Summary
Drosophila ha surgido como un sistema modelo significativo para la disección de las bases celulares y moleculares de las respuestas de comportamiento al alcohol. Aquí se presenta un protocolo para la recogida de datos de sensibilidad de alcohol en un contexto circadiano que se puede aplicar fácilmente a otros experimentos y es muy adecuado para la investigación de pregrado.
Abstract
Moscas de la fruta (Drosophila melanogaster) son un modelo establecido para la investigación del alcohol y de la biología circadiana. Recientemente, se demostró que el reloj circadiano modula la sensibilidad al alcohol, pero no la formación de la tolerancia. Aquí se describe el protocolo en detalle. El alcohol se administró a las moscas usando la barra estabilizadora. En esta configuración, el vapor de alcohol saturado que se mezcla con aire humidificado en proporciones fijas, y se administró a las moscas en cuatro tubos de forma simultánea. Las moscas se crían en condiciones estandarizadas con el fin de minimizar la variación entre las repeticiones. Tres días de edad moscas de diferentes genotipos o tratamientos se utilizan para los experimentos, de preferencia, haciendo coincidir las moscas de dos puntos diferentes de tiempo (por ejemplo, CT 5 y CT 17) hacer comparaciones directas posible. Durante el experimento, las moscas están expuestos durante 1 hora con el porcentaje predeterminado de vapor de alcohol y el número de moscas que exhiben la pérdida del reflejo de enderezamiento (Lorr) o sedción se contabilizan cada 5 min. Los datos se pueden analizar usando tres enfoques estadísticos diferentes. La primera consiste en determinar el momento en el que el 50% de las moscas han perdido su reflejo de enderezamiento y utilizar un análisis de la varianza (ANOVA) para determinar si existen diferencias significativas entre los momentos. La segunda es determinar las moscas porcentuales que muestran Lorr después de un número especificado de minutos, seguido de un análisis de ANOVA. El último método es el de analizar la serie entera veces utilizando estadística multivariante. El protocolo también se puede utilizar para experimentos no circadianos o comparaciones entre los genotipos.
Introduction
Drosophila melanogaster demuestran las respuestas conductuales bifásicos al alcohol 1 que son análogas a las respuestas humanas a este fármaco 2,3. Tras la exposición inicial a bajas concentraciones de alcohol, moscas exhiben mayor actividad locomotriz, sustituida por una falta de coordinación motora, la pérdida del control postural y corregir reflejos (pérdida del reflejo: Lorr) y sedación (falta completa de la actividad motora en respuesta a la estimulación mecánica) como la exposición al alcohol progresa 4-9. El reloj circadiano endógeno es un fuerte modulador de la sensibilidad al alcohol y la toxicidad como se ha observado en ratones, ratas 10,11 12, y los seres humanos 13. Los recientes avances en la investigación de Drosophila han demostrado que el reloj circadiano modula la sensibilidad de alcohol aguda, pero no alcohol tolerancia 1. Los poderosos enfoques genéticos disponibles en Drosophila mutantes a través de estudios y manipulaciones transgénicas de espacialy temporal de la expresión génica proporciona un sistema que permite un rápido avance en la identificación de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a los comportamientos complejos. El uso de Drosophila como herramienta de investigación ha permitido avances sustanciales en la comprensión de la neurobiología del alcohol que se pueden traducir rápidamente a los mamíferos 14-16. Con el fin de facilitar la comprensión de los mecanismos moleculares a través de la que el reloj circadiano modula la sensibilidad al alcohol y para medir de manera uniforme las respuestas de comportamiento a través de puntos de tiempo circadianos, un protocolo de administración de alcohol adecuada para su uso en condiciones de luz roja tenue se requiere. Para Drosophila, el alcohol puede ser administrado a través de la suplementación de alimentos para la exposición crónica o de forma fiable a través de la administración de alcohol en forma de vapor para las exposiciones agudas. Aquí se describe un protocolo de administración de alcohol adecuado para la evaluación de la modulación circadiana de la pérdida de los reflejos de recuperación (Lorr) 1, así comosedación.
