Summary
דרוזופילה התפתחה כמערכת מודל משמעותית עבור לנתח את הבסיס התאי ומולקולרית של תגובות התנהגותיות לאלכוהול. כאן אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף נתונים רגישות אלכוהול בהקשר היממה שיכולה להיות מיושם בקלות לניסויים אחרים, והוא מתאים היטב למחקר לתואר ראשון.
Abstract
זבובי פירות (דרוזופילה melanogaster) הם מודל שהוקם עבור שני מחקרי אלכוהול וביולוגיה היממה. לאחרונה, הראה כי השעון הביולוגי מווסת את רגישות לאלכוהול, אך לא היווצרות של סובלנות. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו בפירוט. אלכוהול ניתן לזבובים באמצעות FlyBar. בהגדרה זו, אדי אלכוהול רוויים הוא מעורבב עם אוויר humidified בפרופורציות קבועות, וניתן לזבובים בארבע שפופרות בו זמנית. זבובים שגודלו בתנאים אחידים כדי למזער וריאציה בין משכפל. זבובים ישנים שלושה ימים של גנוטיפים או טיפולים שונים המשמשים לניסויים, רצוי על ידי זבובים משתי נקודות זמן שונות (למשל, CT 5 ו-CT 17) מה שהופך את השוואה ישירה אפשרית תואם. במהלך הניסוי, זבובים נחשפים לשעה 1 לשיעור שנקבע מראש של אדי אלכוהול ומספר הזבובים שמפגין אובדן ליישר רפלקס (LoRR) או sedation נספרים כל 5 דקות. ניתן לנתח את הנתונים באמצעות שלוש גישות סטטיסטיות שונות. הראשון הוא לקבוע את המועד שבי 50% מהזבובים איבדו את רפלקס ליישרם ולהשתמש בניתוח השונה (ANOVA) כדי לקבוע אם הבדלים משמעותיים קיימים בין נקודות זמן. השני הוא לקבוע את אחוז הזבובים שמראים LoRR לאחר מספר מסוים של דקות, ואחרי ניתוח ANOVA. השיטה האחרונה היא לנתח את סדרת כולה פעמים באמצעות סטטיסטיקה רב משתני. גם הפרוטוקול יכול לשמש לניסויים או השוואות שאינן היממה בין גנוטיפים.
Introduction
תסיסנית להפגין תגובות התנהגותיות biphasic לאלכוהול 1 שהם מקבילים לתגובות אנושיות לתרופה זו 2,3. לאחר החשיפה ראשונית לריכוזים נמוכים של אלכוהול, זבובי פעילות של תנועה מוגברת תערוכה, הוחלף על ידי חוסר הקואורדינציה מוטורית, אובדן השליטה ביציבה ורפלקסים ליישר (אובדן ליישר רפלקס: LoRR), והרגעה (חוסר הפעילות מוטורית בתגובה מלאה לגירוי מכאני) כחשיפה לאלכוהול מתקדמת 4-9. השעון הביולוגי אנדוגני הוא מאפנן חזק של רגישות אלכוהול ורעילות כפי שנצפה בעכברים 10,11, חולדות 12, ובני האדם 13. ההתקדמות שחלה באחרונה במחקר דרוזופילה הראו שעון היממה מודולציה רגישות אלכוהול חריף אך לא אלכוהול סובלנות 1. גישות רבות עוצמה הגנטית הזמינות בדרוזופילה באמצעות מחקרי מוטציה ומניפולציות מהונדסים של המרחביתוביטוי גנים של זמן מספק מערכת המאפשרת התקדמות מהירה בזיהוי המנגנונים התאיים ומולקולריים שבבסיס להתנהגויות מורכבות. השימוש בדרוזופילה ככלי חקירה התירה התקדמות מהותית בהבנת נוירוביולוגיה אלכוהול שיכול להיות מתורגמת במהירות ליונקים 14-16. על מנת להקל על ההבנה של המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו השעון הביולוגי מודולציה רגישות אלכוהול ולמדוד באופן אחיד על פני תגובות התנהגותיות נקודות זמן היממה, פרוטוקול ממשל אלכוהול מתאים לשימוש בתנאי אור אדום עמומים נדרש. לדרוזופילה, אלכוהול יכול להינתן באמצעות תוספי מזון לחשיפה כרונית או באופן אמין דרך בניהול אלכוהול בצורה של אדים לחשיפות אקוטיות. כאן אנו מתארים פרוטוקול ממשל אלכוהול מתאים להערכה של אפנון היממה של רפלקס הפסד של ליישר (LoRR) 1, כמו גםתרופות הרגעה.
