohol damp til voksne fluer under døgnrytmen forhold.
Fluer dyrket under standardiserede betingelser udsættes for alkohol damp i 1 time, hvor antallet af fluer, der har mistet deres opretningsrefleksen scores hver 5 min. Den heri beskrevne protokol er optimeret til døgnrytmen eksperimenter på grund af de yderligere krav til medrivning og boliger under konstante betingelser. Forskellige skridt kan være forenklinged for generiske undersøgelser ved at fjerne de trin, som er af afgørende betydning for døgnrytmen eksperimenter såsom opbevaring i mørke i mindst én dag eller laver forsøgene under dunkle rød lysforhold. Denne protokol kan også anvendes til at blotlægge stort antal fluer på en kontrolleret måde i varierende koncentrationer af alkohol for efterfølgende biokemiske eller molekylære analyser. For sammenhæng med andre Drosophila adfærdsmæssige eksperimenter såsom indlæring og hukommelse observationer, måling af adfærdsmæssige reaktioner i dim rødt lys, kan være ønsket, selv for ikke-døgnrytmen eksperimenter.
Variation mellem uafhængige gentagelser af eksperimentet kan skjule små forskelle mellem mutanter eller transgene stammer eller mellem døgnrytmen tidspunkter. Det anbefales derfor at teste prøver af flere stammer eller døgnrytmen tidspunkter samtidigt (se vores eksempel), så 'kopi' kan tilføjes som en stokastisk variabel med henblik på at eliminerevirkningen af variationen mellem reproduktioner.
Følsomhed over for alkohol varierer mellem stammer. Alkohol procenter (procentdelen af luftmængde boblende gennem alkohol) skal justeres i overensstemmelse hermed. Som det ses i figur 3, fluer bærer hvide mutation er mindre modtagelige for virkningerne af alkohol eksponering end vildtype Canton-S fluer. Til analyse af linjer bærer hvide mutation, kan det være ønskeligt at forøge andelen af alkohol, som fluerne udsat for således at udføre den adfærdsmæssige assay for samme tidsramme andre eksperimenter længere tids udsættelse for alkohol kan resultere i hurtig tolerance udvikling. Til ekstremt følsomme mutanter og for forsøg, hvor det er nødvendigt at sænke den procentdel af alkohol, der anvendes, som observeret for fluer, der indeholder en mutation i det gule gen, kan luftmængden skal øges for at kalibrere alkohol mættet luftstrømmen præcist. Små stigninger eller decemberreases (± 10%) i den samlede luftmængde (brugbar luftstrøm spænder fra 900-1.100 ml / min for 4 observation hætteglas) synes ikke at have en negativ indflydelse fluerne.
Observationer over 1 time bør undgås, når det er muligt på grund af potentialet for hurtig tolerance oprustning i fluerne 22-24 som påvirker alkohol følsomhed. I stedet bestemme procentdelen alkohol for hver stamme, der resulterer i en omtrentlig 50% Lorr med 30-40 min. Hvis sammenligning af flere uafhængige stammer er påkrævet, vælge et enkelt procentdel af alkohol, der virker for alle stammer.
Denne protokol er stærkt afhængig adfærdsmæssige observationer, så streng overholdelse en standardiseret protokol er vigtigt at undgå afdrift i adfærdsmæssige observationer over tid. Hvis det er muligt, bør adfærdsmæssige observationer udføres således, at iagttageren er blind for genotype eller tidspunkt bliver testet. For at afsløre potentielle skævhed på grundlag af disse og ukendte andre faktorer,er det tilrådeligt at undersøge data på en tidsforløb og at kontrollere, at iagttagelser fortsat inden for samme område i hele den eksperimentelle serie.
