Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Flybar: Администрирование Алкоголь в мух

Published: May 18, 2014 doi: 10.3791/50442
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Biological Science, Florida State University, 2Department of Biology and Biochemistry, Biology of Behavior Institute, University of Houston

Summary

Drosophila стала значительным модельной системы для рассечения клеточные и молекулярные основы поведенческих ответов на алкоголь. Здесь мы приводим протокол для сбора данных чувствительности алкоголя в циркадных контексте, который может быть с легкостью применить для других экспериментов и хорошо подходит для студентов исследований.

Abstract

Плодовые мушки (дрозофилы) являемся известной модели как для исследования алкоголя и циркадных биологии. Недавно мы показали, что циркадные часы модулирует чувствительность алкоголя, но не формирование толерантности. Здесь мы описываем наш протокол подробно. Алкоголь вводят мух с использованием Flybar. В этой конфигурации, насыщенных паров алкоголя смешивается с увлажненным воздухом в заданных пропорциях, и вводили мух в одновременно четырех трубок. Мухи выращивают в стандартных условиях с целью минимизации Разница между повторами. Трехдневные старые мухи разных генотипов или лечения используются для экспериментов, предпочтительно путем сопоставления мух двух различных временных точках (например, КТ 5 и СТ 17) принятие возможно прямое сравнение. В ходе эксперимента мухи подвергаются в течение 1 часа в заранее определенном проценте парами спирта и количества мух, которые демонстрируют утрата установочного рефлекса (Lorr) или седAtion подсчитываются каждые 5 минут. Эти данные могут быть проанализированы с использованием трех различных статистических подходов. Во-первых, определить время, при которой 50% от мух потеряли свою рефлекса и использовать анализ дисперсии (ANOVA) для определения того, существуют ли значительные различия между моментами времени. Вторая заключается в определении процентных мух, которые показывают Lorr после определенного количества минут, а затем на основе анализа ANOVA. Последний метод является анализ временных рядов весь помощью многомерного статистического анализа. Протокол также может быть использован для не-циркадных экспериментов или сравнений между генотипами.

Introduction

Дрозофилы продемонстрировать двухфазные поведенческие реакции на алкоголь 1, аналогичные реакции человека на этот препарат 2,3. После первого воздействия низких концентраций алкоголя, мухи обладают повышенной двигательной активности, заменены отсутствия координации движений, потеря постурального контроля и восстанавливающих рефлексов (утрата установочного рефлекса: Lorr) и седации (полное отсутствие двигательной активности в ответ на механическое раздражение) как воздействие алкоголя прогрессирует 4-9. Эндогенный циркадные часы является сильным модулятор чувствительности алкоголя и токсичности как это наблюдается у мышей 10,11, крыс 12, и человека 13. Последние достижения в области исследований Drosophila показали циркадные часы модулирует острый чувствительность алкоголя, но не алкоголя терпимости 1. Мощные генетические подходы, доступные в дрозофилы через мутантных исследований и трансгенных манипуляций пространственныхи выражение временная ген обеспечить систему, которая позволяет быстро достичь успехов в выявлять основополагающие клеточные и молекулярные механизмы для сложных форм поведения. Использование Drosophila в качестве инструмента следственной позволило по существу успехи в понимании нейробиологии спирта, которые могут быть быстро переведены в млекопитающих 14-16. Для того чтобы облегчить понимание молекулярных механизмов, посредством которых циркадные часы модулирует чувствительность алкоголя и равномерно измерить поведенческие реакции через циркадных моменты времени, протокол администрирования алкоголя, подходящий для использования в условиях слабого освещения красный свет не требуется. Для дрозофилы, алкоголь можно вводить через пищевых добавок для хронического воздействия или надежно через администрирование алкоголь в виде пара для остром воздействии. Здесь мы описываем протокол администрирования алкоголь подходящий для оценки циркадного модуляции Потеря-рефлекса (Lorr) 1, а такжеседативный.