זבובים נגררו עם שעות 12: 12 מחזורי LD שעות בטמפרטורה קבועה ולאחר מכן הועברו למשטר אור נשלט על 2-5 ימים, תלוי בשאלה הניסיונית. זבובים נחשפים לאדי אתנול במכשיר המכונה FlyBar. במכשיר זה, כמויות מבוקרות של אוויר מבעבעים דרך מים ואלכוהול; לאחר מכן האדים מעורבבים וביימו לדיור בקבוקון הזבובים. כל 5 דקות זבובי כבש עבור המספר שאינו מצליח להציג ליישר רפלקסים או הפכו מסומם. אחוזי LoRR עבור כל נקודת זמן מחושבים והשוואה בין נקודות זמן היממה או בין הזנים של זבובים. הפשטות והאמינות של אספקת אלכוהול באמצעות משלוח אלכוהול FlyBar בשילוב עם אפשרויות ניתוח התנהגות מספקת יתרון משמעותי לניסויים ביולוגיים שנערכו בתנאים חשוכים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עצרת של FlyBar
רציונל וסקירה: המערכת מיועדת לניהול האחוזים מבוקרים של אדי אלכוהול לזבובים. הערה: איור 1 מספק סקירה סכמטי של FlyBar ההגדרה כפי שיתואר להלן בשלושה שלבים (הרכבה של זרימת האוויר, ההגדרה של האלכוהול ובקבוקי מים, והרכבה של בקבוקוני התצפית). בקיצור, זרימת אוויר יציבה מחולקת לשני שברים המבעבעים דרך אלכוהול ומים, בהתאמה, מעורב, ומנוהלים עד 4 בקבוקוני תצפית.
- הרכבה של זרימת האוויר
- חבר חתיכת צינורות סיליקון גמישים לאו אוויר בניין או aerator אקווריום כדי ליצור זרימת אוויר עקבית ופיצול באמצעות y-מחבר קצרה. חבר את הסניף הראשון לזרימת אוויר הרגולטור ששולט בסכום הכולל של אוויר דרך המערכת (בדרך כלל 1,000 מיליליטר / דקה במשך 4 בקבוקוני תצפית).
- הכנס מחבר מהיר בצינור השניכך שזרם האוויר יכול להיות מופרע בתחילת הניסוי מבלי להשפיע על זרימת האוויר המכויל. הוספת y-מחבר ולחבר כל צינור מסתעף לרגולטור זרימת האוויר.
- חיבור צינורות לרגולטורי זרימת האוויר ולאחר מכן לחבר את שני מטרים זרימת אוויר.
- ההגדרה של בקבוקי האלכוהול והמים
- להוסיף צינור גמיש ליציאה של מטר זרימת האוויר ולהכניס צינורית זכוכית דקה (סעיפים של טפטפות זכוכית 1 מיליליטר) עם 90 ° עיקול לסוף כל אורכו של צינור. זה ישמש כזרימת אוויר בכניסה לבקבוקי מים ואלכוהול.
- מקם פקקי גומי עם 2 חורים דרכם לבקבוקים מלאים באלכוהול ומים. שמור את שני הבקבוקים על C ° טמפרטורת 2 קבוע גבוה יותר מטמפרטורת אוויר סביבה באמצעות אמבט מים. בניסויים שלנו, החדר הסביבתי נשמר 25 מעלות צלזיוס, ואילו אמבט המים הוא ב27 ° C.
- הכנס את פיפטה הזכוכית ישרir בכניסה לפקק הגומי ולהאריך לתוך הנוזל עד כ 1 סנטימטר מהחלק התחתון של הבקבוק.
- הכנס סעיף מרפק של פיפטה זכוכית לתוך החור שנותר בפקק הגומי עד סוף הזכוכית הוא מיושר עם החלק התחתון של הפקק בתוך הבקבוק. הכנס לשקע האוויר הזה באורך נוסף של צינור.
- להתאחד זרמי האוויר באמצעות y-מחבר ולהשתמש באורך נוסף של צינורות סיליקון כדי לכוון את זרימת האוויר דרך בקבוק ריק ערבוב או בקבוק עם קטעי פיפטה הזכוכית מכופפים מוכנסים דרך פקק גומי שני מסתתר. השתמש באורך נוסף של צינורות סיליקון לזרם האוויר מעורב לשקע.
- עצרת של בקבוקון התצפית
- לפצל את זרם האוויר לשקע מתעורר מהבקבוק 2-3x הערבוב להשיג 4 או 8 זרמים קטנים יותר של אוויר, כך שבקבוקוני תצפית מרובים ניתן להשתמש בכל ניסוי. חבר את צינורות סיליקון גמישים לבקבוקוני התצפית.
- הגדר את observatiבבקבוקונים באמצעות בקבוקונים ריקים חתומים בפקק גומי המכיל שני חורים שדרכו צינורות זכוכית מספקים כניסה ויציאה לאדי האלכוהול.
- מכסה את קצה צינורית הזכוכית הראשונה עם רשת ולשמור על הרשת במקום באמצעות חתיכה קטנה של צינורות פלסטיק גמישים. הכנס הצינור הזה דרך החור הראשון עד שהוא משתרע על כמחצית מאורכו של הבקבוקון. במידת הצורך, להשתמש בקלטת הטפלון להשיג התאמה הדוקה.
- הכנס את שפופרת הזכוכית השנייה גם עם הסוף מכוסה על ידי רשתות עד שהוא מיושר עם הקצה הפנימי של פקק הגומי.
- מניחים את הבקבוקונים בצורה אופקית על פיסת נייר לבנה על מנת למקסם את הניגוד עם הזבובים בתנאי אור אדום עמומים.
- שברים מתאימים שילוב של זרם האוויר מבעבעים דרך אלכוהול וזרם האוויר מבעבע דרך מים. לפקח על לחץ האוויר ברציפות ולבצע התאמות כנדרש כדי לשמור על ערבוב הרצוי של זרמי האוויר.
