Summary
细胞间钙
Abstract
间的沟通是必不可少的各种器官和组织，包括大脑，肝脏，视网膜，耳蜗血管细胞之间的生理过程的协调。在实验设置中，细胞间的Ca 2 +波可以引起的施加机械刺激的单个单元格。这会导致细胞内信号分子IP 3与Ca 2 +的释放，启 动同心的机械刺激细胞的Ca 2 +波传播到邻近细胞。的主要分子间的Ca 2 +波传播途径，控制是通过直接传输IP 3和半管通过ATP释放的间隙连接通道。鉴定和表征的属性和调节不同连接蛋白和pannexin的亚型，间隙连接通道和半管所允许的quantification的胞间的Ca 2 +波，小干扰RNA，和间隙连接通道和半管抑制剂的使用的蔓延。在这里，我们描述的方法来衡量间的Ca 2 +波原发性角膜内皮细胞的单层Fluo4-AM加载响应的控制和局部机械的刺激引起的一种急性，短暂变形的细胞，结果接触，用显微操纵器控制与齿顶圆直径小于1微米的玻璃微细胞膜。我们还描述了初级牛角膜内皮细胞和其用作模型系统评估Cx43的hemichannel活性间的Ca 2 +波通过释放的ATP作为驱动力的隔离。最后，我们讨论的使用，优点，局限性和替代品的差距结的通道和hemichannel研究的背景下，这种方法。
Introduction
间的通信和信号是必不可少的响应外兴奋剂组织和整个器官水平1,2协调的生理过程。间沟通的最直接的方法是创建发生间隙路口。缝隙连接的间隙连接通道的噬菌斑，这是蛋白质形成的通道由两个间隙连接蛋白（Cx的）相邻小区的半管3,4（ 图1）的头-头对接。缝隙连接的允许通过的小的信号分子，其分子量小于1.5 kDa的，包括的Ca 2 +或IP 3 5，引起和调制的Ca 2 +释放的相邻小区6（ 图2）从细胞内储存。间隙连接通道内和分子间的蛋白质相互作用，细胞信号传导过程，如氧化还原修改和严格的监管磷酸化7。 GJS促进细胞连接的协调反应，从而作为一种化学和电气合胞体。例如，基于Cx的GJ通道85是介导的跨心房和心室肌细胞的心肌动作电位的传播。 Cxs的不仅有间隙连接通道的作用，而且还形成未配对的半管，从而作为膜通道的常规离子通道8-10（ 图1）类似。半管参与相邻细胞之间的旁分泌信号，通过控制离子交换和信号分子之间的内和细胞外的环境。
在许多类型的细胞（如上皮细胞，成骨细胞，星形胶质细胞，血管内皮细胞等 ）和器官（如脑，肝，视网膜，耳蜗和脉管系统）中，细胞间的Ca 2 +的波的基本协调多细胞反应的
在许多类型的细胞，包括角膜内皮细胞28,29，ATP是主要的亲水性的，该驱动器的传播间的Ca 2 +波37-40的旁分泌因子之一。期间通过各种代理的机械变形，缺氧，炎症或刺激，ATP可以释放健康的细胞41-44剪切应力，拉伸，或渗透压肿胀44,45的响应。已经假定，包括囊泡胞吐的运输机制，如ATP结合盒（ABC）转运，质膜电压依赖性阴离子通道46，P2X7受体通道47,48，以及44和大量不同的ATP释放机制 连接蛋白49-52和pannexin半管半管43,49,53。外ATP可迅速水解为ADP，AMP和腺苷54,55由ectonucleotidases是存在于细胞外的环境中。细胞释放ATP及其代谢产物ADP 56将通过扩散蔓延。随后的这些核苷酸与在相邻小区中的嘌呤能受体的相互作用已被牵连在propagation间的Ca 2 +波28,37,51。存在两个不同的类，嘌呤能受体：腺苷P1-嘌呤受体的天然配体是主要的，而嘌呤（ATP，ADP）和嘧啶核苷酸（UTP，UDP）作用于P2-嘌呤受体57。
间的通信可以通过不同的方法，如刮加载，染料转移，本地的uncaging受体激动剂如IP 3和Ca 2 +的，机械性刺激等进行调查。这里，我们描述的研究的Ca 2 +波传播引起的机械性刺激的单个单元格。研究Ca 2 +的波传播的机械刺激的优点是，它提供了一个简单的工具，以量化的Ca 2 +波的传播，随着时间的推移，它允许定量比较不同预处理细胞。在角膜内皮细胞中，这些胞内Ca 2 +的波允许的共的单层的协调响应，在此作为一个可能的防御机制帮助承受外应力，在眼内手术中的血管内皮细胞的非再生的角膜内皮细胞，或在曝光时的免疫排斥反应过程中的炎症介质或葡萄膜炎58,59。
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Protocol
1。角膜内皮细胞的分离
在开始之前：隔离新鲜的眼睛，从本地屠宰场，尽快去核后，眼睛的细胞。确保眼球被摘除一个很牛的最大18个月，五分钟验尸和保存在厄尔的平衡盐溶液 - 1％碘溶液在4°C运输到实验室。