Мухи, увлекаются 12 часов: 12 циклов час LD при постоянной температуре, а затем переведен в контролируемой светового режима в течение 2-5 дней в зависимости от экспериментальной вопрос. Мухи подвергаются паров этанола в устройстве, известном как Flybar. В этом устройстве контролируемые количества воздуха пропускается через воду и спирт; пары затем смешивают и направляют в флаконе жилья мухи. Каждый 5 мин мух забил на номер, который не удается отобразить восстанавливающее рефлексы или стали отключке. Lorr проценты для каждой временной точки рассчитаны и сопоставлены среди циркадных моменты времени или между штаммами мух. Простота и надежность доставки алкоголя с помощью доставки Flybar алкоголя в сочетании с поведенческими возможностями подведения итогов обеспечивает значительное преимущество для циркадных экспериментов, проведенных в условиях низкой освещенности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ассамблея Flybar

Обоснование и обзор: Система предназначена для управления контролируемых процент паров алкоголя в мух. Примечание: На рисунке 1 представлен схематический обзор Flybar настройки, как описано ниже в три этапа (монтаж воздушного потока, настройка спирта и бутылки с водой, и монтаж флаконов наблюдения). Короче говоря, устойчивый поток воздуха разделяется на две фракции, которые пропускают через спирта и воды, соответственно, смешанных и вводимых 4 флаконов наблюдения.

  1. Ассамблея Airflow
    1. Подключите короткий кусок гибкой трубки силиконовой к либо здание воздух или аквариум аэратор для создания постоянного потока воздуха и раскол с помощью у-разъем. Подключение первое отделение на регулятор расхода воздуха, который регулирует общее количество воздуха через систему (обычно 1000 мл / мин в течение 4 ампулы наблюдений).
    2. Вставьте быстрый разъем в второй трубкитак что воздушный поток может быть прерван в начале эксперимента, не влияя на калиброванный поток воздуха. Добавить у-разъем и подключить каждый ветвления трубку к регулятору воздушного потока.
    3. Подключите трубку к регуляторам потока воздуха, а затем соединить два потока воздуха метров.
  2. Настройка из спирта и воды Бутылки
    1. Добавить гибкий шланг к выходу из воздушного потока метров и вставьте тонкий стеклянную трубку (разделы 1 мл стеклянных пипеток) с 90 ° изгибом в конце каждого отрезка трубы. Это будет служить воздушного потока на входе в воду и бутылок алкоголя.
    2. Поместите резиновые пробки с 2 отверстиями через них в бутылками с спирта и воды. Держите обе бутылки при постоянной температуре 2 ° C выше, чем температура окружающего воздуха с помощью водяной бани. В наших экспериментах на окружающую номер поддерживается на уровне 25 ° С, в то время как вода ванны при температуре 27 ° С.
    3. Вставьте прямой стеклянной пипетки для аИК впускной через резиновую пробку и расширить в жидкость до примерно 1 см от дна бутылки.
    4. Вставка раздел локоть стеклянной пипетки в остальные отверстия в резиновой пробкой до конца стакана не находится на одном уровне с нижней пробкой внутри бутылки. Вставьте этот выход воздуха в другой длины трубы.
    5. Воссоединиться воздушные потоки с помощью у-разъем и использовать другой длины силиконовой трубки, чтобы направить поток воздуха через пустой колбе перемешивания или бутылку с гнутых стеклянной пипетки, вставленных через двумя отверстиями резиновой пробкой. Используйте другой длины силиконовой трубки для выпускного смешанной воздушный поток.
  3. Ассамблея по наблюдению флакон
    1. Разделение выпускной воздушный поток выходящего из смесительной колбу 2-3X, чтобы получить 4 или 8 меньшие потоки воздуха таким образом, что несколько флаконов наблюдений могут быть использованы в каждом эксперименте. Подключите гибкий силиконовый шланги к флаконах наблюдения.
    2. Настройте observatiна флаконах с использованием пустые флаконы герметично закрывают резиновой пробкой, содержащей два отверстия, через которые стеклянные трубки обеспечивают вход и выход для паров спирта.
    3. Накройте конец первого стеклянной трубки с сеткой и держать сетки на месте с помощью небольшой кусочек гибкой пластиковой трубки. Вставка эту трубку через первое отверстие, пока она не простирается примерно половину длины флакона. При необходимости используйте тефлоновую ленту для получения плотного прилегания.
    4. Вставьте второй стеклянную трубку и с конца, покрытой сеткой, пока она не находится на одном уровне с внутреннего края резиновой пробкой.
    5. Поместите пробирки горизонтально на белом листе бумаги, чтобы максимизировать контраст с мухами в условиях плохого красный свет.
    6. Смешайте Соответствующие фракции из воздушного потока пропускают через спирта и воздушный поток пропускается через воду. Монитор давления воздуха непрерывно и вносить коррективы по мере необходимости для поддержания желаемого перемешивание воздушных потоков.
      Примечание: непрерывной работыиз нескольких анализов Fly Bar параллельно или даже одном анализе в маленькой комнате может привести к заметному накопления паров алкоголя. Чтобы избежать постоянного выпуск алкоголя паров, которые потенциально могут повлиять на исследователя в закрытом помещении, соответствующая система должна быть введена в действие, адекватно удаляет алкоголя паров, образующихся во время эксперимента. Для удаления паров алкоголя, подключить 6-12 дюймовый кусок трубы на второй стеклянной трубки, выступающей из каждого флакона, расслоение их и направить в воронку-вакуумной системы. Исследователи должны также гарантировать, что экспериментальная комната тестирования достаточной вентиляцией.