הערה: הריצה רציפהשל כמה מבחני טוס בר במקביל או אפילו assay אחת בחדר קטן יכול להוביל להצטברות ניכרת של אדי אלכוהול. כדי להימנע משחרור מתמשך של אדי אלכוהול שעלול להשפיע על החוקר בחדר סגור, מערכת מתאימה צריכה לשים באותו מקום במידה מספקת מסיר אדי אלכוהול שנוצרו במהלך הניסוי. כדי להסיר אדי אלכוהול, להתחבר לצינור 6-12 סנטימטר על גבי שפופרת הזכוכית השנייה בולטת מכל בקבוקון, צרור אותם ולכוון למשפך מערכת ואקום. חוקרים צריכים גם להבטיח כי חדר הבדיקות הניסיוני מאוורר כראוי.
2. הכנת חיות ניסוי
רציונל וסקירה: תרבות ודיור של הזבובים פרופר יפחיתו השתנות בנתונים. זו מושגת באמצעות סטנדרטיזציה ומזעור הלחץ שחווה את הזבובים. מסיבה זו, אין הרדמה (CO 2 או חלופות) משמשת דוריng כל אחד מהשלבים של הפרוטוקול הבא. יתר על כן, זבובים צריכים להיות בגיל מתאים פני ניסויים ונקודות זמן כדי למזער את השונות כמקובל בניתוחים התנהגותיות אחרים, כולל ניסויי למידה וזיכרון 17.
אור שונה: תנאי חושך יכול לשמש כדי לחקור את תפקידו של השעון הביולוגי בתגובה התנהגותית לאתנול. כדי לקבוע אם קצב יומי קיים, ניתן לבצע ניסויים תחת מחזור LD מוגדר למדוד את הביצועים בZeitgeber טיימס הספציפי (ZT). ZT 0 מייצג שחר ומוגדר כזמן של אורות על פי מחזורי LD, בעוד 12 ZT הוא אורות הזמן כבויים עם מחזור LD 00:12 שעה. בתנאים קבועים, זמן היממה (CT) מודד זמן לבעלי החיים בהעדר אותות סביבתיים, כלומר זמן ריצה ללא תשלום, והיא קשורה למחזור entrainment LD הקודם. בטבע מהסוג דרוזופילה, CT משקף ZT הקודם לכמה היום הראשוןים בתנאים קבועים כמו תקופת היממה החופשית פועל ומקצבים הם ~ 24 שעות. כדי למדוד אפנון היממה ולמנוע אפקטים של אור חריפים על התנהגות, זבובים נגררו לאור: מחזורים כהים ולאחר מכן הועברו לתנאי חושך קבוע (DD) לפני ניסויים. ניסויי היממה מבוצעים ביום השני של DD למדוד את הביצועים ביממה טיימס הספציפי (CT).
בדרוזופילה, תנאי תאורה רציפה (LL) לגרום לתפקוד לקוי של היממה עם תנודות מולקולריות לחה או בוטלו גני היממה ליבה והפרעה בקצב היממה התנהגותיות כפי שמעיד פעילות בקצב לא סדירה של תנועה 18-21 וזיכרון לטווח קצר בקצב לא סדיר 17. הפרוטוקול מותאם ללימודי היממה ויכול להיות פשוט יותר לניסויים אחרים. כל ניסויי היממה מתבצעים באמצעות אור עמום אדום (אור אדום תקורה הסביבה <לוקס 1 על גבי ספסל; אורות אדומים קטנים המשמש ב12 סנטימטרים מצינורות~ סוויטה דה לוקס אור 1).
- אחורי הזבובים ב25 מעלות צלזיוס מתחת 12:12 אור hr: תנאי entrainment כהים (LD).
- לאסוף זבובים טריים eclosed בסוף תקופת ימי אור ביום 1 ולאחסן אותם ל24 שעות בתנאי LD במחזיק בקבוקונים המכילים כמות קטנה של מזון ריכוז אגר גבוה כדי למזער את דביקות מזון. הערה: כדי להבטיח זבובים בריאים, בדרך כלל פותחו נאספים, להשתמש רק זבובים שנאספו בימים הראשונים לאחר eclosion מתחיל בבקבוק תרבות.
- לאסוף קבוצות של כ 30 (25-35) זבובים באמצעות aspirator ביום 2 בשלהי תקופת האור, והעברה לבקבוקוני החזקה טריות.
- השתמש במקור אור חזק כדי לכוון את הזבובים לקצה המרוחק של הבקבוקון. בטווח זה, את המספר המדויק של זבובים בכל בקבוקון אינו קריטי כמו תצפיות התנהגותיות מדווחות באחוזים במספר כולל של זבובים נספרו בסוף כל ניסוי.
- לשמור על זבובים בתנאי DD ב25 מעלות צלזיוס עבורr יומיים.
- ביום של הניסוי, למקם את כל הזבובים שוכנו בתנאים או חממות אחרות מאשר התנהגות החדר ניסיוני בחדר במשך שעה לפחות 1 לפני הניסוי שונים. הסתגלות מפחיתה שונות כתוצאה משינויים בטמפרטורה או לחות.