Las moscas son arrastradas con 12 hr: 12 hr LD ciclos a temperatura constante y luego transferidos a un régimen de luz controlada durante 2-5 días, dependiendo de la pregunta experimental. Las moscas se expusieron a vapor de etanol en un dispositivo conocido como la barra estabilizadora. En este dispositivo, cantidades controladas de aire se burbujeado a través de agua y alcohol; los vapores se mezclan entonces y se dirigen en una carcasa vial de las moscas. Cada 5 minutos, las moscas se califican para el número que no puede mostrar corregir reflejos o se han convertido en sedado. LORR porcentajes para cada punto de tiempo se calculan y se comparan entre puntos de tiempo circadianos o entre cepas de moscas. La simplicidad y la confiabilidad de la entrega de alcohol mediante el suministro de alcohol Flybar combinado con opciones de análisis de comportamiento proporciona un beneficio significativo para los experimentos circadianos realizados en condiciones oscuras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montaje de la barra estabilizadora
Justificación y visión: El sistema está diseñado para administrar porcentajes controladas de vapor de alcohol a las moscas. Nota: La figura 1 presenta una visión esquemática de la barra estabilizadora puesta a punto, como se describe a continuación en tres etapas (montaje del flujo de aire, la configuración del alcohol y las botellas de agua, y el montaje de los viales de observación). En definitiva, un flujo de aire constante se divide en dos fracciones que se burbujea a través de alcohol y agua, respectivamente, se mezclan, y se administró a 4 viales de observación.
- Asamblea de la circulación de aire
- Conecte un pedazo corto de tubo de silicona flexible, ya sea la construcción de aire o un aireador de acuario para generar un flujo de aire constante y división usando conectores y. Conecte la primera rama en el regulador de caudal de aire que controla la cantidad total de aire a través del sistema (normalmente 1.000 ml / min durante 4 viales de observación).
- Inserte un conector rápido en el segundo tubode manera que la corriente de aire se puede interrumpir en el comienzo del experimento sin afectar el flujo de aire calibrado. Añadir un conector en Y y conecte cada tubo de ramificación al regulador de flujo de aire.
- Conecte la tubería a los reguladores de flujo de aire y luego conectar dos metros de flujo de aire.
- Puesta en marcha de las botellas de alcohol y agua
- Añadir tubo flexible a la salida de los medidores de flujo de aire e insertar un tubo delgado de vidrio (secciones de 1 ml pipetas de vidrio) con una curva de 90 ° en el extremo de cada tramo de tubo. Esto servirá como el flujo de aire de entrada en las botellas de agua y alcohol.
- Coloque tapones de goma con 2 orificios a través de ellos en las botellas llenas con alcohol y agua. Mantenga ambas botellas a una temperatura de 2 º C constante superior a la temperatura del aire ambiente utilizando un baño de agua. En nuestros experimentos, la habitación del medio ambiente se mantiene a 25 ° C, mientras que el baño de agua es a 27 ° C.
- Inserte la pipeta de vidrio directamente a la unaIR entrada a través del tapón de goma y se extienden en el líquido hasta aproximadamente 1 cm de la parte inferior de la botella.
- Insertar una sección del codo de pipeta de vidrio en el orificio restante en el tapón de goma hasta el final del vidrio es al ras con la parte inferior del tapón dentro de la botella. Inserte esta salida de aire en otro tramo de tubería.
- Reúne a las corrientes de aire usando conectores y y utilizar otra longitud de tubo de silicona para dirigir el flujo de aire a través de un frasco de mezcla vacío o botella con secciones de pipeta de vidrio dobladas insertados a través de un tapón de goma de dos agujeros. Utilice otro trozo de tubo de silicona para la corriente de aire de salida mixta.
- Asamblea de la Observación Vial
- Dividir la corriente de aire de salida que emerge de la mezcla matraz de 2-3x para obtener 4 o 8 corrientes más pequeñas de aire de modo que múltiples viales de observación pueden ser utilizados en cada experimento. Conecte el tubo de silicona flexible para los viales de observación.
- Configure el observatien viales usando viales vacíos sellados con un tapón de caucho que contiene dos agujeros a través de tubos de vidrio que proporcionan una entrada y una salida para el vapor de alcohol.
- Cubra el extremo del primer tubo de vidrio con una red y mantener la malla en su lugar con un pequeño trozo de tubo de plástico flexible. Inserte este tubo a través del primer agujero hasta que se extiende a aproximadamente la mitad de la longitud del vial. Si es necesario, use cinta de teflón para obtener un ajuste perfecto.
- Inserte el segundo tubo de vidrio también con el final cubierto por la compensación hasta que esté alineada con el borde interior del tapón de goma.
- Colocar los viales en posición horizontal sobre un trozo de papel blanco para maximizar el contraste con las moscas en condiciones de luz roja tenue.
- Mezcle fracciones apropiadas de la corriente de aire burbujeado a través de alcohol y la corriente de aire burbujeado a través del agua. Vigilar la presión de aire de forma continua y hacer los ajustes necesarios para mantener la mezcla deseada de las corrientes de aire.
