Summary
Drosophila har vuxit fram som en betydande modellsystem för att dissekera de cellulära och molekylära grunderna för beteendemässiga reaktioner på alkohol. Här presenterar vi ett protokoll för insamling av alkohol känslighetsdata i en dygnsrytm sammanhang som enkelt kan tillämpas på andra experiment och är väl lämpad för grundutbildningen forskning.
Abstract
Fruktflugor (Drosophila melanogaster) är en etablerad modell för både alkohol forskning och dygnsrytm biologi. Nyligen visade vi att den dygnsrytm klocka modulerar alkoholkänslighet, men inte bildandet av tolerans. Här beskriver vi våra protokoll i detalj. Alkohol administreras till flugorna använder Flybar. Med den här inställningen är mättad alkoholånga blandad med fuktad luft i bestämda proportioner, och administreras till flugorna i fyra rör samtidigt. Flugor föds upp under standardiserade förhållanden för att minimera variation mellan replikat. Tre dagar gamla flugor av olika genotyper eller behandlingar används för experimenten, företrädesvis genom att matcha flugor av två olika tidpunkter (t.ex. CT-5-och CT-17) gör en direkt jämförelse möjlig. Under experimentet är flugor utsatta i 1 timme till den förutbestämd andel av alkoholånga och antalet flugor som uppvisar förlust av upprätningsreflex (LORR) eller sedation mäts varje 5 min. Data kan analyseras med användning av tre olika statistiska metoder. Den första är att bestämma den tid vid vilken 50% av flugorna har förlorat sin rätande reflex och använda en analys av variansen (ANOVA) för att avgöra om det finns betydande skillnader mellan tidpunkter. Den andra är att fastställa de procentuella flugor som visar LORR efter ett visst antal minuter, följt av en ANOVA-analys. Den sista metoden är att analysera hela tider serien med hjälp av multivariat statistik. Protokollet kan också användas för icke-dygnsrytm experiment eller jämförelser mellan genotyper.
Introduction
Drosophila melanogaster visar bifasisk beteendemässiga reaktioner på alkohol 1 som är analoga med mänskliga reaktioner på denna drog 2,3. Vid första exponering för låga koncentrationer av alkohol, flugor uppvisar ökad rörelseaktivitet, ersatts av en bristande samordning motor, förlust av postural kontroll och rätande reflexer (Förlust av upprätningsreflex: LORR), och sedering (total brist på motorisk aktivitet som svar mekanisk stimulering) som exponering för alkohol skrider 4-9. Den endogena dygnsrytm klocka är en stark modulator av alkoholkänslighet och toxicitet som observerats hos möss 10,11, råttor 12, och människor 13. Senaste framstegen inom Drosophila forskning har visat den dygnsrytm klocka modulerar akut alkoholkänslighet men inte alkoholtolerans 1. De kraftfulla genetiska metoder som finns i Drosophila genom mutant studier och transgena manipulationer av rumsligaoch tidsmässiga genuttryck ger ett system som gör att snabba framsteg i att identifiera de bakomliggande cellulära och molekylära mekanismer för komplexa beteenden. Användningen av Drosophila som en undersökande verktyg har möjliggjort väsentliga framsteg i att förstå alkohol neurobiologi som snabbt kan översättas till däggdjur 14-16. För att underlätta förståelsen av de molekylära mekanismer genom vilka den dygnsrytm klocka modulerar alkoholkänslighet och jämnt mäta beteendemässiga reaktioner över dygnsrytm tidpunkter, en alkoholadministrationsprotokoll som lämpar sig för användning i svagt rött ljus krävs. För Drosophila, kan alkohol ges via mat tillskott för kronisk exponering eller tillförlitligt genom att administrera alkohol i form av ånga för akut exponering. Här beskriver vi en alkoholadministrationsprotokoll som lämpar sig för bedömning av dygnsrytm modulering av förlust-av-upprätningsreflex (LORR) 1 samtsedering.