Den Flybar set-up giver visse fordele i forhold til andre metoder til alkohol administration for fluer, især for bachelor forskere eller døgnrytmen undersøgelser om de negative virkninger af ethanol. En alternativ enhed til at måle effekten af alkohol på motorisk kontrol i fluer er inebriometer, kan måles ved at bestemme den tid det tager en lodret kolonne, hvor ethanol damp cirkuleres gennem stigende bafler og tab af postural kontrol eller følsomhed af fluen til at falde til bunden af kolonnen 38,39. Den inebriometer giver en automatiseret udlæsning af tab af postural kontrol og har vist sig værdifulde for alkohol forskning i Drosophila 9,22,39,40, men det adfærdsmæssige paradigme kræver relativt dyrt udstyr, plads til apparatet, og tid til at kalibrereog optimere betingelserne. Således kan inebriometer ikke være velegnet til mange bachelor undervisningslaboratorier med begrænsede budgetter eller rum, eller for forskere, der udfører døgnrytmen analyser. En anden metode til at levere alkohol til fluer og måling sedation indebærer at placere en lille mængde flydende alkohol på et absorberende materiale, enten på toppen eller i bunden af et hætteglas og derefter lade alkoholen fordampe med tiden 41,42. Når koncentrationen af alkohol damp øges med tiden, kan adfærdsmæssige reaktioner vurderes. Selv om denne leveringsmetode er nem at sætte op, mængden af alkohol damp som fluerne udsat varierer med tiden og betingelser. Ved eksperimentelle spørgsmål, hvor forskelle vurderes i de indledende satser for følsomhed eller sedation, såsom døgnrytmen modulation, er det ønskeligt at have et konstant niveau af alkohol damp leveret til fluerne. Derudover eksponering af et stort antal fluer til en konstant mængde alkohol exposure, som udføres med Flybar er ønskelig for en nøjagtig udførelse af nedstrøms cellulære eller biokemiske assays. En anden metode til at levere alkohol til fluer almindelige i begyndelsen af Drosophila alkohol forskning involveret blande alkohol ind i maden, da det blev udarbejdet. Selv om denne metode er let og kræver lidt opsætning, er det bedst egnede til kronisk alkohol eksponering over dage som den koncentration af ændringer alkohol med tiden.
Mere avancerede, automatiserede metoder er også tilgængelige for at vurdere bevægeapparatet svar af fluer til alkohol eksponering inklusive video aktivitet optagelse og billede analyse software 7,43. Disse er særligt stærke til at vurdere de positive, hyper-aktiverende virkninger af ethanol. Dog kan disse automatiserede metoder være uoverkommeligt dyre for bachelor forskningsprojekter eller undervisningslaboratorier og kan ikke optimalt designet til analyse af et stort antal af fluer under døgnrytmen betingelsertioner (fx videooptagelse under mørke forhold kræver afbalanceret og diffus infrarød belysning og infrarøde følsomme kameraer). Vi mener, at Flybar giver en nem at sætte op, omkostningseffektiv metode til alkohol delivery system og vurdering af adfærdsmæssige reaktioner på alkohol, som er velegnet til en række betingelser og laboratorie designs.
PROTOKOL ÆNDRINGER:
Den ovenfor beskrevne protokol tager sigte på at undersøge effekten af alkohol eksponering på tab af oprettende-Reflex i døgnrytmen sammenhæng. Dog kan protokollen nemt ændres til at rumme andre typer alkohol eksperimenter.
Undersøgelse af reaktion på alkohol under 12 timer-12 timer lys-mørke (LD, zeitgeber Time) betingelser: Oprethold fluer under 12 timer: 12 timer LD cyklus indtil eksperimentet. Overfør fluerne til den mørke ca 1 time før forsøget gennemført i lyset fase (ZT 1, 5Og 9) af dagen. Dette vil sikre, at den akutte virkning af lys ikke confounding resultaterne.
Undersøgelse af reaktion på alkohol under konstante lysforhold: Dyrkning af fluer under konstant lysforhold resulterer i afbrydelse af deres døgnrytmen ur 18-21 og arytmiske reaktioner på alkohol eksponering 1.. Fluer kan overføres til den mørke ca 1 time før forsøget, så fluerne er testet under de samme betingelser som fluer vedligeholdes i LD eller DD forhold.
Sedation: fluer, der er sederet kan adskilles fra Lorr flyver fordi fluer forbliver ubevægelig på bunden af hætteglasset, mens Lorr flyver stadig vil flytte deres vinger, hoved og ben. Fluer at udstille Lorr stadig reagere med subtile bevægelser, når hætteglasset er forstyrret. Sedation af fluer bestemmes ved at tælle antallet af fluer resterende ubevægelig efter en fast tap til hætteglasset. Derudover kan rulning af hætteglasset anvendes til at bestemme, om individuelle fluer stadig bevarer deres opsigtsvækkende refleks.
Recovery: Den adfærdsmæssige analyse kan udvides ved at måle nyttiggørelse som en ekstra parameter af alkohol respons. Afbryd alkohol eksponering og fortsætte med at gøre bemærkninger vedrørende Lorr hver 5 min. Fortsætte strømmen af befugtet luft gennem hætteglassene under fredninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Finansieringen af denne forskning blev leveret af et program i Neuroscience Award fra Florida State University College of Medicine og støtte fra Institut for Biologisk Fakultet på FSU. Yderligere finansiering blev leveret af en Grant-in-Aid fra Alcohol Beverage Producentens Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y-connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature air regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature air regulator mounting bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. Deaths: Final data for 2007. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention: National Center for Health Statistics. (2010).
- The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , Columbia University. (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , Available from: www.medtext.com/hdcn.htm (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. Pfaff, D. W., Kieffer, B. 1129, Blackwell Publishing. 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