- לבצע תצפיות בשש נקודות זמן ביום (CT 1, 5, 9, 13, 17 ו21) על מנת לבדוק לאפנון היממה של התנהגות.
- שקלו את נקודות זמן רבות בתוך קבוצה אחת של ניסויים התנהגותיים כדי להגדיל את חוסנו של עיצוב ניסיוני ולמזער ספציפי השתנות לניסוי יחיד. לדוגמא, ניתן להשיג תצפיות של CT 1 ו13 CT בו זמנית אם שתי חממות עם לוחות זמנים אור בחושך מול משמשות לentrainment.
הערה: ההליך הנ"ל מתאר את ההכנה של חיות ניסוי עבור מבחני שבוצעו במצב של חושך היממה קבוע. אור שונה: ניתן להשתמש בתנאים חשוכים כדי לחקור את הפונקציה של השעוןבתגובות התנהגותיות לאלכוהול. כדי לקבוע אם קצב יומי קיים ניתן לבצע הניסויים תחת מחזור LD למדוד את הביצועים בZeitgeber טיימס הספציפי (ZT). בנוסף, הפרוטוקול ניתן להשתמש עם זבובים שהועלו בתנאי אור קבועים לתפקוד היממה בדיקות ניסויים. לפרוטוקולים חלופיים הבודקים זבובים שוכנו בתנאי אור, עדיין צריכה להתבצע מבחני התנהגות בתנאים חשוכים. זבובים צריכים להיות מועברים לתוך החושך במשך שעה 1 לפני הניסוי כדי למזער את השונות התנהגותית בשל ההשפעות אקוטיות של אור על התנהגות.
3. תצפיות התנהגותיות
רציונל וסקירה: פרוטוקול ממשל האלכוהול הבא הוא מותאם לתצפיות תחת עמומים תנאי אור אדום. שני המדדים התנהגותיים LoRR וההרגעה מייצגות שתי נקודות שונות של שכרות לטוס. LoRR מייצג נקודת סוף של שכרות בשילוב o האובדןמנוע F ושליטה ביציבה, ואילו צעדי הרגעה נקודת סיום מאוחר מאוד של שכרות. גנוטיפ או אפנון היממה עשוי להשפיע על שני מדדים אלה בצורה שונה; ומכאן אחד מומלץ לבדוק את שניהם. בקיצור, זבובים נטענים בבקבוקונים, מספר זבובי מוצגות LoRR או הרגעה הם קלעו כל 5 דקות במהלך חשיפת אדי אלכוהול, ואת המספר הכולל של זבובים נספרו בסוף הניסוי.
- לפני תחילת הניסוי, הפעל את האוויר דרך המערכת (אוויר מבעבע דרך בקבוקי מים ואלכוהול) לפחות 10 דקות ולהשתמש בזמן הזה כדי לכייל את זרמי האוויר.
- נתק את השחרור מהיר כדי לעצור את זרימת האוויר. טען את הזבובים בבקבוקונים, ולחבר מחדש את זרימת האוויר ולהתחיל את המונים. הערה: אם זבובים להגיב או זבובים מתים נותרים בבקבוקוני האחזקה, זה יכול להצביע על תנאי לחץ. באופן כללי, בתנאים אלה ניתן להקל על ידי דיור פחות זבובים בבקבוקונים מחזיקים או הפחתת דביקות מזון באמצעות קלריכוז אגר ly גבוה יותר במהלך הכנת מזון. עבור ניתוחים התנהגותיים אופטימליים והשתנות מינימאלית בין ניסויים, זבובים צריכים להיות בריאים לפני ניסויים.
- לשמירה על זמן מדויק, השתמש בטיימר אחד כדי לעקוב אחר הזמן הכולל של חשיפה לאלכוהול ולהשתמש בטיימר ספירה לאחור שני כדי לסמן את המרווחים של 5 דקות.
- מניחים פיסת נייר לבן תחת הבקבוקונים מנת להגביר את הניגודיות ולעוף נראות, במיוחד בתנאי אור אדום עמומים.
- בדוק את זרימת האוויר באופן קבוע במהלך ניסוי כדי לשמור על רמות קבועה. באופן כללי, ברגע שזרמי אוויר התייצבו, הם נשארים יציבים במהלך האורך של הניסוי.
- לספור את מספר הזבובים שאיבדו את רפלקס ליישרם פעם אחת כל 5 דקות לתקופה 1 שעות. כמו רגישות האלכוהול משתנה בין גנוטיפים ורקע גנטי, זה עשוי להיות רצוי לבצע הערכות תכופות יותר או לבצע את הניסוי לתקופה ארוכה יותר של זמן.
- הרם את slightl הבקבוקוןy מפני השטח, ולכוון את האור מהאורות אדום פנס לכיוון הנייר מאחורי הבקבוקון. שמור את הפנסים האדומים החזיק ביד במרחק של לפחות 12 סנטימטרים לבקבוקון הניסיוני כדי לשמור על רמות אור שאינו עולות על לוקס 1 לכל הניסויים בתנאי אור אדום עמומים.
- למדוד את רמות אור באמצעות מד אור להקים תקנים לכל הניסויים.