- 走眼厄尔的平衡盐溶液 - 1％碘溶液，并将其放置在培养皿（100 x 20毫米）。
- 眼用溶液中含有70％乙醇消毒，冲洗Earle氏平衡盐溶液含有1％的碘。
- 从这个步骤开始，在无菌罩。小心地从眼睛角膜解剖，并将其放置在陪替氏培养皿（35×10毫米），含有Earle氏平衡盐溶液的，朝上的上皮细胞层。小心删除任何剩余的虹膜组织STI会附着在角膜上，如果需要的话。
- 传输角膜到另一个Earle氏平衡盐溶液的培养皿中含有与血管内皮细胞层向上的Earle氏平衡盐溶液冲洗两次。
- 转移的角膜内皮细胞层，一个砂漏，这是一个杯形盘朝上，并覆盖它与生长培养基。生长培养基中的Dulbecco改进的鹰的中等含有25mM的葡萄糖，10％胎牛血清，6.6％L-谷氨酰胺，2.5微克/毫升两性霉素-B和1％抗生素 - 抗真菌剂的混合物含有10,000个单位/ ml青霉素，10,000微克/毫升链霉素和25微克/毫升两性霉素B。
- 吸入移液管取出培养基。
- 将300μl的胰蛋白酶溶液（0.5克/升）的角膜内皮细胞层（包括胰蛋白酶的所有步骤都是使用相同的浓度）。
- 将含角膜沙漏在有盖培养皿中，并把它在公司ubator 30分钟，在37℃和5％CO 2。
- 轻轻刮去离角膜内皮细胞与火抛光的勾形玻璃巴斯德吸管在无菌罩。
- 吸出含有内皮细胞的溶液，然后将其添加到含有4毫升培养基中的培养瓶（25cm 2的）。
- 将300微升生长培养基中，在角膜和重复刮，并添加含有内皮细胞的培养瓶中的溶液。
- 再次重复最后一步（1.11）。
- 放置在孵化器中于37℃和5％CO 2，在生长培养基中含有的角膜内皮细胞的培养瓶。
- 两天后，加入6毫升培养基。
- 每隔一天刷新培养基中生长。
2。细胞培养
- 取出培养基，洗涤细胞两次，Earle氏平衡盐溶液，达到汇合时（内阿布T 10天隔离后）。
- 1.5毫升胰蛋白酶溶液加入到细胞中分离，并把该烧瓶中，在孵化器（37℃，5％CO 2）为3〜4分钟。
- 添加12毫升生长培养基。移液器中三次进出分散细胞和细胞计数。
- 种子细胞，取决于细胞的密度，并把它们在孵化器的可变部分。准备两个腔幻灯片（面积为4.2厘米2）165000细胞的细胞计数（每cm 2的细胞密度39286）。准备一个新的通道密度为每平方厘米 6250 80 cm 2的培养瓶中，并加入新鲜的培养基中至总体积为25毫升。
- 刷新介质每两天。
- 达到汇合的细胞层后3〜4天。使用代细胞用于实验。
- 当达到汇合在瓶中的细胞层，重复步骤2.1至2.6。通道2的细胞培养可以用于或实验。
3。机械刺激诱发的钙波
- 10微米荧光4加载的细胞腔幻灯片，AM在磷酸盐缓冲液中30分钟，在37°C，而轻轻晃动。
- 取出荧光4 AM溶液，洗涤细胞5次，用磷酸盐缓冲盐水，孵育细胞，用磷酸盐缓冲盐水，并离开细胞之前，测量在室温下至少5分钟。
- 氩激光并使用分束器488 HFT激发波长为488 nm，收集的荧光发射波长为530 nm，使用长波发射滤波器LP 505，设置针孔最低。使用油浸40X目标（空气，1.2 NA）。 ARL-67156在实验中，使用10倍的目标（空气，0.3 NA）。
- 搜索一个领域中，细胞融合共聚焦显微镜。
- 吸移管的位置，以便它是在45℃在相对于腔滑动接触的细胞膜。挑起短（约1秒）到一个单细胞的机械性刺激。机械刺激包括急性，短暂的变形细胞的短暂接触不到1％的细胞膜用玻璃微吸管（顶端直径小于1微米）耦合到一个压电晶体纳米定位，这是通过放大器操作安装在一个微操纵器。用微电极拉马玻璃微。请确定由0.2和1.5伏之间的电压的机械性刺激过程中，纳米定位操作。高于1.5 V的电压可能会导致细胞损伤。无细胞损伤的机械性刺激的最优电压的每个单元格的类型和条件，必须仔细确定通过应用一系列从低（0.2 V）高电压（1.5伏）的电压。的电压，因为这个电压决定施加到细胞膜的机械应力和应变力的刺激是衡量。该可以计算出机械性刺激的力乘以与该区域的机械应力。由于这两种区域（<3.14微米2）和机械应力都非常低，低的力的机械性刺激。 （需要注意的是，当细胞被破坏，荧光漏出的细胞和细胞变暗。）
- 测量空间变化的[Ca 2 +] i的机械性刺激后共聚焦显微镜。
- 收集和存储图像。
- 绘制一个多边形区域，感兴趣的定义的共聚焦显微镜使用该软件的应答细胞（有效面积，AA）的总表面面积。
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Representative Results
执行所有的实验都符合所有有关准则，法规和监管机构的协议被证明是鲁汶的动物护理和使用委员会的指导和批准下进行。
牛角膜内皮细胞（BCEC），表达和功能的间隙连接两种细胞间隙连接通讯和旁分泌细胞间通信间的沟通互动的方式作出显著贡献，但已被证明的主要途径是旁分泌细胞间的通信通路介导的通过ATP释放Cx43的半管28,29。 ATP和ADP是由ectonucleotidase电子NTPD1（ectonucleoside的三diphosphohydrolase 1，CD39 ATP diphosphohydrolase）水解，腺苷一磷酸（AMP），其后腺苷的的5'-ectonucleotidase CD73 28,29的 。 ATP和ADP贡献Ca 2 +的波传播P2Y1和P2Y2受体28,29结合。这两种受体夫妇PLC 通过 Gq蛋白，从而唤起IP 3引起的Ca 2 +的释放（ 图2）。在波士顿华人布道，刺激嘌呤P2Y受体的结果快速增加的[Ca 2 +] i的，这是不敏感的[Ca 2 +] O 60去除。的[Ca 2 +] i的峰激动剂刺激所诱发的[Ca 2 +] 邻的依赖振荡的波动，或回到基线后通过的[Ca 2 +] i的下降，这可能会导致激动剂依赖一个稳定的，海拔， 60-62。在BCEC，已有证据表明，Ca 2 +的释放发生通过一个途径，涉及PLC和IP 3 月29日 。清空的IP 3敏感商店初始峰值导致的[Ca 2 +] i的，其后跟着约pacitative的Ca 2 +-涌入导致发病的高原阶段63。
机械刺激导致了快速的初始上升的Ca 2 +，源于点的刺激，然后展开整个的机械刺激的细胞。最后，细胞内Ca 2 +水平慢慢降低回到基线水平。在到达小区边界的胞内Ca 2 +的波传播到周围的相邻小区（NB），波浪状的方式作为Ca 2 +的瞬态，衰减到基础水平（ 图3）。在控制条件下的Ca 2 +瞬变，观察到大约4至8个细胞层相差的机械刺激的细胞（ 图3）。线图（ 图3中的面板的右侧）示出的时间过程中的Ca 2 +瞬变（表示为归一化荧光（NF）的值）机械刺激的细胞和相邻小区中的层一至五个（NB1，NB2，NB3，NB4和NB5）。从图3中 ，很明显，在归一化荧光减少，而发病的延迟时间的[Ca 2 +] i的上升距离的增加而增加的机械刺激的细胞。机械刺激细胞的最大标准化荧光达到0.95±0.04秒。达到最大的标准化荧光值后，归一化荧光显示一个非常渐进和缓慢下降，回到基础值152±6秒后，应用的刺激25。
抑制旁分泌间的通信路径，使用外源apyrase VI（5 U / ml的30分钟）和apyrase VII（5 U / ml的30分钟）的组合导致覆盖的区域内的Ca 2的 7.5倍的减少+波，所谓的有效面积（AA，P <0.001，N = 7中，n = 35）（ 图4A）。 apyrase被称为水解ATP和ADP。第六Apyrase有一个高的ATP酶活性/ ADPase的的比例和第七apyrase优先水解ADP 56。
由于旁分泌的角膜内皮细胞间通讯在很大程度上是通过ATP释放，28,29和ATP的水解，在细胞外空间由的ectonucleotidases，已知角膜内皮细胞中的表达，29,64,65我们调查的影响AA条件ATP水解被抑制使用ectonucleotidase抑制剂。用ARL-67156（ARL; 30分钟的100μM）抑制ectonucleotidases导致的Ca 2 +波传播的有力的提升，已被证明先前BCEC 25,26,28,29。 BCEC ARL曝光引起机管局控制条件（P <0.001，N = 12，N = 60）（ 图4B）相比增加3.5倍。
在预以往的研究在我们的实验室，连接蛋白模仿的肽（Gap26 Gap27， 表2），用来区分间的Ca 2 +波传播的机械性刺激后，细胞间隙连接通讯和旁分泌细胞间通信的相对贡献与无效肽（ 表2）作为对照28,29。
抑制间隙连接通道与Gap27显着减少的Ca 2 +波BCEC 30的传播。机管局明显减少预处理后Gap27为30分钟（300微米）（P <0.001，N = 8，N = 40）25（ 表1）。连接蛋白的半管与连接蛋白模拟肽Gap26的28,30的抑制作用显着减少的Ca 2 +波的传播BCEC 28。机管局明显减少预处理后与Gap26 300微米（30分钟）（P <0.001，N = 8，N = 40）25（ 表1）。
我们还发现，43-kDa的CX蛋白为主要成分基本hemichannel介导的ATP释放，引发细胞间的Ca 2 +波。使用两个独立设计的siRNA分子靶向Cx43的，我们发现，机管局减少了约65％33（ 见表1）。对此进行了进一步的支持下实验中使用的TAT-L2（100μM，30分钟），一种细胞渗透性的肽，对应于细胞内循环的Cx43下半年（ 表2），这引起在AA的主要减少（P <0.001 N = 3，N = 30）（ 表1）。重要的是，未观察到AA通过TAT-L2孵育这减少旁分泌信号的情况下，支持的概念，TAT-L2选择性地抑制基于Cx43的半管，但没有间隙连接通道33。此外，无效TAT-L2突变体（TAT-L2 H126K/I130N）可以用来作为对照（ 表2）。
图1。形成间隙连接通道和半管示意图。答连接蛋白或pannexin hemichannel的六连接蛋白或pannexins的，这是含四跨膜蛋白，形成围绕一个中心孔径向布置。半管都位于质膜。它们可以由相同的蛋白质亚型（同源半管），或者它们可以由不同的蛋白质亚型，当两个或更多的同种型的表达在同一细胞（异聚半管）。 Â同型缝隙连接通道导致从两个相同的同源或异源半管的对接。 à异型缝隙连接通道从D21.060.30两种不同的同源或异源渠道。B.的结构示意图连接蛋白和pannexin的间隙连接通道，连接两个相邻的细胞和半管。
（部分从66修改）
这个数字最初发表于BioEssays的 。 D'HONDT Catheleyne，亨伯特拉夫Ponsaerts，的德Smedt，海尔特Bultynck，和伯纳德Himpens的。的Pannexins，与特定的细胞功能连接蛋白家族的远亲。BioEssays 2009年，31，953-974（2009）。BioEssays 点击这里查看大图 。
图2。在非兴奋细胞，tercellular的Ca 2 +波传播既包括细胞间隙连接通讯和旁分泌细胞间的沟通。+涌入和/或一个单细胞的Ca 2 +高层发生在机械刺激细胞的Ca 2（MS） 通过机械性刺激后Ca 2 +的释放。接着，对Ca 2 +的上升从传播的机械刺激的相邻小区（NB）的胞内Ca 2 +的波。间传播涉及两个机制，即细胞间隙连接通讯和旁分泌细胞间的沟通。在细胞间隙连接通讯，直接交流的调解员（IP 3和/或Ca 2 +）之间发生的相邻细胞的细胞质通过间隙路口（GJS）。旁分泌的胞间通信，一个信使（ 例如三磷酸腺苷）被释放到细胞外空间，从而作用于受体位于在thE面相邻小区。半管（HCS）或其他机制介导的ATP释放（见正文）。 Ectonucleotidases水解ATP，ADP和AMP。 ATP与ADP作用在P2Y和/或周边小区的P2X受体。 （摘自66）。
这个数字最初发表于BioEssays的 。 D'HONDT Catheleyne，亨伯特拉夫Ponsaerts，的德Smedt，海尔特Bultynck，和伯纳德Himpens的。的的Pannexins，远亲连接蛋白家族与特定的细胞功能。BioEssays 2009 31，953-974（2009）。BioEssays。
图3。钙波传播的在BCEC控制条件。机械刺激引起的钙瞬变显示在不同的时间点在控制条件下BCEC代表伪彩色荧光图像。荧光刘哲民强度刺激前的第一张图像。所述第二图像中的白色箭头标识的机械刺激的细胞。钙波传播到6个相邻的细胞层，总面积达到62,870微米2波（有效面积：AA）的细胞。
将右面板的线图，示出的归一化的荧光值（NF）中的机械刺激的细胞（MS），并且平均在相邻小区中的NF值（NB）层1至层5（NB1 NB5）的时间过程。 （部分从25修改）。
这个数字最初发表在调查眼科及视觉科学 。 ，拉夫Ponsaerts，Catheleyne D'HONDT的P SRINIVAS Sangly Johan Vereecke的和伯纳德Himpens的。凝血酶抑制角膜内皮细胞间钙波传播调制的半管和缝隙连接。 投资。眼科。可见。 2007年SCI收录。
图4。重大变化间的Ca 2 +波治疗后与外生nucleotidases（左）与BCEC ectonucleotidase抑制剂（右）的传播。 A.显着减少在AA外生apyrases（apyrase六（5 U / ml）的apyrase七（5 U / ml）的30分钟），水解ATP和ADP，特此抑制分泌间通信通路（BCEC治疗后Ñ = 7，N = 35）。 *表示P <0.001 apyrase的存在与不存在的。BCEC与有选择性ectonucleotidase抑制剂ARL-67156（ARL 100微米30分钟），赫比增效的治疗后AA显着增加克旁分泌细胞间的通信通路（N = 12，N = 60）。 *在存在与不存在的ARL标志着P <0.001。
| 归AA | 圣错误 | Ñ | Ñ | 统计 | |
| 控制 | 100 | 8.31 | 3 | 30 | |
| siScramble | 87.97 | 9.3 | 3 | 30 | |
| siCx43-1 | 32.45 | 8.23 | 3 | 30 | * |
| siCx43-2 | 35.49 | 7.06 | 3 | 30 | * |
| 对照肽 | 91.68 | 6.5 | 8 | 40 | |
| 峡26 | 46.67 | 4.24 | 8 | 40 | * |
| 峡27 | 53 | 4.76 | 8 | 40 | * |
| TAT-L2 | 6.99 | 0.71 | 3 | 30 | * |
表1中。 - siRNA分子靶向Cx43蛋白，连接蛋白模拟肽和细胞渗透性肽TAT-L2上的归一化的有源区（AA）在BCEC的影响。
N表示数天的实验中，n表示的机械刺激的数目。 *表示P <0.001相比，控制条件。
| AA序列 | |
| 对照肽 | SRGGEKNVFIV | Gap26 | VCYDKSFPISHVR |
| Gap27 | SRPTEKTIFII |
| TAT-L2 | YGRKKRRQRRR DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK |
| TAT-L2H126K/I130N | YGRKKRRQRRR DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK |
| 10Panx1 | WRQAAFVDSY |
表2中。所使用的肽的氨基酸序列。
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Discussion
在这篇稿件中，我们描述了一个简单的方法来衡量初级牛角膜内皮细胞的单层细胞间的Ca 2 +波传播提供本地化和控制的机械性刺激，使用微量。机械刺激的细胞响应与局部增加细胞内的IP 3与Ca 2 +，这两者都是必不可少的细胞内信号分子，该驱动器间的Ca 2 +波传播11,67。 IP 3直接传送给通过间隙连接通道5的相邻小区，而Ca 2 +的激起半管的开口和释放的ATP 68,69，这将触发的Ca 2 +在相邻小区的信号通过激活G-蛋白耦合P2受体37-40。间隙连接通道的相对贡献，在这个过程中的半管的特点是可以使用的Cx模仿肽，ATP降解酶（ectonucleotidases）的和抑制剂ectonucleotisdases。在机械刺激引起的细胞间的Ca 2 +波传播的牛角膜内皮细胞中被彻底的属性其特征在于在我们的实验室25-33。我们的研究结果表明，细胞间的Ca 2 +波传播主要是由一个CX-hemichannel的介导的ATP释放，发挥了突出的作用Cx43的。因此，这种方法适用于主牛角膜内皮细胞是特别适合来识别或表征在原生细胞的内源性水平的调节Cx43的半管。使用这种方法，我们已经发现，Cx43的半管的活动，严格控制由肌动蛋白细胞骨架，可作为内源性制动器防止过 度，从而有害，Cx43 hemichannel的开口25,31,32。我们进一步阐明这个调控的分子机制，并找到一个重要的角色，是必不可少的开幕Cx43的半管33的分子内环路/尾相互作用。
显然，此系统是非常合适的研究Cx和基于Panx的的间隙连接通道和半管的功能，绝对不是限定的牛角膜内皮细胞，但适应几乎任何类型的细胞，以及更复杂的组织，正如已经表明大脑中的机械性刺激引发大间的Ca 2 +波涵盖整个半球70。存在不同的工具，以评估的贡献间隙连接通道和半管，包括Cx的模拟肽，ATP的降解酶，抑制剂ectonucleotidases和药物化合物，如甘珀酸和10 Panx1（ 表2）49,50。 ，以确定目标Cx或Panx的同工型的贡献，在这个过程中，精心设计的siRNA探针吨argeting的mRNA及加扰控制的两个独立的区域应该被使用。应确定在总蛋白含量，用蛋白质印迹检测，用荧光显微镜在单细胞水平的程度拦截。的siRNA的转染效率探测的实验的单层细胞在荧光显微镜下，应评估。对于这一点，可以开发一个全双工的siRNA有义链的3'末端的荧光标记物已被纳入。重要的是要注意，进行适当的分析，一个突出的减少，Cx或Panx的同种型（减少> 90％），以及均匀的转染的细胞单层中的（> 90％的细胞，转染siRNA的siRNA双链探头）应获得。应评估设计的siRNA的选择性探针朝向目标71。总之，这些工具应该进行验证，使它们不影响的其他Cx的Panx的亚型的表达，或其他关键的COMponents驱动间的Ca 2 +波，像P2X或P2Y受体。要评估Cx43的半管的贡献，我们的合作，发展中实验室的博士Leybaert在一种细胞渗透性肽，对应下半年Cx43的细胞内循环（TAT-L2）的行为作为一种选择性的强效抑制剂Cx43的半管，同时保持Cx43的缝隙连接通道活动33。在我们的研究中，我们使用100微米TAT-L2获得一个完整的抑制Cx43的半管，但浓度较低，可能是足够的72。 TAT-L2H126K/I130N建议作为阴性对照73。为了评估的贡献的Panx1频道中，10Panx1肽可以被应用。这些工具是重要的，不仅不包括质膜中断（见下文），而且还表明旁分泌的ATP介导的信号间的Ca 2 +波传播机制由半管，而不是通过其他机制（如米AXI-阴离子通道或ATP含囊泡的释放）。最后，所有使用的原代细胞的研究中，细胞培养条件和通道的数目必须是标准化的，作为细胞的生物学特性不同的Cx和Panx的异构体的表达谱，从而有可能发生变化随着时间的推移26。
然而，这种方法也有一些缺点。的方法的一个主要缺点是，机械性刺激可能触发质膜中断，导致进入细胞外Ca 2 +和信号分子的释放，如三磷酸腺苷，所依据的真正的细胞间的Ca 2 +-波传播11。这肯定的（定量）的胞内Ca 2 +的波分析的复杂性。因此，强烈建议我应该）用适当的控制， 即缺乏表达的Cx或Panx的亚型细胞株和工具集成功能Cx和Panx作为间隙连接通道和/或半管和ii）rfere标准化的机械性刺激过程（确保纳米定位操作过程中由机械刺激0.5和2 V之间的电压）。
此外，重要的是要注意，这种方法本身并不突出，但应受惠于额外的实验方法研究Cx和Panx通道。这样就可以实现通过使用本地增加的机械刺激介导的细胞间的Ca 2 +波传播参与的细胞内信号分子，如细 胞内的IP 3或Ca 2 +的11,74的uncaging。要启动间的 Ca 2 +波的独立的机械刺激，一个可以使用微注射，如重组促凋亡的Bax的11,75和光可激活的 Ca 2 +缓冲，如重氮基-2，会导致局部的细胞外降[Ca 2 +的76，已知触发hemichannel开放。另外，可以使用在原位电穿孔不透细胞的信号传导分子，引起细胞内Ca 2 +释放和细胞内Ca 2 +的波，如IP 3 67,68。后者的技术也可以用来研究细胞死亡5,77蔓延。这些非机械性刺激的刺激强度的反应提供一个更好的评估。除了 这些Ca 2 +的波传播方法，重要的是要确定的Cx或Panx的渠道使用其他的方法，其中包括亲水性染料的吸收测定（像路西弗黄色）78，不仅在ATP的释放的活性而且在响应于细胞外Ca 2 +的缓冲液（如EGTA）和胞内Ca 2 +释放分子（类似的Ca 2 +离子载体A23187）11,74对机械刺激的反应。此外，吨他最好的证明在通道水平的调节是通过电生理实验，无论是双电压钳系统或整个小区路径钳爪蟾卵母细胞注入，与CX或Panx的表达或HeLa细胞异位表达CX亚型连同一个像GFP标记79-84。
总括而言，使用机械性刺激诱 导间的Ca 2 +波提供了一个简单而可靠的方法来研究细胞内的沟通和研究的贡献和性能的Cx和Panx通道。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
在实验室中进行的研究工作，研究基金会赠款支持 - 佛兰德（FWO授权号码G.0545.08和G.0298.11），校际景点波兰人计划（比利时科学政策;授权号P6/28和P7/13）和嵌入式在FWO支持的研究界。鼎晖是一个博士后研究基金会 - 佛拉芒（FWO），的。作者非常感谢所有现任和前任成员实验室的分子和细胞信号（鲁汶），的SP SRINIVAS博士（印第安纳大学眼科视光学院，美国），实验室博士Leybaert（根特大学）和博士Vinken（VUB）提供了有益的讨论，优化程序或参与开发工具的研究连接蛋白半管。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | 14155-048 | |
| Iodine | Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) | 38060-1EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | 11960-044 | |
| L-glutamine (Glutamax) | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | 35050-038 | |
| Amphotericin-B | Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) | A2942 | |
| Antibiotic-antimycotic mixture | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | 15240-096 | |
| Trypsin | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | 25300-054 | |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | 14190-091 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | F14217 | |
| ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) | Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) | A265 | |
| Apyrase VI | Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) | A6410 | |
| Apyrase VII | Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) | A6535 | |
| Gap26 (VCYDKSFPISHVR) | Custom peptide synthesis | ||
| Gap27 (SRPTEKTIFII) | Custom peptide synthesis | ||
| Control Peptide (SRGGEKNVFIV) | Custom peptide synthesis | ||
| siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) | Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium) | ||
| siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) | Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium) | ||
| siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) | Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium) | ||
| TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK) | Thermo Electron (Ulm, Germany) | ||
| TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) | Thermo Electron (Ulm, Germany) | ||
| Two chambered glass slides | Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark) | 155380 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany) | LSM510 | |
| Piez–lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner) | PI Polytech (Karlsruhe, Germany) | P-280 | |
| HVPZT-amplifier | PI Polytech (Karlsruhe, Germany) | E463 HVPZT-amplifier | |
| Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter) | World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA | 4878 | |
| Micr–lectrode puller | Zeitz Instrumente (Munchen, Germany) | WZ DMZ-Universal Puller |
References
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