Nota: El funcionamiento continuode varios ensayos Fly Bar en paralelo o incluso un solo ensayo en una habitación pequeña puede conducir a una acumulación apreciable de vapor de alcohol. Para evitar la liberación continua de vapor de alcohol que pueden potencialmente afectar el investigador en una habitación cerrada, un sistema adecuado debe ser puesto en el lugar que elimina adecuadamente vapor de alcohol generado durante el experimento. Para eliminar vapores de alcohol, conectar una pieza 6-12 pulgadas de tubo sobre el segundo tubo de vidrio que sobresale de cada vial, unirlos y dirigir a un sistema de embudo de vacío. Los investigadores también deben asegurarse de que la sala de pruebas experimental suficiente ventilación.
2. Preparación de los animales de experimentación
Justificación y visión general: la cultura adecuada y vivienda de las moscas serán reducir la variabilidad en los datos. Esto se logra a través de la estandarización y la minimización del estrés experimentado por las moscas. Por esa razón, sin anestesia (CO 2 o alternativas) se utiliza During cualquiera de las siguientes etapas del protocolo. Por otra parte, las moscas deben ser emparejados por edad a través de experimentos y puntos temporales para minimizar la variabilidad como es la norma para otros análisis del comportamiento, incluyendo el aprendizaje y la memoria experimentos 17.
Diversa luz: condiciones de oscuridad se pueden usar para sondear la función del reloj circadiano en la respuesta de comportamiento a etanol. Para determinar si existe un ritmo diurno, los experimentos pueden llevarse a cabo bajo un ciclo LD definido para medir el rendimiento en específico Zeitgeber Times (ZT). ZT 0 representa amanecer y se define como el tiempo de luces en virtud de ciclos LD, mientras ZT 12 es las luces de tiempo se apagan con un ciclo LD 12:12 h. Bajo condiciones constantes, el tiempo circadiano (CT) mide el tiempo para el animal en ausencia de señales del medio ambiente, es decir, el tiempo de funcionamiento libre, y se relaciona con el ciclo de arrastre LD anterior. En silvestres de tipo Drosophila, CT refleja la ZT anterior durante los primeros díass en condiciones constantes el período circadiano de funcionamiento libre y ritmos son ~ 24 hr. Para medir la modulación circadiana y eliminar efectos de luz agudas sobre el comportamiento, las moscas son arrastradas a la luz: oscuridad ciclos y luego se transfirieron a condiciones de oscuridad constante (DD) antes de los experimentos. Experimentos circadianos se llevan a cabo en el segundo día de DD para medir el rendimiento en específico circadiano Times (CT).
En Drosophila, luz continua (LL) condiciones dan lugar a la disfunción circadiana con oscilaciones moleculares humedecidas o suprimidos de los genes circadianos básicos y alteración de los ritmos circadianos de comportamiento como lo demuestra la actividad locomotora arrítmica 18-21 y la memoria arrítmica a corto plazo 17. El protocolo se ha optimizado para estudios circadianos y se puede simplificar para otros experimentos. Todos los experimentos se llevan a cabo utilizando circadianos tenue luz roja (luz roja sobrecarga ambiente <1 lux en el banco superior, pequeñas luces de color rojo utilizado a los 12 centímetros de tubos~ 1 lux de luz).
- Traseras de las moscas a 25 ° C bajo 12:12 h luz: Condiciones de arrastre oscuros (LD).
- Recoger las moscas recién eclosed al final del período de luz del día en el día 1 y almacenarlos durante 24 horas en condiciones de LD en la celebración de los viales que contienen una pequeña cantidad de alimentos altos de concentración de agar para minimizar la adherencia de los alimentos. Nota: Para garantizar moscas sanas, normalmente desarrolladas se recogen, sólo utilizar moscas recogidas en los primeros días después de la eclosión comienza en un frasco de cultivo.
- Recoger lotes de aproximadamente 30 (25-35) moscas utilizando un aspirador en el día 2 hacia el final del período de luz, y la transferencia a viales de retención frescas.
- Utilice una fuente de luz potente para dirigir las moscas hacia el fondo del vial. Dentro de este rango, el número exacto de moscas en cada vial no es crítica como observaciones de comportamiento se presentan en porcentajes con el número total de moscas contadas al final de cada experimento.
- Mantener moscas en condiciones DD a 25 ° C FOr dos días.
- En el día del experimento, colocar todas las moscas alojados en diferentes condiciones o incubadoras distintas de la sala de comportamiento experimental en la habitación durante al menos 1 h antes del experimento. Aclimatación reduce la variabilidad debido a los cambios de temperatura o humedad.