- לקבוע את מספר הזבובים שאיבדו את רפלקס ליישרם על ידי יישום רז חברה לבקבוקון ולספור כמה זבובים מצליחים לתקן את עצמם בתוך כ -4 שניות. זבובים המציגים LoRR עדיין עשויים להזיז את הרגליים והכנפיים שלהם, אבל לא יכולים להסגיר את עצמם זקופים.
- בסוף הפגישה, לספור את המספר הכולל של זבובים בכל בקבוקון.
הערה: לפעמים, זבוב אחד עשוי להיתפס בין הפקק והצד בעת טעינת זבובים לתוך מבחנות ניסוי. כפי שזה נעשה בחושך, זה לא יכול להיות לב בקלות ולכן יש צורך לספור את התחושה הכוללתאה של זבובים בסוף הניסוי כדי לחשב בצורה נכונה באחוזים.
בנוסף, הליך זה יכול גם לשמש למדידת הרגעה של זבובים, המייצגת את נקודת סיום התנהגותיות שונה. בעוד זבובים מסוממים איבדו את רפלקס זכותם, הרגעה דורשת חשיפה לאלכוהול גדול יותר. התנהגותית, הרגעה עשויה להיות מאופיינת בחוסר פעילות מוטורית לכאורה עם זבובים שנותרו חסרי תנועה בבקבוקון הבא רז משרד עורכי aa לבקבוקון השלם. להרגעה, לספור את מספר הזבובים שנותרו ללא תנועה, ללא רגל מנופפת מסירה של רז משרד עורכי של הבקבוקון הבא. בנוסף, הבקבוקון ניתן התגלגל מצד לצד כדי לקבוע אם זבובים בודדים עדיין שומרים רפלקס תופס.
4. ניתוח נתונים
- לקבוע את LoRR אחוז בכל פעם שתוערך בהתבסס על המספר הכולל של זבובים בכל בקבוקון.
- הבדלי הערכה בין נקודות היממה זמן או זנים ידי calculating LoRR 50% עבור כל דגימה, אשר נופל בתוך החלק ליניארי של עקומת סיגמואיד (ראה תרשים 2 להלן).
- סטטיסטיקה אלטרנטיבית:
- אם השוואות בין גנוטיפים מתוכננות, רצוי לנתח את קורס כל הזמן באמצעות מדידות חוזרות ANOVAand כדי לקבוע את הטווח של נקודות זמן שההבדלים הם משמעותיים עם בדיקות post hoc-(איור 3). לבדיקות אלה, אנו מעדיפים להשתמש בערכו של 0.001. זה מאפשר הבדלים בזמנים חשיפת פרט להיות מוערכים, כמו גם הבדלים בין גנוטיפים בשיפוע העקום.
- הבדלים ברגישות ליכולים להיות שנקבעו לשעות מסוימות של חשיפה לאלכוהול לתגובה מסוימת, כגון תרופות הרגעה מהחלק ליניארי של הגרף (איור 4).
- הבדלים בין זנים או נקודות זמן היממה ניתן להעריך באמצעות F-סטטיסטי סטנדרטיים ובדיקות לאחר מעשה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אפנון היממה של אלכוהול רגישות באמצעות LoRR 50% כסמן.
דוגמא מייצגת מראה אפנון היממה ברגישות אלכוהול במהלך היום מוצגת באיור 2. LoRR נמדד בשש נקודות זמן במהלך היום 2 nd של DD בקנטון-S ו50% LoRR נקבעו עבור כל נקודת זמן. ניתוח הראה השפעה משמעותית של שעה ביום (ANOVA: F = 5,45 7.39, p <0.001, N = 6-10 לנקודה זמן). מבחן LSD פישר הראה הבדלים משמעותיים בין CT1 לעומת CT5, CT5 לעומת CT13, CT5 לעומת CT17, CT5 לעומת 21 CT, CT9 לעומת CT13, CT9 לעומת CT17, וCT9 לעומת CT 21. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו בעבר שלנו 1.
הבדלים בין Wild-type וזבובים שעברו מוטציה.
סדרת זמן הדוגמא השנייה משתמשת כדי להראות הבדלים בLoRR והרגעה בין פראי מסוג זבובי קנטון-S וflies נושאת מוטציה אובדן-of-פונקציה לבנה (w 1118) באותו רקע גנטי (איור 3). המוטציה 1118 w היא עניין מיוחד לחוקרי דרוזופילה כקווים מהונדסים לעתים קרובות נוצרו באמצעות זבובים אלה ורבים קווי מוטציה לגני שעון ביולוגיים יש גם את המוטציה w 1118. התוצאות מוצגות כסדרת זמן (איור 3) עם הנתונים המוצגים עבור כל 5 דקות במשך כל תקופת החשיפה. תצפיות מוגבלות ל60 דקות, כדי למנוע תופעות של הצטברות סובלנות המהירה 22-24. W 1118 מוטציות להציג רגישות מופחתת באופן משמעותי LoRR בתגובה לאדי אתנול מאשר קנטון-S (ANOVA בין הנושאים F = 1,10 57.12, p <0.001, N = 6). הבדלי משמעות (= 0.001) נמצאו בניסוי זה מדקות 20 דרך דקות 60 (איור 3A w 1118 וקנטון-S נמצאו גם בשיעור של הרגעה (ANOVA בין הנושאים F = 1,10 137.301, p <0.001, N = 6). ב assay הרגעה, הבדלים משמעותיים (= 0.001) נמצאו בדקות 50, 55, ו60 (איור 3 ב). בנוסף למחסור בפיגמנטים הקרנה בעיניהם, w 1118 מוטציות יש גם רמות נמוכות של סרוטונין, דופמין והיסטמין 25,26. שינויים אלו ברמות האמינים יוגניים עשויים להסביר את הרגישות שינתה לאתנול בw 1118 מוטציות 27,28. לפיכך, שליטה על רמת ביטוי לבן בגנוטיפים assayed עשויה להיות חיונית להערכה מדויקת של רגישות אתנול.