2. Подготовка экспериментальных животных

Обоснование и обзор: Правильное культуры и жилья мух уменьшит изменчивость в данных. Это достигается за счет стандартизации и минимизации стресса, испытываемого мух. По этой причине, не анестезия (СО 2 или альтернативы) не используется Duriнг любой из следующих шагов протокола. Кроме того, мухи должны быть соответствующей возрастной через экспериментов и временных точках, чтобы минимизировать изменчивость как стандарт для других поведенческих анализов в том числе обучения и памяти экспериментов 17.

Различные света: темные условия могут быть использованы для исследования функции циркадных часов в поведенческой реакции на этанол. Чтобы определить, суточный ритм существует, эксперименты могут быть выполнены под определенным LD цикла для измерения производительности на конкретном Zeitgeber Таймс (ZT). ZT 0 представляет рассвет и определяется как время огней на под циклов LD, а ZT 12 это время свет выключен с 12:12 час LD цикла. При постоянных условиях, Суточный время (КТ) измеряет время для животного в отсутствие экологических сигналов, т.е. в режиме свободной генерации времени, и связана с предыдущего цикла LD увлечения. В дикого типа Drosophila, КТ отражает предыдущий ZT в течение первых нескольких днейс в постоянных условиях, что и в режиме свободной генерации циркадного периода и ритмов являются ~ 24 часа в сутки. Для измерения циркадного модуляции и устранить острые световые эффекты на поведение, мухи увлекаются в свет: темные циклы, а затем переведен в постоянных условиях недостаточной освещенности (DD) до экспериментов. Суточный эксперименты проводятся на второй день DD для измерения производительности на конкретном циркадного Таймс (КТ).

У дрозофилы, непрерывный свет (LL) условия приводят к циркадного дисфункции с влажными или отменили молекулярных колебаний основных циркадных генов и нарушению поведенческих циркадных ритмов, о чем свидетельствует аритмии двигательной активности 18-21 и аритмии кратковременной памяти 17. Протокол оптимизирован для циркадных исследований и может быть упрощена для других экспериментов. Все циркадные эксперименты проводятся с использованием тусклый красный свет (окружающий накладные красный свет <1 лк на рабочей поверхности стола, небольшие красные огни, используемый в 12 сантиметрах от труб~ 1 люкс свет).

  1. Задние мухи при 25 ° С под 12:12 ч света: темные условия увлечения (LD).
  2. Сбор недавно eclosed мух в конце летнее-период на 1 день и хранить их в течение 24 часов в условиях LD в проведении флаконов, содержащих небольшое количество высокой агар пищи концентрации минимизации продовольственной липкости. Примечание: Для обеспечения здоровых, нормально развитые мухи собираются использовать только мух, собранных в течение первых дней после вылупления начинается в бутылке культуры.
  3. Сбор партий примерно 30 (25-35) летит с помощью аспиратора в день 2 к концу светового периода и переход к свежей холдинговых флаконах.
  4. Используйте сильный источник света, чтобы направить мух в дальний конец флакона. В пределах этого диапазона, точное количество мух в каждом флаконе не является критическим как поведенческие наблюдения приведены в процентах с общим числом подсчитанных мух в конце каждого эксперимента.
  5. Поддерживать мух в условиях DD при 25 ° С FOг два дня.
  6. В день эксперимента разместить все мух, размещенных в различных условиях или других, чем экспериментальный комнате поведение в комнате в течение не менее 1 часа до начала эксперимента инкубаторов. Акклиматизация снижает изменчивость в связи с изменением температуры или влажности.
  7. Провести наблюдения в шести точках раз в день (CT 1, 5, 9, 13, 17 и 21), чтобы проверить для циркадного модуляции поведения.
  8. Сравните различные моменты времени в пределах одного набора поведенческих экспериментов по повышению надежности опытно-конструкторских и минимизации изменчивости, специфичных для одного эксперимента. Например, наблюдения КТ 1 и КТ 13 можно получить одновременно, если две инкубаторы с противоположных светло-темных графиков используются для захвата.
    Примечание: Описанная выше процедура описывает получение экспериментальных животных для анализов, проведенных в циркадных условии постоянной темноте. Различные света: темные условия могут быть использованы для исследования работы часов,в поведенческих реакций на алкоголь. Чтобы определить, суточный ритм существует эксперименты могут быть выполнены под цикла LD для измерения производительности на конкретном Zeitgeber Таймс (ZT). Кроме того, протокол может быть использован с мухами, поднятых в условиях постоянных легких для тестирования эксперименты циркадного дисфункции. Для альтернативных протоколов, которые проверяют мух, размещенные в легких условиях, поведенческие анализы еще должны быть выполнены в условиях низкой освещенности. Мухи должны быть переданы в темноте в течение 1 ч до эксперимента, чтобы минимизировать вариабельность поведения из-за острых воздействия света на поведение.