Flugor medföres med 12 tim: 12 tim LD cykler vid konstant temperatur och sedan överföras till en kontrollerad ljus ordning för 2-5 dagar beroende på den experimentella frågan. Flugor utsätts för etanolånga i en anordning känd som Flybar. I denna anordning är kontrollerade mängder luft bubblas genom vatten och alkohol; ångorna blandas sedan och riktas in i en ampull hölje flugor. Varje 5 min flugorna poängsätts för det antal som misslyckas med att visa rätande reflexer eller har blivit drogad. LORR procentsatser för varje tidpunkt beräknas och jämförs bland dygnsrytm tidpunkter eller mellan stammar av flugor. Enkelheten och tillförlitligheten i alkoholleverans med hjälp av Flybar alkohol leverans i kombination med beteendeanalysalternativ ger en signifikant fördel för dygnsrytm experiment som utförts under mörka förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montering av Flybar
Motivering och översikt: Systemet är utformat för att administrera kontrollerade procentsatser av alkoholånga till flugor. Anmärkning: Figur 1 ger en schematisk översikt av Flybar uppställning som beskrivs nedan i tre stadier (monterings av luftflödet, set-up av alkoholen och vattenflaskor, och montering av de observations vialer). Kort sagt, är en stadig luftflöde upp i två fraktioner som bubblas genom alkohol och vatten, respektive, blandade, och administreras till 4 observations flaskor.
- Montering av luftflödet
- Anslut en kort bit av flexibel silikon slang till antingen bygga luft eller ett akvarium luftaren för att generera en konsekvent luftflöde och delade med hjälp av en y-kontakt. Anslut den första grenen till luftflödesregulator som styr den totala mängden av luft genom systemet (typiskt 1000 ml / min under 4 observations flaskor).
- Sätt i en snabbkoppling i det andra röretså att luftströmmen kan avbrytas vid början av experimentet utan att påverka den kalibrerade luftflödet. Lägg till en y-kontakt och anslut varje grenröret till luftflödesregulator.
- Anslut slangen till luftflödesregulatorer och anslut sedan två luftflödes meter.
- Set-up av alkohol och vattenflaskor
- Lägg slangar till utgången av luftflödet mätare och sätt in ett tunt glasrör (avsnitt 1 ml glaspipetter) med en 90 ° böj i slutet av varje längd av slang. Detta kommer att fungera som inloppsluftströmmen in i vatten-och alkoholflaskor.
- Placera gummiproppar med två hål genom dem i flaskorna fyllda med alkohol och vatten. Håll båda flaskorna vid en konstant temperatur 2 ° C högre än den omgivande luftens temperatur med användning av ett vattenbad. I våra experiment är miljö rum hållet vid 25 ° C, medan vattenbadet är 27 ° C.
- Sätt i rak glaspipett för enir inlopp genom gummiproppen och sträcker sig in i vätskan tills ca 1 cm från botten av flaskan.
- Sätt i en armbåge sektion av glaspipett in det resterande hålet i gummiproppen till slutet av glaset är i jämnhöjd med botten av proppen inuti flaskan. Sätt denna luftutsläpp i en annan längd på slangen.
- Återförena de luftströmmar med hjälp av en Y-koppling och använda en annan längd av silikonslang för att rikta luftflödet genom ett tomt blandnings kolv eller flaska med böjda glaspipett sektioner insatta genom en två-hålad gummipropp. Använd en annan längd av silikonslang för utloppsblandluftströmmen.
- Montering av observations Vial
- Split utloppsluftströmmen som kommer ut från blandningskolven 2-3x för erhållande av 4 eller 8 mindre luftströmmar så att multipla observations flaskor kan användas i varje experiment. Anslut den flexibla silikonslang till observations flaskor.
- Ställ upp observatipå flaskor som tomma flaskor förslutna med en gummipropp med två hål genom vilka glasrör ger ett inlopp och ett utlopp för alkoholånga.
- Täck över änden av det första glasröret med nät och hålla nät på plats med en liten bit av flexibelt plaströr. Sätt detta rör genom det första hålet tills den sträcker sig till ungefär halva längden av flaskan. Vid behov använder teflontejp för att få bästa passform.
- Sätt i den andra glasrör även med slutet täckt av nät tills den är i jämnhöjd med den inre kanten av gummiproppen.
- Placera rören horisontellt på ett vitt papper för att maximera kontrasten med flugorna vid dåliga röda ljusförhållanden.
- Blanda lämpliga fraktioner av den luftström bubblades genom alkohol och luftströmmen bubblas genom vatten. Övervaka lufttrycket kontinuerligt och göra justeringar som behövs för att upprätthålla önskade blandningen av luftströmmarna.
Obs: kontinuerlig driftav flera Fly Bar analyser parallellt eller till och med en enda analys i ett litet rum kan leda till en märkbar ackumulering av alkoholånga. För att undvika kontinuerlig frisättning av alkoholångor som potentiellt kan påverka forskaren i ett slutet rum, måste införas som ett adekvat sätt tar bort alkoholånga som genereras under experimentet ett lämpligt system. För att ta bort spritångor, ansluta en 6-12 tum slang på den andra glasröret sticker ut från varje flaska, bunta ihop dem och direkt till en tratt-vakuumsystem. Forskare bör också se till att det experimentella undersökningar rummet har god ventilation.
2. Beredning av försöksdjur
Bakgrund och översikt: Korrekt kultur och bostäder av flugorna kommer att minska variationen i data. Detta uppnås genom standardisering och minimering av stress som upplevs av flugorna. Av den anledningen finns ingen anestesi (CO 2 eller alternativ) som används During något av följande steg i protokollet. Vidare bör flugor vara åldersmatchade över experiment och tidpunkter för att minimera variationen som är standard för andra beteendeanalyser, inklusive inlärning och minne experiment 17.
Olika ljus: mörka förhållanden kan användas för att undersöka funktionen av den cirkadiska klockan i beteendegensvar till etanol. För att avgöra om en dygnsrytm existerar, kan experiment utföras under en definierad LD cykel för att mäta prestanda på specifika zeitgeber Times (ZT). ZT 0 representerar gryning och definieras som tiden för lampor på i LD cykler, medan ZT 12 är tids släcks med en 00:12 hr LD cykel. Under konstanta förhållanden, dygnstiden (CT) mäter tid för djuret i avsaknad av miljösignaler, det vill säga fri-gångtid, och är relaterad till den tidigare LD ångan cykel. I vildtyp Drosophila, CT speglar den tidigare ZT för första flera dagar i fasta förhållanden som den fritt rinnande dygnsrytm period och rytmer är ~ 24 tim. För att mäta dygnsrytm modulering och eliminera akuta ljuseffekter på beteende, är flugor fångas till ljus: mörker cykler och överförs sedan till konstant mörker (DD) före experiment. Circadian experiment utförs på den andra dagen av DD för att mäta prestanda på specifika Circadian Times (CT).
I Drosophila, kontinuerligt ljus (LL) förhållanden resulterar i dygnsrytm dysfunktion med dämpade eller avskaffas molekylära svängningar av kärn dygnsrytm gener och störningar i beteende dygnsrytm vilket framgår av arytmier rörelseaktivitet 18-21 och arytmier närminne 17. Protokollet är optimerad för dygnsrytm studier och kan förenklas för andra experiment. Alla dygnsrytm experiment utförs med svagt rött ljus (omgivnings overhead rött ljus <1 lux på bänk, små röda lampor som används vid 12 inches från rören~ 1 lux ljus).
- Bakre flugorna vid 25 ° C enligt 12:12 timmar ljus: mörker urskiljningsförhållanden (LD).
- Samla nyligen eclosed flugor i slutet av dagen-ljus period på dag 1 och lagra dem i 24 timmar i LD förhållanden att hålla flaskor som innehåller en liten mängd av hög agarkoncentration mat för att minska livsmedels klibbighet. OBS: För att säkerställa friska, normalt utvecklade flugor samlas, bara använda flugor som samlats in under de första dagarna efter eclosion börjar i en odlingsflaska.
- Samla partier av ca 30 (25-35) flyger med hjälp av en sug på dag 2 mot slutet av ljusperioden, och överföring till nya håll flaskor.
- Använd en stark ljuskälla för att rikta flugor till den bortre änden av flaskan. Inom detta intervall är inte kritiskt det exakta antalet flugor i varje flaska som beteendeobservationer rapporteras i procenttal med totala antalet flugor räknades vid slutet av varje experiment.
- Behåll flugor enligt DD förhållanden vid 25 ° C for två dagar.
- På dagen för experimentet, placera alla flugor inrymt i olika förhållanden eller andra än den experimentella beteendet rum i rummet i minst 1 timme före experimentet inkubatorer. Acklimatisering minskar variationen på grund av förändringar i temperatur eller luftfuktighet.
- Gör observationer vid sex tidpunkter per dag (CT 1, 5, 9, 13, 17 och 21) för att testa om dygnsrytm modulering av beteendet.
- Jämför flera tidpunkter inom en enda uppsättning beteendemässiga experiment för att öka robustheten i experimentell design och minimera variabiliteten specifikt till ett enda experiment. Till exempel kan observationer av CT-1 och CT-13 kan erhållas samtidigt om två inkubatorer med motsatta ljus-mörker-scheman används för indragning.
OBS: Ovanstående procedur beskriver beredningen av försöksdjur för analyser utförda i dygnsrytm tillstånd av konstant mörker. Olika ljus: mörka förhållanden kan användas för att sondera klockans funktioni de beteendemässiga reaktioner på alkohol. För att avgöra om en dygnsrytm existerar experimenten kan utföras under en LD cykel för att mäta prestanda på specifika zeitgeber Times (ZT). Dessutom kan protokollet användas med flugor som fötts upp under konstant ljus för experiment testa dygnsrytm dysfunktion. För alternativa protokoll som testar flugor inrymt i ljusa förhållanden, bör beteendemässiga analyser fortfarande utföras under mörka förhållanden. Flugor bör överföras i mörker i 1 timme före experimentet att minimera beteende variationer på grund av akuta effekter av ljus på beteendet.
3. Beteendeobservationer
Motivering och översikt: Följande alkohol administration protokoll är optimerat för observationer i dunkel röd ljusförhållanden. De två beteendeåtgärder LORR och sedering representerar två skilda punkter flyga berusning. Lorr representerar en sen efter berusning införliva förlust of motor och postural kontroll, medan sedering åtgärder en mycket sen slutpunkt berusning. Genotyp eller dygnsrytm modulering kan påverka dessa båda åtgärder på olika sätt; varför man vill undersöka båda. Kort sagt, flugor laddas i flaskorna, är antalet flugor visar LORR eller sedering gjorde var 5 min under alkoholånga exponering, och det totala antalet flugor som görs i slutet av experimentet.
- Före start av experimentet genom att köra luft genom systemet (luft bubblas genom vatten-och alkohol flaskor) under minst 10 minuter och använda den tiden för att kalibrera luftflöden.
- Koppla snabbkopplingen för att stoppa luftflödet. Ladda flugorna i flaskorna, och anslut luftflödet och starta timers. OBS: Om det inte svarar flugor eller döda flugor är kvar i djur flaskor, kan detta vara ett tecken på stress villkor. I allmänhet kan dessa tillstånd lindras genom bostäder färre flugor i djur flaskor eller minska livsmedels klibbighet med hjälp av en litenly högre agarkoncentration under matlagningen. För optimala beteendeanalyser och minimal variation mellan experiment, bör flugor vara frisk före experiment.
- För exakt tidtagning, använda en timer för att hålla reda på den totala tiden för alkoholexponering och använda en andra räkna-back timer att markera 5-minuters intervall.
- Placera en bit vitt papper under flaskorna för att öka kontrasten och flyga synlighet, särskilt under dunkla röda ljusförhållanden.
- Kontrollera luftflödet regelbundet under ett experiment för att upprätthålla konstanta nivåer. I allmänhet, när luftflöden har stabiliserats, de förblir stabila under experimentets längd.
- Räkna antalet flugor som har förlorat sin rätande reflex gång varje 5 min för en 1 h period. Eftersom alkoholkänslighet det varierar mellan genotyper och genetisk bakgrund, kan det vara önskvärt att utföra mer frekventa bedömningar eller att genomföra experimentet under en längre tid.
- Lyft flaskan slightly från ytan, och rikta ljuset från en röd-ljus ficklampa mot papperet bakom flaskan. Håll handhållna röda ficklampor på ett avstånd av minst 12 inches till den experimentella flaskan för att bibehålla ljusnivåer inte är större än 1 lux för alla experiment under dunkla röda ljusförhållanden.
- Mät ljusnivåer med hjälp av en ljusmätare för att etablera standarder för alla experiment.
- Bestäm hur många flugor som har förlorat sin rätande reflex genom att tillämpa en fast kran till flaskan och räkna hur många flugor misslyckas med att rätta sig inom ca 4 sek. Flugor som visar LORR kan fortfarande röra sina ben och vingar, men kan inte vända sig upprätt.
- I slutet av sessionen, räkna det totala antalet flugor i varje flaska.
Anm: Ibland kan en enda fluga fångas mellan proppen och den sida vid lastning flyger in i de experimentella flaskor. Eftersom detta sker i mörker, kan det inte lätt märkt så det är nödvändigt att räkna det totala steler av flugor i slutet av försöket att korrekt beräkna procentsatser.
Dessutom förfarandet också användas för att mäta sedering av flugor, som representerar en annan beteende slutpunkt. Medan sederade flugor har förlorat sin rätt reflex, kräver sedering större alkoholexponering. Beteendemässigt, kan sedering kännetecknas av den fullständiga bristen på uppenbar motorisk aktivitet med flugor kvar orörlig i injektionsflaskan efter en en fast kran till flaskan. För sedering, räkna antalet flugor som förblir orörliga utan ben vinka efter leverans av en fast kran av flaskan. Dessutom kan flaskan rullas sida till sida för att avgöra om enskilda flugor fortfarande kvar sin greppa reflex.
4. Dataanalys
- Bestäm procent lorr vid varje tidpunkt bedöms, baserat på totala antalet flugor i varje flaska.
- Estimate skillnader mellan circadian tidpunkter eller stammar från calculating till 50% LORR för varje prov, som faller inom den linjära delen av sigmoideum kurvan (se figur 2 nedan).
- Alternativa statistik:
- Vid jämförelser mellan genotyper planeras, är det önskvärt att analysera hela tidsförloppet med hjälp av upprepade mätningar ANOVAand att bestämma området för tidpunkter att skillnaderna är signifikanta med post-hoc-tester (figur 3). För dessa test, föredrar vi att använda en ett värde av 0,001. Detta gör att skillnader vid enskilda exponeringstider som skall bedömas samt skillnader mellan genotyper i lutningen på kurvan.
- Skillnader i känslighet för kan bestämmas för särskilda tider av alkohol exponering för en speciell reaktion såsom sedering från den linjära delen av kurvan (Figur 4).
- Skillnader mellan stammar eller dygnsrytm tidpunkter kan uppskattas med hjälp av vanliga F-statistik och post-hoc-tester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Circadian Modulering av alkohol känslighet med hjälp av 50% LORR som en markör.
Ett representativt exempel som visar circadian modulering i alkohol känslighet under dagen presenteras i figur 2. Lorr uppmättes vid sex tidpunkter under den 2: a dagen av DD i Canton-S och 50% lorr bestämdes för varje tidpunkt. Analys visade en signifikant effekt på tid på dygnet (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 per tidpunkt). Fisher LSD-test visade signifikanta skillnader mellan CT1 vs CT5, CT5 vs CT13, CT5 vs CT17, CT5 vs CT 21, CT9 vs CT13, CT9 vs CT17, och CT9 vs CT 21. Detta resultat stämmer överens med våra tidigare publicerade resultat 1.
Skillnader mellan vildtyp och muterade flugor.
Det andra exemplet använder tidsserier för att visa skillnader i LORR och sedering mellan vildtyp Canton-S flugor och flies bär en förlust-av-funktion vit mutation (v 1118) i samma genetiska bakgrund (Figur 3). W 1118-mutationen är av särskilt intresse för Drosophila forskare som transgena linjer skapas ofta med hjälp av dessa flugor och många muterade linjer för dygnsrytm klocka gener också ha w 1118 mutationen. Resultaten presenteras som en tidsserie (fig 3) med data som visas för varje 5 min under hela exponeringstiden. Observationer är begränsade till 60 minuter för att undvika effekterna av snabb tolerans uppbyggd 22-24. De w 1118 mutanter visar signifikant minskad LORR känslighet som svar på etanolånga än vad Canton-S (ANOVA mellan individer F 1,10 = 57,12, p <0,001, N = 6). Betydelse skillnader (a = 0.001) hittades i detta experiment från min 20 till min 60 (figur 3A w 1118 och Canton-S hittades också i graden av sedering (ANOVA mellan individer F 1,10 = 137,301, p <0,001, N = 6). I sedering analysen, var signifikanta skillnader (a = 0.001) fann i min 50, 55, och 60 (Figur 3B). Förutom bristen på screening pigment i ögonen, även w 1118 mutanter har sänkta nivåer av serotonin, dopamin och histamin 25,26. Dessa förändringar i biogena aminnivåerna kan förklara den förändrade känslighet för etanol i w 1118 mutanter 27,28. Därför kan styra nivån av vita uttryck i de analyserade genotyper vara avgörande för korrekt bedömning av etanolkänslighet.
Circadian Modulering av sedering.
I det tredje exemplet, mätte vi den procentuella andelen av Canton-S flyger stillsamd efter en viss tid för att avgöra om det finns en dygnsrytm effekten av alkohol på sedering (Figur 4). Vi jämförde den procentandel av flugor sedated vid 40 min (30% alkoholånga) vid CT 5 och 17, och resultaten visar att det är betydligt färre sederade flugor under dagen jämfört med alkohol exponering under natten (ANOVA: F 1,20 = 6,21, p = 0,022, N = 10 (CT5) & 12 (CT17)). Flugorna nådde inte sedering märket 50% inom en timme som observationerna gjordes enligt våra standard LORR förutsättningar för att göra en direkt jämförelse möjlig. Observationer utanför timmen är problematiska på grund av ansamling av snabb tolerans 22-24. I detta försök var mindre än 25% av flugorna på endera circadian tidpunkt sedated vid 40 min, vilket indikerar att det finns en skillnad i framkanten sedering känslighet mellan dessa grupper. Samla in data i detta tidiga punkt i sedering är en användbar indikeion att skillnader finns, möjligheten att bestämma effekten av behandlingen på formen på fördelningen i sedering svar är dock begränsad. För att avgöra om det finns skillnad i hela sedering fördelningen bör en högre koncentration etanol användas för att säkerställa en snabbare sedering.
Figur 1. Den Flybar att mäta alkoholkänslighet och sedering i fruktflugor.
.. Figur 2 Representant exempel visar betydande dygnsrytm modulering i alkoholkänslighet under dagen (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 per tidpunkt; signifikanta skillnader mellan CT5 vs CT1, CT13, CT17, & CT21 och CT9 vs CT13, CT17, och CT21).
Figur 3. Effekter av alkohol på beteendemässiga svar är signifikant mellan vildtyp Canton-S flugor och förlust-av-funktion vit 1118 muterade flugor. A) Canton-S flugor visar signifikant ökad känslighet för alkohol mätt med LORR jämfört med flyger med samma genetiska bakgrund som bär den vita mutationen (ANOVA mellan individer F 1,10 = 57.12, p <0,001, N = 6). B) Canton-S flugor är mer känsliga för alkohol sedering än w 1118 mutanter (ANOVA mellan ämnen F 1,10 = 137,301, p <0,001, n = 6). *p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
. Figur 4 Representativa data som jämför andelen Canton-S flugor drogad på 40 minuter mellan CT 5 och CT 17 Vildtyp flugor visar betydligt större ökningar i initial sedering vid CT 17 jämfört med CT-5 (ANOVA:. F 1,20 = 6,21, p = 0,022, N = 10 (CT5) & 12 (CT17)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kostnaderna för alkoholmissbruk och alkoholism för samhället är enorma, både i fråga om mänskliga 29 och ekonomiska kostnader 30,31. Drosophila som modell erbjuder ett snabbt och mångsidigt system för att snabbt undersöka beteendemässiga svar på ett stort antal individer och som sådan har i stor utsträckning använts för både alkohol 5,7,32-34 och dygnsrytm forskning 35-37.
Här beskrev vi en okomplicerad protokoll för kontrollerad tillförsel av alkoholånga till vuxna flugor i dygnsrytm förhållanden.
Flugor odlade under standardiserade förhållanden utsätts för alkoholånga under 1 timme, under vilken antalet flugor som har förlorat sin rätande reflex görs varje 5 min. Protokollet som beskrivs här är optimerad för dygnsrytm experiment på grund av de ytterligare krav för ångan och bostäder under konstanta förhållanden. Olika steg kan vara förenked för generiska studier genom att ta bort de steg som är nödvändiga för dygnsrytm experiment som lagring i mörker under minst en dag eller göra de experiment under dunkla röda ljusförhållanden. Detta protokoll kan också användas för att exponera ett stort antal flugor på ett kontrollerat sätt i varierande alkoholkoncentrationer för de följande biokemiska eller molekylära analyser. För överensstämmelse med andra Drosophila beteende-experiment som inlärning och minne observationer, mätningar av beteendereaktioner i dunkla röda ljus kan vara önskvärt även för icke-dygnsrytm experiment.
Variation mellan oberoende replikat av experimentet kan dölja små skillnader mellan mutanter eller transgena stammar eller mellan dygnsrytm tidpunkter. Det rekommenderas därför att prover av flera stammar eller dygnsrytm tidpunkter samtidigt (se våra exempel), så att "replik" kan läggas till som en slumpvariabel för att elimineraeffekten av variationen mellan replikerna.
Känslighet för alkohol varierar mellan stammar. Alkohol procentsatser (andelen av luftflödet bubblande genom alkohol) behöva justeras i enlighet därmed. Som framgår av Figur 3, flugor bär vita mutationen är mindre känsliga för effekterna av alkohol exponering än vildtyp Canton-S flugor. För analys av linjer som bär den vita mutationen, kan det vara önskvärt att öka andelen alkohol som flugorna utsätts för att utföra beteendeanalys inom samma tidsram på andra experiment som längre exponering för alkohol kan resultera i snabb tolerans utveckling. För extremt känsliga mutanter och för experiment där det är nödvändigt att minska andelen alkohol som används, såsom observerats för flugor som innehåller en mutation i den gula genen, kan luftflödet behöva ökas för att kalibrera alkohol mättade luftflödet noggrant. Små ökningar eller decemberreases (± 10%) i totalt luftflöde (fungerande flödesområde från 900-1,100 ml / min för 4 observations flaskor) verkar inte negativt påverka flugorna.
Iakttagelser bortom 1 timme bör undvikas när det är möjligt på grund av risken för en snabb tolerans uppbyggd i flugorna 22-24 som påverkar alkoholkänslighet. Istället bestämmer alkoholhalt för varje stam som resulterar i en cirka 50% LORR med 30-40 min. Om det krävs jämförelse av flera oberoende stammar, välja en enda procent av alkohol som fungerar för alla stammar.
Detta protokoll beror mycket på beteendeobservationer, så strikt följsamhet till ett standardiserat protokoll är viktigt för att undvika avdrift i beteende observationer över tiden. Om möjligt bör beteendemässiga observationer utföras så att observatören är blind för genotyp eller tidpunkt som testas. För att kunna upptäcka eventuell bias baserad på dessa och okända faktorer,det är lämpligt att undersöka data på ett tidsförlopp och för att kontrollera att observationer ligger inom samma intervall under försöksserien.
Den Flybar set-up ger vissa fördelar jämfört med andra metoder för alkoholförvaltningen för flugor, särskilt för grundforskare eller dygnsrytm studier om de negativa effekterna av etanol. En alternativ anordning för att mäta effekten av alkohol på motorisk kontroll i flugor är inebriometer, kan en vertikal kolumn där etanolånga cirkuleras genom stigande bafflar och förlust av postural kontroll eller känslighet flugan mätas genom att bestämma den tid det tar att falla till botten av kolonnen 38,39. Den inebriometer ger en automatiserad utläsning av förlust av postural kontroll och har visat sig värdefull för alkoholforskning i Drosophila 9,22,39,40, men denna beteendeparadigm kräver relativt dyrbar utrustning, utrymme för anordningen, och tid för att kalibreraoch optimera betingelser. Således kan inebriometer inte vara väl lämpad för många grundutbildningen laboratorier med begränsad budget eller utrymme, eller för forskare som utför dygnsrytm analyser. En annan metod för att ge alkohol till flugor och mäta sedering innebär att placera en liten mängd av flytande alkohol på ett absorberande material, antingen på toppen eller på botten av ett kärl och sedan låta alkoholen förångas med tiden 41,42. Eftersom koncentrationen av alkoholånga ökar med tiden, kan beteendemässiga reaktioner bedömas. Även denna leveransmetod är lätt att ställa in, mängden alkohol ånga till vilket flugorna utsätts varierar med tid och villkor. För experimentella frågor där skillnader utvärderas inom initiala andelen känslighet eller sedering, såsom dygnsrytm modulering, är det önskvärt att ha en konstant nivå av alkoholånga som levereras till flugorna. Dessutom har exponeringen av ett stort antal flugor till en konstant mängd av alkoholen exposure, som utförs med Flybar, är önskvärt för korrekt prestanda hos nedströms cellulära eller biokemiska analyser. En annan metod för att leverera alkohol till flugor vanliga i början av Drosophila alkoholforskning inblandade blanda alkohol i maten eftersom det var beredd. Även om denna metod är enkel och kräver lite set-up, är det bäst lämpade för kronisk alkoholexponering under dagarna som den koncentration av förändringar alkohol med tiden.
Mer sofistikerade, automatiserade metoder är också tillgängliga för att bedöma rörelseapparaten svar av flugor till alkoholexponering inklusive video aktivitet inspelning och bildanalys programvara 7,43. Dessa är särskilt kraftfull för att bedöma de positiva, hyper-aktiverande effekter av etanol. Dock kan dessa automatiserade metoder vara oöverkomligt dyr för grund forskningsprojekt eller undervisningslaboratorier och kan inte vara optimalt utformad för analys av ett stort antal flugor i dygnsrytm villkortioner (t.ex. videoinspelning under mörka förhållanden kräver en balanserad och diffus infraröd belysning och infraröd känsliga kameror). Vi tror att Flybar ett enkelt att installera, kostnadseffektiv metod för alkoholleveranssystemet och bedömningen av beteendemässiga reaktioner på alkohol som är väl lämpade för en rad olika tillstånd och laboratorie design.
PROTOKOLL ÄNDRINGAR:
Protokollet som beskrivs ovan syftar till att undersöka effekten av alkohol exponering på förlust-av-Righting-Reflex i en dygnsrytm sammanhang. Emellertid kan protokollet enkelt modifieras för att rymma andra typer av alkohol experiment.
Undersöka svar på alkohol under 12 tim-12 tim ljus-mörker (LD, zeitgeber Time) villkor: Behåll flugor under 12 tim: 12 tim LD cykel tills experimentet. Överför flugorna till den mörka ca 1 tim före försöket genomfördes under den ljusa fasen (ZT 1, 5Och 9) av dagen. Detta kommer att säkerställa att den akuta effekten av ljus inte är confounding resultatet.
Undersöka svar på alkohol under konstanta ljusförhållanden: Odling flugor under konstanta ljusförhållanden leder till avbrott i sin dygnsrytm klocka 18-21 och arrhythmic reaktioner på alkohol exponering 1. Flugor kan överföras till den mörka ca 1 tim före försöket, så att flugorna testas på samma villkor som flugor som upprätthålls i LD eller DD förhållanden.
Sedering: Flugor som sederade kan separeras från LORR flugor eftersom flugor kvar orörlig på botten av flaskan, medan LORR flugor kommer ändå flytta sina vingar, huvud och ben. Flugor som uppvisar LORR fortfarande svara med subtila rörelser när flaskan är störd. Sedering av flugor bestäms av att räkna antalet flugor kvar orörlig efter en fast TAp till flaskan. Dessutom kan valsning av injektionsflaskan ska användas för att avgöra om enskilda flugor fortfarande kvar sin greppa reflex.
Återhämtning: Den beteendeanalys kan utsträckas genom att mäta återhämtning som en extra parameter av alkohol svar. Avbryt alkoholexponering och fortsätta att göra iakttagelser angående LORR var 5 min. Fortsätt att flödet av befuktad luft genom rören under återhämtningsperioderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Finansieringen för denna forskning gs av ett program i neurovetenskap Award från Florida State University College of Medicine och stöd från institutionen för biologisk vetenskap vid FSU. Ytterligare Finansieringen kom från en Grant-i-Stöd från alkohol drycker Tillverkarens forskningsfonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y-connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature air regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature air regulator mounting bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. Deaths: Final data for 2007. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention: National Center for Health Statistics. (2010).
- The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , Columbia University. (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , Available from: www.medtext.com/hdcn.htm (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. Pfaff, D. W., Kieffer, B. 1129, Blackwell Publishing. 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