אפנון היממה של הרגעה.
בדוגמא השלישית, מדדנו את אחוז קנטון-S זבובים שקט ורגועד לאחר פרק זמן מוגדר כדי לקבוע אם קיימת השפעה ביולוגי של אלכוהול על הרגעה (איור 4). השווינו את אחוז הזבובים המסוממים ב40 דקות (30% אדי אלכוהול) בשעה 5 CT ו17 והתוצאות מראות כי יש זבובים מסוממים באופן משמעותי פחות בשעתי היום בהשוואה לחשיפה לאלכוהול במהלך הלילה (ANOVA: F = 1,20 6.21, p = 0.022, N = 10 (CT5) ו12 (CT17)). הזבובים לא להגיע לציון הרגעה 50% בתוך השעה כתצפיות שנעשו בתנאי LoRR הרגילים שלנו על מנת לבצע השוואה ישירה אפשרית. תצפיות מעבר לשעה הן בעייתיות בשל ההצטברות של סובלנות המהירה 22-24. בניסוי זה, פחות מ 25% מהזבובים בכל נקודת זמן היממה היו מסוממים ב40 דקות, מצביעים על כך שיש הבדל ברגישות להרגעת קצה מובילה בין הקבוצות הללו. איסוף הנתונים בשלב מוקדם זה בהרגעה הוא המבטא שימושייון שקיימים הבדלים, לעומת זאת היכולת לקבוע את ההשפעה של טיפול על צורת ההתפלגות בתגובות הרגעה היא מוגבלת. כדי לקבוע אם יש הבדל בכל הפצת הרגעה, יש להשתמש בריכוז אתנול גבוה יותר כדי להבטיח קצב מהיר יותר של תרופות הרגעה.
איור 1. FlyBar כדי למדוד את רגישות לאלכוהול ותרופות הרגעה בזבובי פירות.
.. איור 2 דוגמא נציג מראה אפנון היממה משמעותי ברגישות אלכוהול במהלך היום (ANOVA: F = 5,45 7.39, p <0.001, N = 6-10 לכל נקודת זמן; הבדלים משמעותיים בין CT5 לעומת CT1, CT13, CT17, וCT21 וCT9 לעומת CT13, CT17, וCT21).
איור 3. השפעות של אלכוהול על תגובות התנהגותיות שונות באופן משמעותי בין wild-type קנטון-S זבובים ו1118 הזבובים שעברו מוטציה הלבנה אובדן של פונקציה.) זבובים קנטון-S להראות רגישות מוגברת באופן משמעותי לאלכוהול כפי שנמדדו על ידי LoRR לעומת טס עם אותו הרקע הגנטי נושא את המוטציה הלבנה (ANOVA בין הנושאים F = 1,10 57.12, p <0.001, N = 6). ב ') זבובי קנטון-S רגישים יותר להרגעת אלכוהול מאשר w 1118 מוטציות (ANOVA בין נושאים F = 1,10 137.301, p <0.001, N = 6). *p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
. איור 4 נציגי נתונים המשווים את אחוז קנטון-S זבובים מסומם ב40 דקות בין CT 5 ו-CT 17 זבובי Wild-type להפגין עליות גדולות יותר באופן משמעותי בהרגעה ראשונית בCT 17 לעומת CT 5 (ANOVA:. F = 1,20 6.21, p = 0.022, N = 10 (CT5) ו12 (CT17)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
העלויות של שימוש לרעה באלכוהול ואלכוהוליזם לחברה היא אדירות, הן במונחים של עלויות אנושיות 29 וכלכליות 30,31. דרוזופילה כמודל מציעה מערכת מהירה ותכליתית כדי לבחון במהירות את התגובות התנהגותיות של מספר גדול של אנשים ובתור שכזו כבר נעשה שימוש נרחב עבור שניהם אלכוהול 5,7,32-34 ומחקר היממה 35-37.
כאן, אנו תיארתי פרוטוקול פשוט לניהול המבוקר של אדי אלכוהול לזבובים בוגרים בתנאי היממה.