3. Поведенческие Наблюдения

Обоснование и обзор: Следующий протокол администрация алкоголь оптимизирован для наблюдений при слабом состоянии красный свет. Две поведенческие меры Lorr и седации представляют две различные точки летучей опьянения. Lorr представляет собой позднюю точку опьянения, включающий потерю Oе двигатель и постуральный контроль, в то время как седации мер очень поздно конечная точка опьянения. Генотип или циркадный модуляции может повлиять на эти две меры разному; следовательно, один, возможно, пожелают рассмотреть и другое. Короче говоря, мухи загружаются в ампулах, количество мух отображения Lorr или седации забил каждые 5 мин при воздействии паров алкоголя, и общее количество мух подсчитанных в конце эксперимента.

  1. Перед началом эксперимента, запустить воздух через систему (воздух пропускается через воду и бутылок алкоголя) в течение не менее 10 мин и использовать это время для калибровки расхода воздуха.
  2. Отключите быстрое освобождение, чтобы остановить поток воздуха. Загрузите мух в пузырьках, и подключите воздушный поток и начать таймеры. Примечание: Если не реагировать мухи или мертвые мухи оставляют в холдинговых флаконах, это может свидетельствовать о стрессовых условиях. В общем, эти условия могут быть облегчены путем помещения меньше мух в проведении флаконах или уменьшения липкости пищи с использованием небольшоелы высокая концентрация агара во время приготовления пищи. Для получения оптимальных поведенческих анализов и минимальной изменчивости между экспериментов, мухи должны быть здоровыми до экспериментов.
  3. Для точного отсчета времени, использовать один таймер для отслеживания общего времени воздействия алкоголя и использовать второй счетчик обратного таймер, чтобы отметить каждые 5 мин.
  4. Поместите лист белой бумаги под флаконы для увеличения контрастности и летать видимость, особенно в условиях плохого красный свет.
  5. Проверьте расход воздуха регулярно во время эксперимента, чтобы поддерживать постоянный уровень. Как правило, один раз воздушные потоки стабилизировались, они остаются стабильными в течение продолжительности эксперимента.
  6. Подсчитайте количество мух, которые потеряли свои рефлекса раз в 5 мин в течение 1 часа. Поскольку чувствительность спирт варьируется между генотипами и генетических фонов, может быть желательно выполнить более частые оценки или провести эксперимент в течение более длительного периода времени.
  7. Поднимите флакон slightlу от поверхности, и направлять свет от красного света фонарика к работе за флакона. Держите ручные красные фонарики на расстоянии не менее 12 дюймов до экспериментальной флакон для поддержания уровня освещенности не более 1 люкса для всех экспериментов в условиях плохого красный свет.
  8. Измерьте уровень освещенности, используя экспонометр установить стандарты для всех экспериментов.
  9. Определить количество мух, которые потеряли свои рефлекса, применяя твердую кран во флакон и посчитайте, сколько мух не могут наделить себя в течение примерно 4 сек. Мухи, которые отображают Lorr еще может перемещать свои ноги и крылья, но не может превратить себя в вертикальном положении.
  10. В конце сессии, подсчитать общее количество мух в каждом флаконе.
    Примечание: Иногда, один муха может быть зажат между пробкой и стороны при погрузке улетает в экспериментальных флаконов. Как это делается в темноте, он не может быть легко заметил поэтому необходимо подсчитать общее онемениеэ мух в конце эксперимента, чтобы правильно рассчитать проценты.

Кроме того, эта процедура также может быть использован для измерения торможение мух, который представляет собой различные поведенческие конечную точку. В то время как в отключке мухи потеряли свою правую рефлекс, седативный требуется большее воздействие алкоголя. Поведенчески, седативный эффект может характеризоваться полным отсутствием видимой двигательной активности с мухами оставаясь неподвижным во флаконе следующее аа фирмы крана на флаконе. Для седации, подсчитать количество мух, которые остаются неподвижными с не нога не размахивая следующую поставку твердой крана флакона. Кроме того, флакон может быть развернута из стороны в сторону, чтобы определить, является ли отдельные мухи-прежнему сохраняют свою захвата рефлекс.