- Hacer observaciones a los seis puntos de tiempo de un día (CT 1, 5, 9, 13, 17 y 21) con el fin de probar para la modulación del comportamiento circadiano.
- Comparar múltiples puntos de tiempo dentro de un único conjunto de experimentos de comportamiento para aumentar la robustez del diseño experimental y minimizar la variabilidad específica a un solo experimento. Por ejemplo, las observaciones de la TC 1 y TC 13 se pueden obtener de forma simultánea si dos incubadoras con los horarios de luz-oscuridad opuestos se utilizan para el arrastre.
Nota: El procedimiento anterior describe la preparación de los animales experimentales para los ensayos realizados en condiciones circadiano de oscuridad constante. Diversa luz: condiciones de oscuridad se pueden usar para sondear la función del relojen las respuestas de comportamiento a alcohol. Para determinar si existe un ritmo diurno de los experimentos pueden llevarse a cabo en virtud de un ciclo de LD para medir el rendimiento en específico Zeitgeber Times (ZT). Además, el protocolo puede ser utilizado con moscas criados en condiciones de luz constantes para las pruebas de experimentos disfunción circadiano. Para los protocolos alternativos que ponen a prueba las moscas alojados en condiciones de luz, ensayos de comportamiento aún deben realizarse en condiciones de oscuridad. Las moscas deben ser transferidos a la oscuridad durante 1 hora antes de la prueba para minimizar la variabilidad del comportamiento debido a los efectos agudos de la luz sobre el comportamiento.
3. Observaciones del Comportamiento
Justificación y visión: El siguiente protocolo de administración de alcohol se ha optimizado para las observaciones bajo condiciones tenue luz roja. El Lorr dos medidas de comportamiento y sedación representan dos puntos distintos de embriaguez mosca. Lorr representa un punto tardío de embriaguez que incorpora la pérdida of motor y el control postural, mientras que las medidas de sedación un punto final muy tardía de la intoxicación. Genotipo o modulación circadiana pueden afectar a estas dos medidas en forma diferente; por lo tanto, se puede desear examinar tanto. En resumen, las moscas se cargan en los viales, el número de moscas que muestran LORR o sedación se anotó cada 5 min durante la exposición al vapor de alcohol, y el número total de moscas contadas al final del experimento.
- Antes de iniciar el experimento, ejecute el aire a través del sistema (aire burbujeó a través de botellas de agua y alcohol) durante al menos 10 min y utilizar ese tiempo para calibrar los flujos de aire.
- Desconecte la liberación rápida para detener el flujo de aire. Cargue las moscas en los viales, y vuelva a conectar el flujo de aire e iniciar los temporizadores. Nota: Si las moscas que no responden o moscas muertas se quedan en los viales de retención, esto podría ser indicativo de las condiciones de estrés. En general, estas condiciones se pueden aliviar por la vivienda menos moscas en los viales que sostienen o la disminución de la pegajosidad de alimentos utilizando una ligeraly una concentración más alta de agar durante la preparación de alimentos. Para los análisis de comportamiento óptimo y mínima variabilidad entre los experimentos, las moscas deben estar sanos antes de los experimentos.
- Para el tiempo exacto, use un temporizador para realizar un seguimiento del tiempo total de la exposición al alcohol y el uso de un segundo temporizador de cuenta hacia atrás para marcar los intervalos de 5 minutos.
- Coloque un pedazo de papel blanco bajo los viales para aumentar el contraste y la visibilidad volar, especialmente en condiciones de luz roja tenue.
- Compruebe el flujo de aire con regularidad durante un experimento para mantener niveles constantes. Generalmente, una vez que los flujos de aire se han estabilizado, que permanecen estables durante la duración del experimento.
- Cuente el número de moscas que han perdido su reflejo corregir una vez cada 5 minutos durante un periodo de 1 hora. Como la sensibilidad de alcohol varía entre los genotipos y las bases genéticas, puede ser deseable para llevar a cabo evaluaciones más frecuentes o para llevar a cabo el experimento durante un período de tiempo más largo.
- Levante la slightl vialy de la superficie, y dirigir la luz de una linterna de luz roja hacia el papel detrás del vial. Mantenga las linternas rojas de mano a una distancia de al menos 12 pulgadas al vial experimental para mantener los niveles de luz no mayores de 1 lux para todos los experimentos en condiciones de luz roja tenue.
- Medir los niveles de luz usando un medidor de luz para establecer estándares para todos los experimentos.