זבובי מעובדות בתנאים סטנדרטיים חשופים לאדי אלכוהול עבור שעה 1 שבמהלכו מספר הזבובים שאיבדו את רפלקס ליישרם הם קלעו כל 5 דקות. הפרוטוקול המתואר כאן הוא מותאם לניסויי היממה בגלל הדרישות נוספות לentrainment ודיור בתנאים קבועים. צעדים שונים יכולים להיות simplifiאד ללימודים הגנרית על ידי הסרת אותם הצעדים שהם חיוניים לניסויים ביולוגיים כגון אחסון בחושך במשך לפחות יום אחד או עושה ניסויים בתנאי אור אדום עמומים. פרוטוקול זה גם יכול לשמש כדי לחשוף מספר רב של זבובים באופן מבוקר לריכוזי אלכוהול שונים לניתוחים ביוכימי או מולקולריים שלאחר מכן. לעקביות עם ניסויים התנהגותיים דרוזופילה אחרים כגון למידה וזכרון תצפיות, מדידה של תגובות התנהגותיות בתנאי אור אדום עמומים עשויים להיות רצוי גם לניסויים שאינן היממה.
וריאציה בין משכפל העצמאי של הניסוי יכולה לטשטש הבדלים קטנים בין מוטציות או זנים מהונדסים או בין נקודות זמן היממה. לכן מומלץ לבדיקת דגימות של זנים מרובים או נקודות זמן היממה בו זמנית (ראה דוגמאות שלנו), כך ש'העתק 'ניתן להוסיף כמשתנה אקראית כדי לחסלהשפעה של השונות בין עותקים.
רגישות לאלכוהול משתנה בין זנים. אחוזי אלכוהול (אחוז של זרימת אוויר מבעבע דרך אלכוהול) צריכים להיות בהתאם. כפי שניתן לראות באיור 3, זבובים נושאים את המוטציה הלבנה הם פחות רגישים להשפעות של חשיפה לאלכוהול מאשר wild-type קנטון-S זבובים. לניתוח של קווים הנושאים את המוטציה הלבנה, זה עשוי להיות רצוי להגדיל את אחוז האלכוהול שבה הזבובים נחשפים כדי לבצע את assay התנהגותיים באותה המסגרת של ניסויים אחרים הזמן כמו חשיפה ארוכה יותר לאלכוהול יכול לגרום לסובלנות מהירה פיתוח. למוטנטים רגישים מאוד לניסויים שבהם יש צורך להקטין את אחוז האלכוהול בשימוש, כמו שנצפה לזבובים המכילים מוטציה בגן הצהוב, זרימת האוויר עשויה להיות מוגבר כדי לכייל את זרימת האוויר רווי באלכוהול בצורה מדויקת. עליות קטנות או דצמברreases (10% ±) בזרימת האוויר כוללת (טווח זרימת אוויר עביד מ900-1,100 מיליליטר / דקה במשך 4 בקבוקוני תצפית) לא נראית כדי להשפיע לרעה על הזבובים.
יש להימנע תצפיות מעבר לשעה 1 במידת האפשר בגלל הפוטנציאל של הצטברות סובלנות מהירה בזבובים 22-24 אשר משפיע על רגישות לאלכוהול. במקום זאת, לקבוע את אחוז האלכוהול עבור כל זן כי תוצאות LoRR 50% בקירוב על ידי 30-40 דקות. אם נדרשת השוואה של זנים עצמאיים רבים, בחר אחוז אחד של אלכוהול שעובד עבור כל הזנים.
פרוטוקול זה תלוי במידה רבה על תצפיות התנהגותיות, ולכן הקפדה על פרוטוקול סטנדרטי היא חיונית כדי למנוע סחף בתצפיות התנהגותיות לאורך זמן. במידת האפשר, יש לבצע תצפיות התנהגותיות, כך שהצופה היא עיוורת לנבדקת נקודת גנוטיפ או זמן. על מנת לזהות הטיה פוטנציאלית בהתבסס על גורמים אלה ואחרים לא ידועים,מומלץ לבחון את הנתונים על מסלול זמן וכדי לוודא שתצפיות להישאר באותו הטווח במהלך סדרת הניסויים.
הגדרת FlyBar מספקת יתרונות מסוימים על פני שיטות אחרות של ממשל אלכוהול לזבובים, במיוחד עבור חוקרים לתואר ראשון או לימודי היממה בהשפעות השליליות של אתנול. מכשיר חלופי כדי למדוד את ההשפעה של אלכוהול על שליטה מוטורית בזבובים הוא inebriometer, טור אנכי שבו אדי אתנול מופצים דרך מתסכל עולה ואובדן שליטה או רגישות של זבוב יציבה יכול להימדד על ידי קביעת המשך הזמן שלוקח ליפול לתחתית העמודה 38,39. Inebriometer מספק קריאת נתונים אוטומטיות של שליטת הפסד של יציבה והוכיחה יקר ערך למחקר אלכוהול בדרוזופילה 9,22,39,40, אבל הפרדיגמה התנהגותי זה דורשת ציוד יקר יחסית, מקום למנגנון, וזמן לכיילולייעל את התנאים. לפיכך, inebriometer לא יכול להיות מתאים גם עבור רבים מעבדות הוראה לתואר ראשון עם תקציבים או שטח מוגבלים, או לחוקרים ביצוע מבחני היממה. שיטה נוספת של אספקת אלכוהול לזבובים ומדידת הרגעה כוללת הצבת כמות קטנה של אלכוהול נוזלי בחומר סופג או בחלק העליון או בחלק התחתון של בקבוקון ולאחר מכן מאפשרת לאלכוהול כדי לאדות עם זמן 41,42. כריכוז של עליות אדי אלכוהול עם זמן, ניתן להעריך תגובות התנהגותיות. בעוד ששיטת המשלוח הזה היא קלה להגדרה, כמות אדי אלכוהול כדי שהזבובים נחשפים משתנה עם זמן ותנאים. לשאלות ניסיוניות שבה הבדלים מוערכים בשיעורים ראשוניים של רגישות או הרגעה, כגון אפנון היממה, רצוי שתהיינה לי רמה קבועה של אדי אלכוהול נמסרו לזבובים. בנוסף, החשיפה של מספר גדול של זבובים לסכום קבוע של exposur האלכוהולדואר, כפי שבוצע עם FlyBar, רצוי לביצועים מדויקים של מבחני סלולריים או ביוכימי במורד הזרם. שיטה נוספת של אספקת אלכוהול לזבובים נפוצים במחקר אלכוהול דרוזופילה מוקדם מעורבת ערבוב האלכוהול למזון כפי שהוא היה מוכן. בעוד ששיטה זו היא קלה ודורשת הגדרה קטנה, הוא מתאים ביותר לחשיפה לאלכוהול כרוני על ימים כריכוז של אלכוהול משתנה עם זמן.