4. Анализ данных

  1. Определить процент Lorr в каждый момент времени на основании оцененной общего количества мух в каждом флаконе.
  2. Оценить различия между циркадных моменты времени или штаммов по calculatiнг 50% Lorr для каждого образца, который находится в пределах линейной части кривой сигмовидной (см. рисунок 2 ниже).
  3. Альтернативные статистика:
    1. Если сравнение между генотипами планируется, желательно проанализировать весь ход времени с помощью повторных измерений ANOVAand чтобы определить диапазон временных точках, что различия существенны с пост-специальных тестов (рис. 3). Для этих испытаний, мы предпочитаем использовать значение 0,001. Это позволяет различия в отдельных выдержек быть оценены, а также различий между генотипами в наклона кривой.
    2. Различия в чувствительности может быть определена для конкретного времени выдержки спирта для конкретной реакции, таких как седативный эффект от линейной части графика (фиг. 4).
    3. Различия между штаммами или точек циркадный времени можно оценить, используя стандартные F-статистики и пост-специальные тесты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Суточный Модуляция алкоголя Чувствительность помощью 50% Lorr в качестве маркера.

Представитель пример, показывающий, циркадный модуляции чувствительности алкоголя в течение дня представлена ​​на рисунке 2. Lorr измеряли в шести точках времени во время 2-й день DD в кантоне-S и 50% Lorr определяли для каждой временной точке. Анализ показал значительное влияние времени суток (ANOVA: F 5,45 = 7,39, р <0,001, N = 6-10 за время точка). ЛСД критерий Фишера показали значительные различия между СТ1 по сравнению с тарифами CT5, CT5 по сравнению с тарифами CT13, CT5 по сравнению с тарифами CT17, CT5 по сравнению с тарифами CT 21, CT9 по сравнению с тарифами CT13, CT9 против CT17 и CT9 по сравнению с тарифами CT 21. Этот результат согласуется с ранее опубликованными результатами 1.

Различия между дикого типа и мутантных мух.

Во втором примере используется временной ряд, чтобы показать различия в Lorr и седации между дикого типа Canton-S мух и FLIэс, несущие с потерей функции белый мутацию (ж 1118) в том же генетическом фоне (рис. 3). Ж 1118 мутация представляет особый интерес для дрозофилы исследователями как трансгенные линии часто создаются с помощью этих мух и много мутантные линии для циркадных генов часов также имеют мутации ж 1118. Результаты представлены в виде временных рядов (рис. 3) с данными, показанными на каждые 5 мин в течение всего периода экспозиции. Наблюдения ограничены 60 мин, чтобы избежать последствий быстрого допуска накопления 22-24. Ш 1118 мутанты обнаруживают значительно пониженную чувствительность Lorr в ответ на паров этанола, чем делает Canton-S (ANOVA между субъектами F 1,10 = 57,12, р <0,001, N = 6). Значимость различий (= 0,001) были найдены в этом эксперименте с мин 20 через мин 60 (рис. 3А ж 1118 и Canton-S были также найдены в размере седации (ANOVA между субъектами F 1,10 = 137,301, р <0,001, N = 6). В седации анализе значимых различий (= 0,001) были найдены в минутах 50, 55 и 60 (фиг. 3B). В дополнение к отсутствием скрининга пигментов в их глазах, что ж 1118 мутанты также пониженные уровни серотонина, дофамина и гистамина 25,26. Эти изменения в биогенных аминов уровней можно объяснить измененной чувствительностью к этанола в ж 1118 мутантов 27,28. Таким образом, контролировать уровень белого выражения в анализируемых генотипов может иметь важное значение для точной оценки чувствительности этанола.

Суточный Модуляция седации.