- Determinar el número de moscas que han perdido su reflejo corregir mediante la aplicación de un grifo firme para el vial y contar cuántas moscas no logran enderezarse dentro de aproximadamente 4 seg. Las moscas que muestran Lorr aún pueden mover sus patas y alas, pero no pueden convertirse en posición vertical.
- Al final de la sesión, contar el número total de moscas en cada vial.
Nota: En ocasiones, una sola mosca puede quedar atrapado entre el tapón y el lado de carga cuando vuela en los viales experimentales. Como esto se hace en la oscuridad, no puede ser observado fácilmente por lo que es necesario contar el total de entumecidoer de moscas en el final del experimento para calcular correctamente porcentajes.
Además, este procedimiento también puede ser usado para medir la sedación de moscas, que representa un criterio de valoración del comportamiento diferente. Mientras las moscas sedados han perdido su reflejo derecha, sedación requiere una mayor exposición al alcohol. En cuanto al comportamiento, la sedación puede ser caracterizado por la falta total de actividad motora evidente con las moscas que queda inmóvil en el vial después de la firma aa grifo al vial. Para la sedación, cuente el número de moscas que permanecen inmóviles sin piernas agitando después de la entrega de un toque firme del vial. Además, el vial se puede enrollar un lado a otro para determinar si las moscas individuales todavía conservan su reflejo de agarrar.
4. Análisis de Datos
- Determinar la LORR porcentaje en cada tiempo de evaluación basado en el número total de moscas en cada vial.
- Estimar las diferencias entre los puntos de tiempo circadiano o cepas de calculating de la LORR 50% para cada muestra, que cae dentro de la porción lineal de la curva sigmoide (Ver Figura 2 a continuación).
- Estadísticas alternativos:
- Si están previstas comparaciones entre los genotipos, es deseable analizar todo el curso de tiempo usando medidas repetidas ANOVAand para determinar el rango de puntos de tiempo que las diferencias son significativas con pruebas post-hoc (Figura 3). Para estas pruebas, se prefiere usar una un valor de 0,001. Esto permite que las diferencias en los tiempos de exposición individuales que deben evaluarse así como las diferencias entre los genotipos en la pendiente de la curva.
- Las diferencias en la sensibilidad para se pueden determinar para tiempos específicos de la exposición al alcohol de una respuesta particular, como la sedación de la porción lineal de la gráfica (Figura 4).
- Las diferencias entre las cepas o los puntos de tiempo circadiano pueden estimarse utilizando estadísticas F estándar y pruebas post-hoc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modulación circadiano de alcohol de sensibilidad usando la LORR 50% como marcador.
Un ejemplo representativo que muestra la modulación circadiano en la sensibilidad de alcohol durante el día se presenta en la Figura 2. LORR se midió a los seis puntos de tiempo durante el 2 º día de DD en Canton-S y el 50% LORR se determinó para cada punto de tiempo. El análisis mostró un efecto significativo de la hora del día (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 por punto). La prueba de LSD de Fisher mostró diferencias significativas entre CT1 vs CT5, CT5 vs CT13, CT17 CT5 vs, CT5 vs CT 21, CT9 vs CT13, CT17 CT9 vs, y CT9 vs CT 21. Este resultado es consistente con los resultados publicados anteriormente 1.
Las diferencias entre los de tipo salvaje y mutante vuela.
El segundo ejemplo se utilizan series de tiempo para mostrar las diferencias en la Lorr y sedación entre los de tipo salvaje Canton-S moscas y flies que llevan una mutación de pérdida de función blanco (w 1118) en el mismo fondo genético (Figura 3). La mutación w 1118 es de particular interés para los investigadores de Drosophila como líneas transgénicas se crean a menudo el uso de estas moscas y muchas líneas mutantes de los genes del reloj circadiano también tienen la mutación w 1118. Los resultados se presentan como una serie de tiempo (Figura 3) con los datos mostrados por cada 5 min durante todo el período de exposición. Las observaciones se limitan a 60 min para evitar los efectos de la rápida acumulación de tolerancia 22-24. Los W 1118 mutantes muestran reducido significativamente la sensibilidad LORR en respuesta al vapor de etanol que hace Canton-S (ANOVA entre los sujetos F 1,10 = 57,12, p <0,001, N = 6). No se encontraron diferencias significación (a = 0,001) en este experimento de 20 minutos a través de 60 min (Figura 3A w 1118 y Canton-S en la tasa de sedación (ANOVA entre los sujetos F 1,10 = 137,301, p <0,001, N = 6). En el ensayo de la sedación, se encontraron diferencias significativas (a = 0,001) en el minuto 50, 55 y 60 (Figura 3B). Además de la falta de pigmentos de cribado en sus ojos, los W 1118 mutantes también han reducido los niveles de serotonina, dopamina e histamina 25,26. Estos cambios en los niveles de aminas biogénicas pueden ser responsables de la alteración de la sensibilidad a etanol en los mutantes W 1,118 27,28. Por lo tanto, el control del nivel de expresión blanco en los genotipos ensayados puede ser esencial para la evaluación precisa de la sensibilidad de etanol.