שיטות מתוחכמות יותר, אוטומטית זמינות גם להערכת תגובות של תנועה של זבובים לחשיפה לאלכוהול כולל הקלטת פעילות וידאו ותוכנת ניתוח תמונה 7,43. אלה הם חזקים במיוחד להערכת ההשפעות של אתנול החיוביות, שמפעיל את היתר. עם זאת, בשיטות האוטומטיות אלה עשויות להיות יקרות מדי עבור פרויקטי מחקר לתואר ראשון או מעבדות הוראה ולא יכולות להיות מתוכננת בצורה אופטימלית לניתוח של מספר גדול של זבובים מתחת קונדי היממהtions (למשל, לכידת וידאו בתנאים חשוכים דורשת מאוזנת ומפוזר תאורת אינפרא אדום ומצלמות אינפרא אדום רגישות). אנו מאמינים כי FlyBar מספק להגדרת שיטה, יעיל וחסכונית קל למערכת אספקת אלכוהול וההערכה של תגובות התנהגותיות לאלכוהול, כי הוא מותאם היטב למגוון רחב של מצבים ועיצובים מעבדה.
שינויי פרוטוקול:
הפרוטוקול שתואר לעיל נועד לבחון את ההשפעה של חשיפה לאלכוהול על הפסד של חסין רפלקס בהקשר היממה. עם זאת, הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות כדי להתאים לסוגים אחרים של ניסויים באלכוהול.
בוחן את התגובה לאלכוהול מתחת לגיל 12 HR-12 שעה אור כהה (LD; Zeitgeber זמן) תנאים: שמור על זבובים תחת שעות 12: מחזור LD שעות 12 עד הניסוי. העבר את הזבובים לחשכה כ 1 שעות לפני הניסוי שנערך במהלך שלב האור (ZT 1, 5, ו -9) של היום. הפעולה זו תבטיח כי ההשפעה חריפה של אור לא בלבול התוצאות.
בוחן את התגובה לאלכוהול בתנאי אור קבועים: זבובי Culturing תחת תוצאות תנאי אור קבועים בשיבוש שעון היממה שלהם 18-21 ותגובות בקצב לא סדירות לחשיפה לאלכוהול 1. זבובים עשויים להיות מועברים לאפלות כ 1 שעות לפני הניסוי, כדי שהזבובים נבדקים באותם תנאים כמו זבובים נשמרים בLD או תנאי DD.
הרגעה: זבובים שהם מסוממים ניתן להפריד LoRR עפה בגלל זבובים להישאר ללא תנועה על החלק התחתון של הבקבוקון, בעוד LoRR זבובים עדיין יעברו הכנפיים, הראש והרגליים שלהם. זבובים שהתערוכה LoRR עדיין מגיב בתנועות עדינות כאשר הבקבוקון הוא מופרע. הרגעה של זבובים נקבעה על ידי ta לספור את מספר ללא תנועה שנותרה זבובים אחרי חברהp לבקבוקון. בנוסף, גלגול של הבקבוקון יכול לשמש כדי לקבוע אם זבובים בודדים עדיין שומרים רפלקס תופס.
שחזור: assay התנהגותיים ניתן להרחיב על ידי מדידת התאוששות כפרמטר נוסף של תגובת אלכוהול. להפסיק את החשיפה לאלכוהול ולהמשיך לבצע תצפיות לגבי LoRR כל 5 דקות. המשך הזרימה של אוויר humidified דרך הבקבוקונים במהלך תקופות התאוששות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מימון למחקר זה מסופק על ידי תכנית במדעי המוח בפרס ממדינת מכללת פלורידה לרפואה של האוניברסיטה ותמיכה מהמחלקה למדע ביולוגי בברית המועצות לשעבר. מימון נוסף מסופק על ידי גרנט-in-Aid מקרן המחקר של אלכוהול משקאות היצרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y-connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature air regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature air regulator mounting bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. Deaths: Final data for 2007. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention: National Center for Health Statistics. (2010).
- The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , Columbia University. (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , Available from: www.medtext.com/hdcn.htm (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. Pfaff, D. W., Kieffer, B. 1129, Blackwell Publishing. 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