В третьем примере, мы измерили процент Canton-S летит степенныйг после определенного количества времени, чтобы определить, есть ли циркадный эффект алкоголя на седации (рис. 4). Мы сравнили процент мух седативные при 40 мин (30% паров спирта) при КТ 5 и 17, и результаты показывают, что существенно меньше седативные мух в течение дня по сравнению с воздействием алкоголя в течение ночи (ANOVA: F 1,20 = 6.21, р = 0,022, N = 10 (CT5) и 12 (CT17)). Мухи не достиг 50% седации знак в течение часа, как наблюдения были сделаны в наших стандартных условиях Lorr для того, чтобы сделать возможным прямое сравнение. Наблюдения за пределами час проблематичны из-за накопления быстрого толерантности 22-24. В этом эксперименте, менее 25% от мух на обоих циркадного момент времени были в отключке на 40 мин, указывая, что есть разница в ведущей чувствительности край седации между этими группами. Сбор данных на этом раннем этапе в седации является полезным индикацииионный что существуют различия, однако способность определить влияние лечения на форму распределения в ответах седации ограничено. Чтобы определить, есть разница в распределении, седативный эффект, более высокая концентрация этанола должен быть использован, чтобы обеспечить высокую скорость седативного эффекта.

Рисунок 1
Рисунок 1. Flybar измерить чувствительность алкоголя и седативный эффект в плодовых мушек.

Рисунок 2
.. Рисунок 2 Представитель пример, показывающий значительный циркадный модуляции чувствительности алкоголя в течение дня (ANOVA: F 5,45 = 7,39, р <0,001, N = 6-10 в момент времени; существенные различия между CT5 против СТ1, CT13, CT17, CT21 и и CT9 против CT13, CT17, CT21 и).

Рисунок 3
Рисунок 3. Воздействие алкоголя на поведенческих реакций значительно отличаются между дикого типа Canton-S летит и с потерей функции белые 1118 мутантные мухи. A) Кантон-S мухи показывают значительно повышенную чувствительность к алкоголю как измерено Lorr по сравнению с летит с тем же генетическим фоном, несущего белый мутацию (ANOVA между субъектами F 1,10 = 57,12, р <0,001, N = 6). B) Кантон-S мухи более подвержены алкогольной седации чем ш 1118 мутантов (ANOVA между субъектами F 1,10 = 137,301, р <0,001, N = 6). *р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001.

Рисунок 4
. Рисунок 4 Представительства данные, сравнивающие процент Canton-S мухи отключке на 40 мин между КТ 5 и СТ 17 мух дикого типа демонстрируют значительно большее увеличение начальной седации при КТ 17 по сравнению с КТ 5 (ANOVA:. F 1,20 = 6.21, р = 0,022, N = 10 (CT5) и 12 (CT17)).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Расходы, связанные с злоупотреблением алкоголем и алкоголизма для общества огромен, как с точки зрения человека 29 и экономических издержек 30,31. Дрозофилы как модель предлагает быстрый и универсальную систему для быстрого изучения поведенческих реакций большого количества людей, и как таковой широко используется как для алкоголя 5,7,32-34 и циркадных исследований 35-37.

Здесь мы описали простой протокол для регулируемого введения паров алкоголя в взрослых мух под циркадных условиях.

Мухи культивируемых в стандартных условиях подвергаются воздействию паров спирта в течение 1 часа, в течение которого количество мух, утративших рефлекса оцениваются каждые 5 минут. Протокол, описанный здесь оптимизирован для циркадных экспериментов из-за дополнительных требований к увлечения и жилья при постоянных условиях. Различные шаги могут быть Simplifiред для общих исследований, удалив те шаги, которые необходимы для циркадных экспериментов, таких как хранение в темноте в течение не менее одного дня или делать эксперименты в условиях слабого освещения красный свет. Этот протокол также может быть использован, чтобы выставить большое количество мух в контролируемым образом в той или иной концентрации алкоголя для последующих биохимических или молекулярных анализов. Для совместимости с другими Drosophila поведенческих экспериментов, таких как обучение и наблюдениями памяти, измерения поведенческих реакций в условиях слабого освещения красный свет может быть желательно даже для не-циркадных экспериментов.

Вариация между независимыми повторах эксперимента может скрыть небольшие различия между мутантов или трансгенных линий или между циркадных времени. Поэтому рекомендуется, чтобы тестовых образцов нескольких штаммов или циркадных временных точках одновременно (см. наши примеры), так что "реплики" может быть добавлен в качестве случайной величины с целью устранениявлияние изменения между репликами.

Чувствительность к алкоголю колеблется между штаммами. Проценты к спиртному (процент воздушного потока пузырьков через спирта) должны быть соответствующим образом скорректированы. Как видно на рисунке 3, летит проведения белый мутацию менее восприимчивы к воздействию воздействия алкоголя, чем дикого типа Canton-S летит. Для анализа линий, несущих белый мутацию, может быть желательно увеличить процент спирта, к которому мухи подвергаются так, чтобы выполнять поведенческий тест, в те же сроки в других экспериментах в качестве длительного воздействия алкоголя может привести к быстрому толерантности развитие. Для очень чувствительных мутантов и для экспериментов в которых необходимо, чтобы уменьшить процент алкоголя, используемый, например, наблюдается для мух, содержащих мутацию в желтом гена, воздушный поток, возможно, придется увеличить до калибровки алкоголя насыщенный поток воздуха точно. Небольшое увеличение или декабреreases (± 10%) в общем потоке воздуха (рабочий диапазон расхода воздуха от 900-1100 мл / мин в течение 4 флаконов наблюдения), кажется, не оказывает отрицательного влияния на мух.