Modulación circadiana de la sedación.
En el tercer ejemplo, que mide el porcentaje de Canton-S vuela tranquilod después de una cantidad fija de tiempo para determinar si hay un efecto circadiano de alcohol en la sedación (Figura 4). Se comparó el porcentaje de moscas sedado a 40 min (vapor de alcohol 30%) en la TC 5 y 17 años y los resultados muestran que hay un número significativamente menor moscas sedados durante el día en comparación con la exposición al alcohol durante la noche (ANOVA: F 1,20 = 6,21, p = 0,022, N = 10 (CT5) y 12 (CT17)). Las moscas no llegó a la marca de la sedación del 50% en una hora como las observaciones fueron hechas en nuestras condiciones estándar Lorr con el fin de hacer una comparación directa posible. Observaciones más allá de la hora son problemáticos debido a la acumulación de la tolerancia rápida 22-24. En este experimento, menos de 25% de las moscas en cualquiera de los puntos de tiempo circadiano fueron sedados en 40 min, lo que indica que hay una diferencia en la sensibilidad líder sedación borde entre estos grupos. La recopilación de datos en este momento temprano de la sedación es un mó útiliones que existen diferencias, sin embargo, la capacidad de determinar el efecto del tratamiento sobre la forma de la distribución en las respuestas de sedación es limitada. Para determinar si existe diferencia en la distribución completa sedación, una concentración de etanol superior debe ser usado para asegurar una tasa más rápida de la sedación.
Figura 1. La barra estabilizadora para medir la sensibilidad de alcohol y la sedación en las moscas de la fruta.
.. Figura 2 ejemplo representativo que muestra la modulación circadiano significativa en la sensibilidad de alcohol durante el día (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0.001, N = 6-10 por punto de tiempo; diferencias significativas entre CT5 vs CT1, CT13, CT17, CT21 y CT13 y CT9 vs, CT17, CT21 y).
Figura 3. Efectos del alcohol en las respuestas conductuales son significativamente diferentes entre los de tipo salvaje Canton-S se adorna y los blancos 1.118 moscas mutantes con pérdida de función. A) Canton-S moscas muestran significativamente mayor sensibilidad al alcohol, medida por Lorr comparación con moscas con el mismo fondo genético que porta la mutación blanca (ANOVA entre los sujetos F 1,10 = 57,12, p <0,001, N = 6). B) Canton-S moscas son más susceptibles a la sedación alcohol que w 1118 mutantes (ANOVA entre los sujetos F 1,10 = 137,301, p <0,001, N = 6). *p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
. Figura 4 Los datos representativos que comparan el porcentaje de Canton-S moscas sedado a 40 min entre TC 5 y TC 17 de tipo salvaje moscas demuestran incrementos significativamente mayores en la sedación inicial de CT 17 en comparación con CT 5 (ANOVA:. F 1,20 = 6,21, p = 0,022, N = 10 (CT5) y 12 (CT17)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los costos del abuso de alcohol y alcoholismo para la sociedad es enorme, tanto en términos de costos humanos y económicos 29 30,31. Drosophila como modelo ofrece un sistema rápido y versátil de examinar rápidamente las respuestas de comportamiento de un gran número de personas y, como tal, se ha utilizado ampliamente para tanto el alcohol 5,7,32-34 y la investigación circadiano 35-37.
Aquí, describimos un protocolo sencillo para la administración controlada de vapor de alcohol para las moscas adultas en condiciones circadianos.
Las moscas cultivadas en condiciones normalizadas están expuestos a vapor de alcohol durante 1 hora durante la cual el número de las moscas que han perdido su reflejo de enderezamiento se anotó cada 5 min. El protocolo se describe en el presente documento está optimizado para los experimentos circadianos debido a los requisitos adicionales para el arrastre y la vivienda en condiciones constantes. Varios pasos pueden ser simplificacióned para estudios genéricos mediante la eliminación de esos pasos que son esenciales para los experimentos circadianos, como el almacenamiento en la oscuridad durante al menos un día o hacer los experimentos en condiciones de luz roja tenue. Este protocolo también se puede usar para exponer gran número de moscas en una manera controlada a diferentes concentraciones de alcohol para análisis bioquímicos o moleculares subsiguientes. Para mantener la coherencia con otros experimentos de comportamiento de Drosophila como el aprendizaje y observaciones de la memoria, la medición de las respuestas de comportamiento en las condiciones de luz roja tenue se desee, incluso para los experimentos no circadianos.
La variación entre repeticiones independientes del experimento puede ocultar pequeñas diferencias entre los mutantes o cepas transgénicas o entre momentos circadianos. Por lo tanto, se recomienda a las muestras de ensayo de múltiples cepas o los puntos de tiempo circadianos simultáneamente (ver los ejemplos) de manera que 'réplica' puede ser añadido como una variable aleatoria con el fin de eliminar laefecto de la variación entre réplicas.
Sensibilidad al alcohol varía entre cepas. Porcentajes de alcohol (el porcentaje de flujo de aire que burbujea a través del alcohol) deben ajustarse en consecuencia. Como se ve en la Figura 3, las moscas que llevan la mutación blanco son menos susceptibles a los efectos de la exposición al alcohol que de tipo salvaje Canton-S vuela. Para el análisis de las líneas que llevan la mutación blanco, puede ser deseable para aumentar el porcentaje de alcohol para que las moscas están expuestos con el fin de realizar el ensayo de comportamiento en el mismo marco de tiempo de otros experimentos como exposición más larga al alcohol puede resultar en tolerancia rápida desarrollo. Para los mutantes extremadamente sensibles y para los experimentos en los que es necesario disminuir el porcentaje de alcohol utilizado, tal como se observa para las moscas que contienen una mutación en el gen de color amarillo, el flujo de aire puede tener que aumentarse para calibrar el flujo de aire alcohol saturado con precisión. Pequeños aumentos o diciembreREases (± 10%) en el flujo de aire total (valor del flujo de aire funcional de 900-1.100 ml / min durante 4 viales de observación) no parecen afectar negativamente a las moscas.
Las observaciones más allá de 1 hora deben evitarse cuando sea posible debido a la posibilidad de una rápida acumulación de tolerancia en las moscas de 22-24 que afecta la sensibilidad de alcohol. En lugar de ello, determinar el porcentaje de alcohol para cada cepa que resulta en un aproximado de 50% LORR por 30-40 minutos. Si se requiere la comparación de múltiples cepas independientes, elegir un solo porcentaje de alcohol que funcione para todas las cepas.
Este protocolo depende en gran medida de observaciones de comportamiento, por lo que el cumplimiento estricto de un protocolo estandarizado es esencial para evitar la deriva de observaciones de comportamiento a través del tiempo. Si es posible, observaciones conductuales deben realizarse de manera que el observador es ciega hasta el punto de genotipo o el tiempo se está probando. Con el fin de detectar el sesgo potencial sobre la base de estos y otros factores desconocidos,es aconsejable examinar los datos sobre un curso de tiempo y para verificar que las observaciones se mantienen dentro de la misma gama largo de la serie experimental.
El flybar set-up proporciona ciertas ventajas sobre otros métodos de administración de alcohol para las moscas, en especial para los investigadores universitarios o estudios circadianos sobre los efectos negativos de etanol. Un dispositivo alternativo para medir el efecto del alcohol en el control del motor en las moscas es la inebriometer, una columna vertical en el que vapor de etanol se hace circular a través de aumento de los deflectores y la pérdida de control de la postura o la sensibilidad de la marcha se puede medir mediante la determinación del tiempo que tarda a caer a la parte inferior de la columna de 38,39. El inebriometer proporciona una lectura automatizada de control de la pérdida-de-postural y ha demostrado ser valioso para la investigación de alcohol en Drosophila 9,22,39,40, pero este paradigma de comportamiento requiere un equipo relativamente caro, el espacio para el aparato, y el tiempo para calibrary optimizar las condiciones. Así, el inebriometer puede no ser adecuado para muchos laboratorios docentes de pregrado con presupuestos limitados o espacio, o para los investigadores que realizan ensayos circadianos. Otro método de entrega del alcohol a las moscas y la medición de la sedación consiste en colocar una pequeña cantidad de alcohol líquido sobre un material absorbente, ya sea en la parte superior o en la parte inferior de un vial y a continuación, permitiendo que el alcohol se evapore con el tiempo 41,42. Como aumenta la concentración de vapor de alcohol con el tiempo, las respuestas de comportamiento pueden ser evaluados. Si bien este método de entrega es fácil de configurar, la cantidad de vapor de alcohol a la que las moscas están expuestos varía con el tiempo y las condiciones. Para preguntas experimentales en los que se evalúan las diferencias en las tasas iniciales de sensibilidad o sedación, tales como la modulación circadiano, es deseable tener un nivel constante de vapor de alcohol entregado a las moscas. Además, la exposición de un gran número de moscas a una cantidad constante de exposur de alcoholE, tal como se realiza con la barra estabilizadora, es deseable para la precisión de ensayos celulares o bioquímicos aguas abajo. Otro método de entrega de alcohol a las moscas comunes en las primeras investigaciones alcohol Drosophila involucrado mezclar el alcohol en la comida, ya que estaba preparado. Si bien este método es fácil y requiere poca configuración, que es el más adecuado-para la exposición crónica de alcohol en días como la concentración de alcohol cambios con el tiempo.
Métodos más sofisticados y automatizados también están disponibles para evaluar las respuestas del aparato locomotor de moscas de la exposición al alcohol incluyendo la grabación de la actividad de video y software de análisis de imágenes 7,43. Estos son particularmente poderosa para la evaluación de los efectos positivos hiper-activación de etanol. Sin embargo, estos métodos automatizados pueden ser prohibitivamente caros para proyectos de investigación universitarios o laboratorios de enseñanza y no pueden ser diseñados de forma óptima para el análisis de un gran número de moscas bajo condiciones circadianociones (por ejemplo, captura de vídeo en condiciones de oscuridad requiere equilibrada y difusa iluminación infrarroja y cámaras infrarrojas sensibles). Creemos que la barra estabilizadora proporciona un set-up, método rentable fácil para sistema de entrega de alcohol y la evaluación de las respuestas de comportamiento al alcohol que se adapta bien a una variedad de condiciones y diseños de laboratorio.
MODIFICACIONES AL PROTOCOLO:
El protocolo descrito más arriba está dirigido a examinar el efecto de la exposición al alcohol en la pérdida de Righting-Reflex en un contexto circadiano. Sin embargo, el protocolo se puede modificar fácilmente para adaptarse a otros tipos de experimentos de alcohol.
El examen de la respuesta al alcohol de menos de 12 h-12 h de luz-oscuridad (LD; Zeitgeber Tiempo) Condiciones: Mantener las moscas menos de 12 horas: 12 ciclo LD hr hasta el experimento. Transfiera las moscas a la oscuridad, aproximadamente 1 hora antes de que el experimento llevado a cabo durante la fase de luz (ZT 1, 5, Y 9) del día. Esto asegurará que el efecto agudo de la luz no está confundiendo a los resultados.
El examen de la respuesta al alcohol, en condiciones de luz constantes: las moscas de cultivo bajo condiciones de luz constantes como resultado la interrupción de su reloj circadiano 18-21 y respuestas arrítmicos a la exposición al alcohol 1. Las moscas pueden ser transferidos a la oscuridad aproximadamente 1 hora antes del experimento de modo que las moscas se ponen a prueba en las mismas condiciones como moscas mantenidas en LD o condiciones DD.
Sedación: Las moscas que están sedados pueden separarse de Lorr vuela porque las moscas permanecen inmóviles en el fondo del frasco, mientras Lorr vuela seguirá mover sus alas, cabeza y piernas. Moscas que exhiben Lorr todavía responde con movimientos sutiles cuando se perturba el vial. Sedación de moscas se determina por el recuento del número de moscas inmóvil que queda después de una firma TAp para el vial. Además, la rodadura del vial se puede utilizar para determinar si las moscas individuales todavía conservan su reflejo de agarrar.
Recuperación: El ensayo de comportamiento se puede ampliar mediante la medición de la recuperación como un parámetro adicional de la respuesta de alcohol. Suspenda la exposición al alcohol y continuar haciendo observaciones con respecto a la Lorr cada 5 minutos. Continuar el flujo de aire humidificado a través de los viales durante los períodos de recuperación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
El financiamiento para esta investigación fue proporcionado por el Programa de Premio de Neurociencia de la Universidad de Florida State College de Medicina y el apoyo del Departamento de Ciencias Biológicas de la FSU. Financiación adicional fue proporcionado por una subvención-en-Ayudas del Fondo de Investigación del Alcohol Beverage Fabricante.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y-connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature air regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature air regulator mounting bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. Deaths: Final data for 2007. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention: National Center for Health Statistics. (2010).
- The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , Columbia University. (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , Available from: www.medtext.com/hdcn.htm (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. Pfaff, D. W., Kieffer, B. 1129, Blackwell Publishing. 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