Наблюдения за пределами 1 часа следует избегать, когда это возможно, поскольку существует опасность быстрого наращивания толерантности в мух 22-24 что влияет чувствительность алкоголя. Вместо этого определить процент алкоголя для каждого штамма, который приводит в приблизительном 50% Lorr на 30-40 мин. Если сравнение нескольких независимых штаммов требуется, выберите один процент алкоголя, который работает для всех штаммов.

Этот протокол во многом зависит от поведения наблюдений, так строгое соблюдение стандартизованного протокола необходимо, чтобы избежать дрейфа в поведенческих наблюдений с течением времени. Если это возможно, поведенческие наблюдения должны быть выполнены так, что наблюдатель слеп к генотип или момент времени проходит испытания. Для того, чтобы обнаружить потенциальное смещение на основе этих неизвестных и других факторов,желательно, чтобы изучить данные о времени, конечно, и чтобы убедиться, что наблюдения остаются в том же диапазоне в течение всего экспериментального серии.

Flybar установка обеспечивает определенные преимущества по сравнению с другими методами управления алкоголя для мух, особенно для студентов исследователей или циркадных исследований по негативных последствий этанола. Альтернативный устройство для измерения действие алкоголя на управления двигателем в мух является inebriometer, вертикальный столбец, в котором этанол пар циркулирует через рост перегородками и потерей постурального контроля или чувствительности лету может быть измерена путем определения времени, необходимого упасть на нижней части колонны 38,39. Inebriometer обеспечивает автоматизированный отсчет с потерей постуральной контроля и оказался ценным для исследования алкоголя у дрозофилы 9,22,39,40, но это поведенческая парадигма требует относительно дорогостоящее оборудование, место для аппарата, и время для калибровкии оптимизировать условия. Таким образом, inebriometer не может быть хорошо подходит для многих студентов учебных лабораторий с ограниченным бюджетом или пространстве, или для исследователей, выполняющих циркадные анализов. Другой способ доставки алкоголь мух и измерения седативный эффект включает в себя размещение небольшое количество жидкого спирта на абсорбирующего материала либо в верхней или в нижней части флакона, а затем позволяя спирт для испарения со временем 41,42. По мере увеличения концентрации увеличивается паров алкоголя с течением времени, поведенческие реакции могут быть оценены. Хотя этот способ доставки легко настройки, количество паров спирта в которых мухи подвергаются зависит от времени и условий. Для экспериментальных вопросов, в которых различия, оцененных в начальных скоростей чувствительности или седативного эффекта, таких как циркадного модуляции, желательно иметь постоянный уровень алкоголя паров доставлен мух. Кроме того, воздействие большого количества мух с постоянным количеством спирта exposurе, как выполнены с Flybar, желательно для точного выполнения последующих сотовой или биохимических анализов. Другой метод доставки алкоголь мух общих в начале исследования алкоголя Drosophila участие смешивания спирта в пищу, как он был подготовлен. Хотя этот метод легко и не требует большого настройку, она лучше всего подходит для хронического воздействия алкоголя в течение нескольких дней, так как концентрация изменений алкоголем со временем.

Более сложные, автоматизированные методы, также доступны для оценки опорно-двигательного аппарата ответы мух воздействия алкоголя, включая записи видео деятельности и анализа изображений программное обеспечение 7,43. Они особенно мощным для оценки позитивных, гипер-активации эффекты этанола. Тем не менее, эти автоматизированные методы могут быть слишком дорогими для студентов исследовательских проектов или учебных лабораториях и не могут быть оптимально предназначен для анализа большого количества мух под циркадного услоусловиям (например, захвата видео в условиях низкой освещенности требуется сбалансированный и диффузных инфракрасного освещения и инфракрасные чувствительные камеры). Мы считаем, что Flybar предоставляет простой в настройке, экономически эффективный способ алкоголя системы доставки и оценки поведенческих реакций на алкоголь, который хорошо подходит для различных условий и лабораторных образцов.

ПРОТОКОЛ ИЗМЕНЕНИЯ:

Протокол, описанный выше, направлены на изучения влияния воздействия алкоголя на с потерей восстанавливающих-Reflex в циркадных контексте. Однако протокол может быть легко модифицирована, чтобы приспособить другие типы экспериментов с алкоголем.

Изучение реакции на алкоголь в возрасте до 12 ч-12 ч свет-темнота (LD; Zeitgeber время) условия: Поддержание мух до 12 часов: 12 часов LD цикл до эксперимента. Передача мух на темную приблизительно 1 час до начала эксперимента, проведенного в легкой фазе (ZT 1, 5И 9) в день. Это будет гарантировать, что острый эффект света не смешивая результаты.

Изучение реакции на алкоголь в условиях постоянных легких культивирование летает под постоянными Условия освещения приводит к нарушению их циркадных часов 18-21 и аритмических ответов на воздействия алкоголя 1. Мухи могут быть переданы в темноте примерно 1 час до начала эксперимента, так что мухи испытывали в таких же условиях, как мухи, поддерживаемых в LD или условий DD.

Торможение: Мухи, которые в отключке может быть отделена от Lorr летит, потому что мухи остаются неподвижными на дне флакона, в то время как Lorr летит все равно перемещать свои крылья, голову и ноги. Мухи, которые проявляют Lorr еще ответить тонкие движения, когда флакон нарушается. Торможение мух определяется подсчет количества мух оставаясь неподвижным после фирмы тар во флакон. Кроме того, прокатка флакона может использоваться для определения того, отдельные мухи еще сохраняют свою захвата рефлекс.

Восстановление: Поведенческая анализ может быть продлен путем измерения восстановление в качестве дополнительного параметра ответа алкоголя. Прекратите воздействие алкоголя и продолжать делать замечания относительно Lorr каждые 5 минут. Продолжить поток увлажненного воздуха через флаконах в периоды восстановления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Финансирование для этого исследования была предоставлена ​​Программы в неврологии премии от штата Флорида Университетского колледжа медицины и поддержке Департамента биологических наук в странах бывшего Советского Союза. Дополнительное финансирование было предоставлено за счет гранта-в-помощь от фонда исследований напитка алкоголя производителя.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol 190 proof Various
Aerator Local pet store We use Whisper 60
Silicone tubing 1/8” VWR 408060-0030
120° Y-connector VWR 82017-256
Quick disconnects VWR 46600-048
Plastic tube clamps Bell-art products 132250000 Either this or next
Miniature air regulator McMaster-Carr 8727K11 Either this or previous
Miniature air regulator mounting bracket McMaster-Carr 9891K66
Gilmont size 12 flow meter VWR 29895-242
Tool clips McMaster-Carr 1722A43 To hold flow meters
Vial VWR 89092-722
Rubber stopper with two holes VWR 59585-186 Fits in vials
5 mm Pyrex glass tubes Trikinetics PGT5x65 Fits best in previous stopper
Teflon tape Hardware store To achieve snug fit in stoppers if necessary
Rubber stopper with two holes VWR 59582-122 Fits our bottles
Disposable glass pipets VWR 53283-768 Cut to length and bend by heating
Very fine nylon netting VWR Various
15 watt bulbs Hardware store Overhead red light
Photographic red safe light filters Overhead red light
Mini flashlights with red filters Mag-light

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
  2. Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
  3. Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
  4. Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
  5. Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
  6. Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
  7. Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
  8. Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
  9. Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
  10. Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
  11. Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
  12. Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
  13. Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
  14. Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
  15. Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
  16. Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
  17. Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
  18. Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
  19. Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
  20. Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
  21. Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
  22. Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
  23. Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
  24. Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
  25. Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
  26. Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
  27. Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
  28. Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
  29. Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. Deaths: Final data for 2007. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention: National Center for Health Statistics. (2010).
  30. The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , Columbia University. (2009).
  31. NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , Available from: www.medtext.com/hdcn.htm (1992).
  32. Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
  33. Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
  34. Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
  35. Boothroyd, C. E., Young, M. W. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. Pfaff, D. W., Kieffer, B. 1129, Blackwell Publishing. 350-357 (2008).
  36. Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
  37. Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
  38. Cohan, F. M., Graf, J. -D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
  39. Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
  40. Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
  41. Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
  42. Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
  43. Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).

Tags

Неврология выпуск 87 неврологии чувствительность алкоголь, Суточный седативный биологические ритмы студентов исследования
Flybar: Администрирование Алкоголь в мух
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Linde, K., Fumagalli, E.,… More

van der Linde, K., Fumagalli, E., Roman, G., Lyons, L. C. The FlyBar: Administering Alcohol to Flies. J. Vis. Exp. (87), e50442, doi:10.3791/50442 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter