Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحفيز الميكانيكية التي يسببها الكالسيوم انتشار الموجات في الخلية monolayers: مثال من الأبقار الخلايا البطانية القرنية

Published: July 16, 2013 doi: 10.3791/50443
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

Summary

الكالسيوم بين الخلايا

Abstract

الاتصالات بين الخلايا أمر ضروري لتنسيق العمليات الفسيولوجية بين الخلايا في مجموعة متنوعة من الأجهزة والأنسجة، بما في ذلك الدماغ والكبد، شبكية العين، القوقعة والأوعية الدموية. في إعدادات التجريبية، بين الخلايا كا 2 + موجات يمكن استخلاصها من خلال تطبيق التحفيز الميكانيكي لخلية واحدة. وهذا يؤدي إلى الإفراج عن الجزيئات داخل الخلايا مما يشير IP 3 والكالسيوم 2 + التي بدء انتشار كا 2 + الموجة بتكثف من الخلية حفز ميكانيكيا إلى الخلايا المجاورة. يتم توفير المسارات الجزيئية الرئيسية التي تتحكم بين الخلايا كا 2 + انتشار الموجة عبر قنوات تقاطع الفجوة من خلال نقل مباشر من IP (3) وhemichannels من خلال الافراج عن ATP. ويسمح تحديد وتوصيف خصائص وتنظيم connexin مختلفة والأشكال الإسوية pannexin كقنوات تقاطع الفجوة وhemichannels من قبل quantificatioن من انتشار الكالسيوم بين الخلايا 2 + الموجة، سيرنا، واستخدام مثبطات قنوات تقاطع الفجوة وhemichannels. هنا، نحن تصف طريقة لقياس بين الخلايا كا 2 + الموجة في الطبقات الوحيدة من الخلايا البطانية القرنية الأولية محملة Fluo4-AM ردا على التحفيز الميكانيكي للرقابة والمترجمة استفزاز من قبل، وتشوه قصيرة الأمد الحاد في الخلية نتيجة لذلك من لمس غشاء الخلية مع micropipette الزجاج التي تسيطر عليها مياداة مجهرية التي يبلغ قطرها غيض من أقل من 1 ميكرون. نحن أيضا وصف عزلة الابتدائي الأبقار الخلايا البطانية القرنية واستخدامه كنظام نموذج لتقييم النشاط Cx43-hemichannel باعتبارها القوة يحركها لبين الخلايا كا 2 + موجات من خلال الافراج عن ATP. وأخيرا، نحن مناقشة استخدام، ومزايا والقيود والبدائل لهذا الأسلوب في سياق الفجوة قناة تقاطع والبحوث hemichannel.

Introduction

الاتصالات بين الخلايا وإشارات ضرورية لتنسيق العمليات الفسيولوجية في استجابة لمنبهات خارج الخلية في الأنسجة و1،2 مستوى كامل الجهاز. يتم إنشاء الطريق الأكثر مباشرة للاتصال بين الخلايا من حدوث تقاطعات الفجوة. تقاطعات الفجوة هي لويحات من القنوات تقاطع الفجوة، والتي هي القنوات البروتينية التي شكلتها لرسو السفن وجها لوجه من اثنين connexin (CX) hemichannels من الخلايا المتجاورة 3،4 (الشكل 1). تقاطعات الفجوة تسمح بمرور الجزيئات الصغيرة إشارة ذات وزن جزيئي أقل من 1.5 كيلو دالتون، بما في ذلك كا 2 + 3 5 أو IP، مما تسبب في وتحوير كا 2 + الإفراج من المخازن داخل الخلايا من الخلايا المجاورة 6 (الشكل 2). قنوات تقاطع الفجوة وينظم بإحكام بواسطة البينية بين الجزيئات والتفاعلات البروتين والعمليات مما يشير الخلوية، مثل تعديل الأكسدة والفسفرة 7. GJS تسهيل الاستجابة المنسقة من الخلايا متصلة، فيعمل كمادة كيميائية ومخلى الكهربائية. على سبيل المثال، انتشار إمكانات العمل القلب عبر myocytes الأذيني البطيني ويتم بوساطة قنوات GJ المستندة إلى معادل 85. CXS يكن لديك سوى دور كقنوات تقاطع الفجوة، ولكن أيضا تشكيل hemichannels المفردة، وبالتالي تعمل كقنوات في الأغشية على نحو مماثل لقنوات ايون العادية 8-10 (الشكل 1). المشاركة Hemichannels في إشارة نظير الصماوي بين الخلايا المجاورة عن طريق التحكم في تبادل الأيونات والجزيئات يشير بين البيئة داخل وخارج الخلية.

في العديد من أنواع الخلايا (مثل الخلايا الظهارية وخلايا بانية للعظم، الخلايا النجمية والخلايا البطانية، وغيرها) وأجهزة (مثل الدماغ والكبد وشبكية العين، القوقعة والأوعية الدموية)، بين الخلايا كا 2 + موجات أساسية لتنسيق الاستجابات المتعددة الخلايا 2 + المستويات في خلية معينة لا تقتصر على هذه الخلية، ولكن تنتشر إلى الخلايا المجاورة المحيطة بها، وبالتالي إنشاء الكالسيوم بين الخلايا 2 + الموجة 12،13. هذه بين الخلايا كا 2 + موجات مهمة لتنظيم فسيولوجية طبيعية من طبقات الخلايا باعتبارها مخلى وارتبط التقلبات مع العمليات الفيزيولوجية المرضية 11. في بطانة القرنية وظهارة، مجموعات مختلفة 14-24، بما في ذلك منطقتنا 25-33، ودرس آليات وأدوار الاتصالات بين الخلايا. في الخلايا غير منفعل، مثل الخلايا البطانية القرنية، واثنين من وسائط مختلفة من الاتصالات بين الخلايا تحدث 28،29، وهي فجوة التواصل بين الخلايا صلي والاتصالات بين الخلايا نظير الصماوي. ينطوي على فجوة الاتصال بين الخلايا صلي على التبادل المباشر للجزيئات إشارة عبر الفجوة التقاطعات 7. الفجوة و Juncالاتصالات بين الخلايا tional أمر بالغ الأهمية للحفاظ على توازن الأنسجة، والسيطرة على تكاثر الخلايا، وإنشاء استجابة المتزامنة للإجهاد خارج الخلية 10،34،35. في عدد من الحالات المرضية، يتم تقليل الفجوة اقتران تقاطع بسبب CXS المعيبة، والتي تؤثر بهذا الفجوة صلي الاتصالات بين الخلايا 36. وهذا يؤكد أهمية وتأثير فجوة الاتصال بين الخلايا صلي في الكائنات متعددة الخلايا. وعلى النقيض من فجوة الاتصال بين الخلايا صلي والاتصالات بين الخلايا نظير الصماوي ليست متوقفة على بدل خلية خلية، لأنه ينطوي على الافراج عن رسل خارج الخلية إنتشاري (الشكل 2). يتم إطلاق أنواع مختلفة من الجزيئات يشير في الفضاء خارج الخلية عن طريق إشارات الخلايا. ثم يتم نقل جزيء إلى الخلية المستهدفة حيث يتم الكشف عنها بواسطة بروتين مستقبلات محددة. وفي وقت لاحق مجمع مستقبلات إشارة يؤدي الى استجابة الخلوية، التييتم إنهاء عن طريق إزالة إشارة، تعطيل أو إزالة التحسس. صدر محبة للدهون رسل إشارة خارج الخلية اختراق الغشاء وتعمل على مستقبلات الخلايا. في المقابل، رسل ماء لا عبور الغشاء البلازمي للخلية الاستجابة، ولكن بمثابة يجند التي تربط لسطح أعرب البروتينات المستقبلة، التي تتابع بعد ذلك إشارة إلى البيئة داخل الخلايا. ثلاث عائلات رئيسية من البروتينات مستقبلات سطح الخلية المشاركة في هذه العملية: ايون قناة مرتبطة، المرتبط بالإنزيم، وربط بروتين G. الجزيء رسول صدر يمكن أن تعمل على المستقبلات من نفس الخلية (autocrine)، على الخلايا المستهدفة على مقربة (نظير الصماوي)، أو على الخلايا المستهدفة البعيدة التي تتطلب نظام الدورة الدموية (الغدد الصماء).

في العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك بطانة القرنية 28،29، ATP هو واحد من عوامل نظير الصماوي ماء الرئيسية التي تدفع انتشار بين الخلايا كا 2 + موجات 37-40. الدرجي تشوه الميكانيكية، نقص الأكسجة، التهاب أو التحفيز من قبل وكلاء مختلف، ATP يمكن أن تنطلق من الخلايا السليمة 41-44 استجابة لإجهاد القص، وتمتد، أو ناضح تورم 44،45. وقد افترض آليات ATP-الافراج مختلفة، بما في ذلك إيماس حويصلي 44 وعدد كبير من آليات النقل، مثل راديو كاسيت ATP ملزم (ABC) الناقلون، قنوات أنيون التي تعتمد على الجهد البلازمي 46، P2X7 قنوات مستقبلات 47،48، وكذلك hemichannels connexin 49-52 وhemichannels pannexin 43،49،53. ATP خارج الخلية يمكن ان تحلل بسرعة إلى ADP، AMP والأدينوساين 54،55 من قبل ectonucleotidases التي تكون موجودة في البيئة خارج الخلية. سوف ATP صدر خارج الخلية والمستقلب ADP 56 ينتشر عن طريق نشرها. وقد تورط التفاعل اللاحقة من هذه النيوكليوتيدات مع مستقبلات purinergic في الخلايا المجاورة في عropagation من بين الخلايا كا 2 + موجات 28،37،51. فئتين مختلفتين من المستقبلات purinergic موجودة: الأدينوزين هو يجند الطبيعية الرئيسية لP1-purinoceptors، في حين أن كلا البيورين (ATP، ADP) وبيريميدين (UTP، UDP) النيوكليوتيدات تعمل على معظم P2-purinoceptors 57.

الاتصالات بين الخلايا يمكن التحقيق من قبل وسائل مختلفة مثل تحميل كشط، ونقل صبغ، uncaging المحلية من منبهات مثل IP 3 والكالسيوم 2 +، التحفيز الميكانيكي، الخ. نحن هنا وصف دراسة كا 2 + موجة الانتشار التي تسببها التحفيز الميكانيكي من خلية واحدة. الاستفادة من دراسة كا 2 + انتشار الموجة عن طريق التحفيز الميكانيكي هو أنه يوفر أداة سهلة لقياس انتشار كا 2 + الموجة مع مرور الوقت وأنه يسمح بمقارنة كميا المعالجة المسبقة مختلفة من الخلايا. في بطانة القرنية، وهذه كا 2 + بين الخلايا موجات تسمح لشركةاستجابة منسقة من أحادي الطبقة، وهو يتصرف بموجب كآلية دفاع ممكن من بطانة القرنية غير التجدد مساعدة البطانة على تحمل الضغوط خارج الخلية أثناء الجراحة داخل العين، أو عند التعرض للالتهابات وسطاء خلال الرفض المناعي أو التهاب القزحية 58،59.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. عزل الخلايا البطانية القرنية

قبل الشروع في العمل: عزل الخلايا من العيون العذبة، التي تم الحصول عليها من مسلخ المحلية، في أقرب وقت ممكن بعد enucleating العين. تأكد من أن العين كانت منزوعة النواة من بقرة القصوى 18 شهرا من العمر، خمس دقائق بعد الوفاة والحفاظ عليها في محلول الملح المتوازن ايرل - 1٪ محلول اليود عند 4 درجة مئوية لمدة النقل إلى المختبر.

  1. تأخذ العين من محلول الملح المتوازن وايرل - 1٪ محلول اليود ووضعه في طبق بيتري (100 × 20 مم).
  2. تعقيم العين مع محلول يحتوي على 70٪ من الإيثانول وشطف مع محلول الملح المتوازن ايرل تحتوي على 1٪ اليود.
  3. من هذه الخطوة على، والعمل في غطاء العقيمة. تشريح بعناية القرنية من العين ووضعه في طبق بتري (35 × 10 مم) التي تحتوي على محلول الملح المتوازن ايرل، مع طبقة الخلايا الظهارية التي تواجه التصاعدي. بعناية إزالة أي قزحية STI الأنسجة المتبقيةليرة لبنانية تعلق على القرنية إذا لزم الأمر.
  4. نقل القرنية لمحلول الملح المتوازن ايرل آخر تحتوي على طبق بيتري مع طبقة الخلايا البطانية التصاعدي وشطف مرتين مع محلول الملح المتوازن ايرل.
  5. نقل القرنية مع الطبقة البطانية التي تواجه التصاعدي إلى الرملية، وهو طبق على شكل كوب، وتغطية ذلك مع متوسط ​​النمو. يتكون المتوسطة نمو متوسطة Dulbecco في التعديل النسر يحتوي على 25 الجلوكوز ملي، و 10٪ مصل بقري جنيني، 6.6٪ L-الجلوتامين، 2.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين-B، و 1٪ خليط مضاد حيوي مضاد فطري تحتوي على 10،000 وحدة / مل من البنسلين، 10،000 ميكروغرام / مل من الستربتوميسين، و 25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B.
  6. إزالة المتوسطة مع ماصة الشفط.
  7. تطبيق 300 ميكرولتر من محلول التربسين (0.5 غرام / لتر) إلى الطبقة البطانية للقرنية (يتم الانتهاء من جميع الخطوات التي تشمل التربسين باستخدام نفس التركيز).
  8. وضع الساعة الرملية التي تحتوي على القرنية في طبق بيتري تغطيتها ووضعها في المؤتمر الوطني العراقيubator لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  9. كشط بلطف الخلايا البطانية بعيدا عن القرنية مع مصقول النار هوك على شكل الزجاج ماصة باستير في غطاء العقيمة.
  10. تمتص قبالة محلول يحتوي على الخلايا البطانية وإضافته إلى قوارير الثقافة (25 سم 2) تحتوي على 4 مل من مستنبت.
  11. تطبيق 300 ميكرولتر من متوسط ​​النمو إلى القرنية وتكرار تجريف وإضافة محلول يحتوي على الخلايا البطانية للقارورة الثقافة.
  12. كرر هذه الخطوة الأخيرة (1.11) مرة أخرى.
  13. وضع الثقافة قوارير تحتوي على الخلايا البطانية القرنية في متوسط ​​النمو في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  14. بعد يومين، إضافة 6 مل من مستنبت.
  15. تحديث المتوسطة النمو كل يوم الثاني.

2. الثقافة الخلية

  1. إزالة مستنبت وغسل الخلايا مرتين مع محلول الملح المتوازن ايرل، وعندما يتم التوصل confluency (داخل ابوT 10 أيام بعد العزلة).
  2. إضافة 1.5 مل من محلول التربسين إلى الخلايا لفصل بينها ووضع القارورة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لمدة 3 إلى 4 دقائق.
  3. إضافة 12 مل من وسط النمو. ماصة متوسطة ثلاث مرات الدخول والخروج لتفريق الخلايا وعدد الخلايا.
  4. بذور الخلايا مع جزء متغير تبعا لكثافة الخلايا ووضعها في الحاضنة. إعداد شريحتين جيدا حجرات (بمساحة 4.2 سم 2) مع عدد خلايا من خلايا 165،000 (39،286 كثافة الخلايا لكل سم 2). إعداد 80 سم 2 قوارير الثقافة لمرور جديدة في مناطق ذات كثافة من 6،250 لكل سم 2، وإضافة مستنبت الطازجة تصل إلى وحدة تخزين ما مجموعه 25 مل.
  5. تحديث المتوسطة كل يومين.
  6. يتم التوصل Confluency من طبقة الخلايا بعد 3 إلى 4 أيام. استخدام الخلايا لإجراء التجارب.
  7. عندما يتم التوصل confluency من طبقة الخلايا في قوارير، كرر الخطوات من 2،1-2،6. مزارع الخلايا يصل إلى مرور 2 يمكن استخدامها جمعةأو التجارب.

3. التحفيز الميكانيكي لإحداث موجة الكالسيوم

  1. تحميل الخلايا في الشريحة حجرات مع 10 ميكرومتر فلوو-4 صباحا في الفوسفات مخزنة المالحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حين تهز بلطف.
  2. إزالة فلوو-04:00 حل، وغسل الخلايا خمس مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة، احتضان الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة وترك الخلايا لمدة لا تقل عن 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل القياس.
  3. تثير في 488 نانومتر مع الأرجون ليزر واستخدام شعاع الخائن HFT 488، وجمع الانبعاثات مضان في 530 نانومتر باستخدام longpass الانبعاثات مرشح LP 505، تعيين الثقب في الحد الأدنى. استخدام الغمر 40X الهدف النفط (هواء، 1.2 NA). في التجارب مع ARL-67156، واستخدام الهدف 10X (هواء، 0.3 NA).
  4. بحث عن حقل في الخلايا التي هي متكدسة على المجهر متحد البؤر.
  5. موقف ماصة بحيث يكون في 45 درجة فيما يتعلق الشريحة حجرات ولمس غشاء الخلية.إثارة (≈ 1 ثانية) التحفيز الميكانيكي قصيرة إلى خلية واحدة. يتكون التحفيز الميكانيكي ل، تشوه قصيرة الأمد الحاد للخلية عن طريق لمس لفترة وجيزة أقل من 1٪ من غشاء الخلية مع micropipette الزجاج (قطر الحافة <1 ميكرون) بالإضافة إلى nanopositioner الكريستال كهرضغطية، تعمل من خلال مكبر للصوت الذي هو شنت على الصغرى مناور. مصنوعة بال micropipettes الزجاج مع ساحبة مسرى مكروي. تأكد من أن nanopositioner تشغلها الجهد بين 0.2 و 1.5 V خلال التحفيز الميكانيكي. A الجهد أعلى من 1.5 V يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا. لكل نوع من الخلايا وحالة، والجهد الأمثل لتحفيز الميكانيكية دون تلف الخلايا يجب أن تحدد بعناية من خلال تطبيق سلسلة من الفولتية المنخفضة بدءا من (0.2 V) على ارتفاع (1.5 V) الجهد. الجهد هو مقياس لقوة من التحفيز منذ هذا الجهد يحدد إجهاد والتوتر التي يتم تطبيقها على غشاء الخلية. الويمكن حساب قوة من التحفيز الميكانيكي عن طريق ضرب إجهاد ميكانيكي مع المنطقة. نظرا لأن كلا من منطقة (<3.14 ميكرون 2) والضغط الميكانيكية هي منخفضة جدا، وقوة من التحفيز الميكانيكي منخفضة. (لاحظ أنه عند تلف خلية، التسريبات مضان الخروج من الخلية والخلية يتحول الظلام.)
  6. قياس التغيرات المكانية في [كا 2 +] ط أعقاب التحفيز الميكانيكي مع المجهر متحد البؤر.
  7. جمع وتخزين الصور.
  8. رسم المنطقة المضلعة من مصلحة لتحديد مساحة السطح الكلي للخلايا مستجيبة (منطقة نشطة، AA) باستخدام البرنامج من المجهر متحد البؤر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم تنفيذ جميع التجارب في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية واللوائح والوكالات التنظيمية ذات الصلة، ويتم تنفيذ بروتوكول يتم شرحها تحت إشراف وموافقة ورعاية الحيوان واللجنة الاستخدام من جامعة لوفين الكاثوليكية.

في الأبقار الخلايا البطانية القرنية (BCEC)، يتم التعبير عن تقاطعات الفجوة الوظيفية وكلا الفجوة صلي الاتصالات بين الخلايا والاتصالات بين الخلايا نظير الصماوي تسهم إسهاما كبيرا في التواصل بين الخلايا بطريقة تفاعلية، ولكن ثبت المسار الرئيسي ليكون نظير الصماوي بين الخلايا مسار الاتصالات بوساطة الإفراج ATP من خلال hemichannels المستندة إلى Cx43 28،29. ATP وADP هي تحلل إلى الأدينوساين أحادي (AMP) من قبل ectonucleotidase E-NTPD1 (ectonucleoside ثلاثي الفوسفات diphosphohydrolase 1، CD39 ATP diphosphohydrolase)، وبعد ذلك إلى الأدينوساين من قبل 5'-ectonucleotidase CD73 28،29. ATP ADP والمساهمة فيكا 2 + انتشار الموجة عن طريق الربط بين P2Y1 وP2Y2 المستقبلات 28،29. كلا الزوجين على المستقبلات PLC عبر جي كيو وبالتالي استحضار IP 3 الناجم عن كا 2 + الافراج عن (الشكل 2). في BCEC، وتحفيز المستقبلات P2Y purinergic النتائج إلى زيادة سريعة في [كا 2 +] ط، والذي هو غير حساس لإزالة [كا 2 +] س 60. [كا 2 +] ط يتم اتباع القمم التي حركها التحفيز ناهض من قبل [كا 2 +] ط الانخفاض الذي يمكن أن يؤدي إلى مستقر، والارتفاع التي تعتمد على ناهض، [كا 2 +] تقلبات متذبذبة O-تعتمد، أو العودة إلى خط الأساس 60-62. في BCEC، كان هناك دليل على أن كا 2 + الإفراج يحدث عبر مسار تنطوي على PLC وIP 3 29. تفريغ مخازن حساسة 3 IP يؤدي إلى الذروة الأولية في [كا 2 +] ط، تليها في وقت لاحق من قبل CApacitative كا 2 +-تدفق مما يؤدي إلى بداية مرحلة الهضبة 63.

التحفيز الميكانيكي يؤدي إلى ارتفاع الأولية السريعة في كا 2 + التي تنبع من وجهة تحفيز ومن ثم ينتشر في جميع أنحاء الخلية حفز ميكانيكيا. وأخيرا، فإن الكالسيوم داخل الخلايا 2 + المستويات يقلل ببطء مرة أخرى إلى مستوى خط الأساس. عند الوصول إلى حدود الخلية، وبين الخلايا كا 2 + الموجة ينتشر إلى الخلايا المحيطة المجاورة (NB) بطريقة تشبه الموجة باعتباره كا 2 +-عابرة، والذى يضمحل إلى مستوى القاعدية (الشكل 3). في ظروف السيطرة، وكا 2 لاحظ +-العابرين تصل إلى ما يقرب من 4 إلى 8 طبقات الخلية بعيدا عن الخلية حفز ميكانيكيا (الشكل 3). ويبين الرسم البياني خط (في الجانب الأيمن من لوحات في الشكل 3) دورة وقت كا 2 +-العابرين (ممثلة على النحو مضان (NF) القيم تطبيع) فيالخلية ميكانيكيا وحفز في طبقات الخلية المجاورة 1-5 (NB1، NB2، NB3، NB4 وNB5). من الشكل (3)، فمن الواضح أن انخفاض مضان تطبيع، في حين أن تأخير الوقت لظهور [كا 2 +] ط زيادة الارتفاع مع زيادة المسافة من خلية حفز ميكانيكيا. تم التوصل إلى تطبيع مضان القصوى في الخلية ميكانيكيا في حفز 0.95 ± 0.04 ثانية. بعد التوصل إلى أقصى قيمة مضان تطبيع، أظهرت مضان تطبيع انخفاض تدريجي جدا وبطيئة، والعودة إلى القيمة القاعدية 152 ± 6 ثوانى بعد تطبيق التحفيز 25.

تسبب تثبيط نظير الصماوي بين الخلايا مسار الاتصالات باستخدام مزيج من الخارجية آبيراز السادس (5 U / مل لمدة 30 دقيقة) وآبيراز السابع (5 U / مل لمدة 30 دقيقة) انخفاضا 7.5 أضعاف في المنطقة التي تغطيها كا 2 + الموجة، ما يسمى منطقة نشطة (AA، P <0.001؛ N = 7، ن = 35) (الشكل 4A). ومن المعروف آبيراز ليتحلل ATP وADP. آبيراز السادس لديه أتباز / ADPase نسبة عالية وآبيراز السابع تفضيلي hydrolyzes ADP 56.

منذ الاتصالات بين الخلايا نظير الصماوي في بطانة القرنية يحدث إلى حد كبير من خلال ATP الإفراج عنهم، 28،29 وATP هو تحلل في الفضاء خارج الخلية بواسطة ectonucleotidases، من المعروف أن أعرب في بطانة القرنية، 29،64،65 ونحن التحقيق في تأثير على AA في ظروف حيث هو تحول دون ATP المائي باستخدام مثبطات ectonucleotidase. أسفرت عن تعزيز قوي للكا 2 + انتشار الموجة، كما تبين سابقا في BCEC 25،26،28،29؛ تثبيط ectonucleotidases مع ARL-67156 (100 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة ARL). تسبب في تعرض BCEC إلى ARL زيادة 3.5 أضعاف من AA مقارنة للسيطرة على الأوضاع (P <0.001؛ N = 12، ن = 60) (الشكل 4B).

في مرحلة ما قبلواستخدمت دراسات vious في المختبر لدينا، connexin الببتيدات المحاكاة (Gap26 وGap27، الجدول 2) للتمييز بين المساهمات النسبية للفجوة التواصل بين الخلايا صلي والاتصالات بين الخلايا نظير الصماوي إلى بين الخلايا كا 2 + انتشار الموجة في أعقاب التحفيز الميكانيكي، مع الببتيد غير فعال ( الجدول 2) كعنصر تحكم 28،29.

تثبيط قنوات تقاطع الفجوة مع Gap27 انخفضت بشكل ملحوظ في انتشار كا 2 + الموجة في BCEC 30. تم تخفيض AA كبير على المعالجة مع Gap27 (300 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة) (P <0.001؛ N = 8، ن = 40) 25 (الجدول 1). تثبيط hemichannels connexin مع الببتيد connexin-المحاكاة Gap26 28،30 خفض كبير في انتشار كا 2 + الموجة في BCEC 28. تم تخفيض AA كبير على المعالجة مع Gap26 (300 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة)(P <0.001؛ N = 8، ن = 40) 25 (الجدول 1).

أظهرنا أيضا أن 43 كيلو دالتون معادل الإسوي كان العنصر الرئيسي وراء إطلاق سراح ATP hemichannel بوساطة أن يثير بين الخلايا كا 2 + موجات. باستخدام اثنين من جزيئات سيرنا مصممة بشكل مستقل استهداف Cx43، وجدنا أن AA انخفض بنسبة حوالي 65٪ 33 (الجدول 1). استند هذا مزيدا من التجارب باستخدام TAT-L2 (100 ميكرومتر، 30 دقيقة)، والببتيد خلية قابلة للاختراق الموافق النصف الثاني من الحلقة داخل الخلايا من Cx43 (الجدول 2)، والذي أثار انخفاض كبير في AA (P <0.001 ؛ N = 3، ن = 30) (الجدول 1). الأهم من ذلك، لم يكن لوحظ هذا الانخفاض في AA من قبل TAT-L2 الحضانة في حالة عدم وجود إشارات نظير الصماوي، ودعم مفهوم أن TAT-L2 يثبط بشكل انتقائي hemichannels المستندة إلى Cx43 لكن لا قنوات تقاطع الفجوة 33. وعلاوة على ذلك، وهو غير نشط TAT-L2 متحولة (TAT-L2 H126K/I130N) يمكن استخدامها كعنصر تحكم (الجدول 2).

الشكل 1
الشكل 1. تشكيل قنوات تقاطع الفجوة وhemichannels: التمثيل التخطيطي. يتم تشكيل A. A connexin أو pannexin hemichannel عندما يتم ترتيب ستة connexins أو pannexins، والتي هي البروتينات التي تحتوي على أربع عبر الغشاء المجال، شعاعيا حول المسام المركزية. وتقع Hemichannels في غشاء البلازما. ويمكن أن تتكون من البروتين فرعية متطابقة (hemichannels homomeric) أو أنها يمكن أن تتكون من البروتين أنواع فرعية مختلفة، عندما يتم التعبير عن اثنين أو أكثر من الأشكال الإسوية في نفس الخلية (hemichannels مغايرة التغصن). هناك فجوة مثلي النمط قناة تقاطع ينتج عن التحام اثنين homomeric مطابقة أو hemichannels مغايرة التغصن. A تقاطع الفجوة غيروي النتائج القناة من دocking من قناتين homomeric أو مغايرة التغصن مختلفة. B. هيكل تخطيطي من connexin وpannexin قنوات تقاطع الفجوة ربط اثنين من الخلايا المجاورة وhemichannels.

(معدلة جزئيا من 66)

تم نشر هذا الرقم أصلا في BioEssays. Catheleyne D'هونت، Ponsaerts راف، همبرت دي سميدت، جيرت Bultynck، وبرنارد Himpens. Pannexins، أقارب من عائلة connexin مع الوظائف الخلوية محددة. BioEssays. 2009، 31، 953-974 (2009). BioEssays. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. في الخلايا غير منفعل، وفيtercellular كا 2 + انتشار الموجة ينطوي على حد سواء الفجوة صلي الاتصالات بين الخلايا والاتصالات بين الخلايا نظير الصماوي. عند التحفيز الميكانيكي من خلية واحدة، كا 2 + يحدث الارتفاع في الخلية حفز ميكانيكيا (MS) عن طريق كا 2 +-تدفق و / أو كا 2 + الإفراج. وفي وقت لاحق، وينتشر كا 2 + الارتفاع من حفز ميكانيكيا إلى الخلايا المجاورة (NB) باعتبارها كا 2 + الموجة بين الخلايا. نشر بين الخلايا ينطوي على آليتين، هما فجوة الاتصال بين الخلايا صلي والاتصالات بين الخلايا نظير الصماوي. في فجوة الاتصال بين الخلايا صلي والتبادل المباشر للوسيط (IP 3 و / أو كا 2 +) ويحدث بين cytoplasms من الخلايا المجاورة عبر تقاطعات الفجوة (GJS). في التواصل بين الخلايا نظير الصماوي، ويتم تحريرها رسولا (مثل ATP) في الفضاء خارج الخلية، وبالتالي تعمل على المستقبلات الموجودة على ال(ه) من سطح الخلايا المجاورة. Hemichannels (HCS) أو غيرها من الآليات توسط هذا الإصدار ATP (انظر النص). Ectonucleotidases يتحلل ATP إلى ADP وAMP. ATP ADP وقانون P2Y و / أو مستقبلات P2X على الخلايا المجاورة. (مأخوذة من 66.)

تم نشر هذا الرقم أصلا في BioEssays. Catheleyne D'هونت، Ponsaerts راف، همبرت دي سميدت، جيرت Bultynck، وبرنارد Himpens. Pannexins، أقارب من عائلة connexin مع الوظائف الخلوية محددة. BioEssays. عام 2009. 31، 953-974 (2009). BioEssays.

الشكل (3)
الشكل (3). وتظهر الكالسيوم انتشار الموجات في الظروف تحكم في BCEC. الميكانيكية التحفيز العابرين الكالسيوم التي يسببها في مختلف نقاط وقت في ظروف التحكم في BCEC بواسطة الصور مضان الزائفة الملونة ممثل. وfluoreوتظهر شدة مسرح الحادث قبل التحفيز في الصورة الأولى. السهم الأبيض في الصورة الثانية ويحدد الخلية حفز ميكانيكيا. موجة الكالسيوم يكاثر إلى ستة طبقات الخلايا المجاورة مع مساحة إجمالية قدرها الخلايا التي توصل إليها موجة (منطقة نشطة: AA) من 62870 ميكرون 2.

اللوحة اليمنى مع الرسوم البيانية خط يبين مدار الساعة من قيمة تطبيع مضان (NF) في الخلية حفز ميكانيكيا (MS) ومتوسط ​​قيمة NF في الخلايا المجاورة (NB) طبقات 1-5 (NB1 إلى NB5). (معدلة جزئيا من 25.)

تم نشر هذا الرقم أصلا في طب وجراحة العيون والعلوم البصرية التحقيق. Catheleyne D'هونت، راف Ponsaerts، Sangly P سرينيفاس، يوهان VEREECKE، وبرنارد Himpens. الثرومبين يكبح انتشار الموجات بين الخلايا الكالسيوم في الخلايا البطانية القرنية بواسطة التشكيل من hemichannels وتقاطعات الفجوة. الاستثمار. Ophthalmol. فيس. اصابات النخاع الشوكي. عام 2007. طب وجراحة العيون والعلوم البصرية التحقيق.

الشكل 4
الشكل 4. تغييرات كبيرة في انتشار بين الخلايا كا 2 + موجات بعد العلاج مع nucleotidases الخارجية (يسار) ومع مثبطات ectonucleotidase (يمين) في BCEC. A. انخفاض كبير في AA بعد العلاج من BCEC مع apyrases الخارجية (آبيراز السادس (5 U / مل)، وآبيراز السابع (5 U / مل) لمدة 30 دقيقة) الذي يتحلل ATP ADP و، مما يعوق بموجبه نظير الصماوي بين الخلايا مسار الاتصالات (N = 7، ن = 35). * يدل P <0.001 في وجود مقابل غياب آبيراز B. زيادة كبيرة في AA بعد العلاج من BCEC مع مثبط انتقائي ectonucleotidase ARL-67156 (ARL و 100 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة).، هيربي enhancinز نظير الصماوي مسار الاتصالات بين الخلايا (N = 12، ن = 60). * يدل P <0.001 في وجود مقابل غياب ARL.

AA تطبيع ش الخطأ N ن إحصائيات
السيطرة 100 8.31 3 30
siScramble 87.97 9.3 3 30
siCx43-1 32.45 8.23 3 30 *
siCx43-2 35.49 7.06 3 30 *
السيطرة الببتيد 91.68 6.5 8 40
فجوة 26 46.67 4.24 8 40 *
فجوة 27 53 4.76 8 40 *
TAT-L2 6.99 0.71 3 30 *

الجدول 1. تأثير جزيئات سيرنا استهداف Cx43، connexin الببتيدات المحاكاة والببتيد خلية قابلة للاختراق TAT-L2 على المنطقة تطبيع نشط (AA) في BCEC.
N يمثل عدد أيام من التجارب، N يمثل عدد من التحفيز الميكانيكي. * يدل P <0.001 بالمقارنة مع ظروف السيطرة.

<TR>
تسلسل AA
السيطرة الببتيد SRGGEKNVFIV
Gap26 VCYDKSFPISHVR
Gap27 SRPTEKTIFII
TAT-L2 YGRKKRRQRRR-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK
TAT-L2H126K/I130N YGRKKRRQRRR-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK
10Panx1 WRQAAFVDSY

الجدول 2. سلاسل الأحماض الأمينية من الببتيدات المستخدمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا المخطوط، ونحن تصف طريقة بسيطة لقياس بين الخلايا كا 2 + انتشار الموجة في الطبقات الوحيدة من الأبقار الخلايا البطانية القرنية الأولية عن طريق توفير التحفيز الميكانيكي المترجمة والتي تسيطر عليها باستخدام micropipette. الخلايا حفز ميكانيكيا الاستجابة مع زيادة المحلية في مجال الملكية الفكرية داخل الخلايا 3 والكالسيوم 2 +، وكلاهما جزيئات إشارات بين الخلايا الأساسية التي تدفع بين الخلايا كا 2 + موجة انتشار 11،67. IP 3 يتم نقل مباشرة إلى الخلايا المجاورة عبر قنوات تقاطع الفجوة 5، بينما كا 2 + يثير افتتاح hemichannels والإفراج عن ATP 68،69، التي يطلق كا 2 + إشارات في الخلايا المجاورة من خلال تفعيل البروتين يقترن G-P2 المستقبلات 37-40. ويمكن وصف المساهمة النسبية للقنوات تقاطع الفجوة وhemichannels في هذه العملية عن طريق استخدام المحاكاة CX-الببتيدات، والانزيمات ATP-المهينة (ectonucleotidases) ومثبطات ectonucleotisdases. خصائص ميكانيكية التحفيز التي يسببها بين الخلايا كا 2 + انتشار الموجة في الأبقار الخلايا البطانية القرنية اتسمت بدقة في مختبرنا 25-33. تشير نتائجنا إلى أن بين الخلايا كا 2 + انتشار الموجة مدفوعة أساسا عن طريق إطلاق CX-hemichannel بوساطة من ATP، مع Cx43 لعب دورا بارزا. على هذا النحو، وهذه الطريقة تطبق على الأبقار الخلايا البطانية القرنية الأساسي هو مناسبة خاصة لتحديد أو توصيف تنظيم Cx43 hemichannels على المستويات المحلية في الخلايا الأصلية. باستخدام هذا الأسلوب، وقد وجدنا أن نشاط Cx43 hemichannels يتم التحكم حاسمة من قبل الهيكل الخلوي أكتوميوزين، والتي قد تكون بمثابة الفرامل الذاتية منع المفرط، وبالتالي مؤذية، Cx43 hemichannel افتتاح 25،31،32. نحن كذلك توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا التنظيم والعثور علىدورا هاما من داخل الجزيء التفاعلات حلقة / الذيل التي لا غنى عنها لافتتاح Cx43 hemichannels 33.

ومن الواضح أن هذا النظام هو مناسبة جدا لدراسة وظيفة من القنوات تقاطع الفجوة معادل والمستندة إلى Panx وhemichannels وبالتأكيد لا تقتصر على الأبقار الخلايا البطانية القرنية ولكن قابلة للتكيف مع الواقع أي نوع من الخلايا والأنسجة أيضا أكثر تعقيدا، كما لم تظهر في الدماغ حيث أثار التحفيز الميكانيكي بين الخلايا كا 2 + كبير موجات تشمل نصف الكرة الأرضية بأكمله 70. أدوات مختلفة موجودة لتقييم مساهمة القنوات وhemichannels تقاطع الفجوة، بما في ذلك الببتيدات CX-المحاكاة، والانزيمات ATP-المهينة، مثبطات ectonucleotidases والمركبات الدوائية مثل كربينوكسولون و 10 Panx1 (الجدول 2) 49،50. لتحديد مساهمة معينة أو معادل Panx الإسوي في هذه العملية، تحقيقات سيرنا مصممة بعناية رargeting منطقتين مستقلة عن مرنا والتحكم المخفوق ينبغي استخدامها. وينبغي أن تحدد مدى ضربة قاضية في مستوى البروتين الكلي باستخدام-النشاف الغربية المقايسات ومستوى خلية واحدة باستخدام المجهر الفلورسنت. وينبغي تقييم كفاءة ترنسفكأيشن من تحقيقات سيرنا في الخلية monolayers تجريبية بواسطة المجهر الفلورسنت. لهذا، يمكن للمرء وضع سيرنا دوبلكس في التي أدمجت تسمية الفلورسنت في نهاية 3 'من ضفيرة معنى. ومن المهم أن نلاحظ أن للتحليل السليم، تخفيض بارز في معادل أو Panx الإسوي (> تخفيض 90٪)، فضلا عن ترنسفكأيشن متجانسة من دوبلكسات سيرنا في أحادي الطبقة الخلية (> 90٪ من الخلايا transfected مع سيرنا مسبار) ينبغي الحصول عليها. ينبغي تقييم الانتقائية للتحقيقات سيرنا مصممة نحو تحقيق هدف 71. وباختصار، ينبغي التحقق من صحة هذه الأدوات بحيث لا تؤثر على التعبير عن معادل أو غيرها من الأشكال الإسوية Panx أو غيرها كوم الرئيسية* مكونات القيادة بين الخلايا كا 2 + موجات، مثل P2X أو P2Y المستقبلات. لتقييم مساهمة Cx43 hemichannels، لدينا تعاون مع مختبر الدكتور Leybaert في تطوير الببتيد خلية قابلة للاختراق الموافق النصف الثاني من الحلقة داخل الخلايا من Cx43 (TAT-L2) التي تعمل بمثابة انتقائية، المانع من امكانات Cx43 hemichannels مع الحفاظ على Cx43 الفجوة تقاطع نشاط قناة 33. في دراساتنا، ونحن نستخدم 100 ميكرومتر TAT-L2 للحصول على تثبيط كامل للCx43 hemichannels، ولكن تركيزات أقل قد تكون كافية 72. ينصح TAT-L2H126K/I130N كعنصر تحكم السلبية 73. لتقييم مساهمة Panx1 القنوات، يمكن تطبيق الببتيد 10Panx1. هذه الأدوات ليست مهمة فقط لاستبعاد البلازما تعطيل غشاء (انظر أدناه)، ولكن أيضا لإثبات أن نظير الصماوي ATP يتوسط يشير آليات بين الخلايا كا 2 + انتشار الموجة التي كتبها hemichannels وليس عن طريق آليات أخرى (مثل مقنوات AXI-أنيون أو الإفراج عن الحويصلات المحتوية على ATP-). أخيرا، وكما لجميع الدراسات التي تستخدم الخلايا الأولية، يجب على الظروف ثقافة الخلية وعدد من المقاطع تكون موحدة، كما الخصائص البيولوجية للخلايا وبالتالي قد تغيير الوضع التعبير عن مختلف معادل والإسوية Panx مع مرور الوقت 26.

ومع ذلك، هناك عدد من المآخذ على هذه الطريقة. والعيب الرئيسي لهذه الطريقة أن التحفيز الميكانيكي قد تؤدي إلى اضطراب غشاء البلازما، مما أدى إلى دخول الخلية كا 2 + والإفراج عن الجزيئات يشير مثل ATP، وكلاهما تكمن وراء حسن النية بين الخلايا كا 2 + موجة الانتشار 11. هذا يعقد بالتأكيد التحليل (كمي) من الكالسيوم بين الخلايا 2 + الموجة. ولذلك، فمن المستحسن جدا أن واحدة ينبغي ط) استخدام الضوابط المناسبة، أي خطوط الخلايا التي تفتقر إلى التعبير عن معادل أو الإسوية Panx، والأدوات التي الأسواق العالمية ضغطهاrfere مع وظيفة معادل وPanx كقنوات الفجوة مفرق و / أو hemichannels والثاني) توحيد إجراءات التحفيز الميكانيكي (تأكد أنه خلال التحفيز الميكانيكي يتم تشغيل nanopositioner من الجهد ما بين 0.5 و 2 V).

وعلاوة على ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن هذا الأسلوب لا يقف في حد ذاته، ولكن ينبغي أن ترتكز على نهج تجريبية إضافية لدراسة قنوات معادل وPanx. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الزيادة المحلية من الجزيئات داخل الخلايا مما يشير أن تشارك في آلية التحفيز بوساطة بين الخلايا كا 2 + انتشار الموجة، مثل uncaging الملكية الفكرية داخل الخلايا 3 أو كا 2 + 11،74. لبدء بين الخلايا كا 2 + الموجة مستقلة من التحفيز الميكانيكي، يمكن للمرء استخدام الحقن الصغيرة، مثل المؤتلف باكس الموالية لأفكارك 11،75 والصور activatable كا 2 +-مخازن مثل ديازو 2 أن يؤدي إلى انخفاض المحلية في خارج الخلية [كا 2 + 76، مشغل معروف لفتح hemichannel. بدلا من ذلك، يمكن للمرء استخدام electroporation الموقع من جزيئات إشارة الخلية كتيمة في أن تؤدي الخلايا كا 2 + الإصدار وبين الخلايا كا 2 + موجات، مثل IP 3 67،68. يتم استخدام الأسلوب الأخير أيضا للتحقيق في انتشار موت الخلية 5،77. وتوفر هذه المحفزات غير الميكانيكية إجراء تقييم أفضل من التحفيز كثافة والاستجابة. وبالإضافة إلى هذه الأساليب 2 + انتشار الموجة الكالسيوم، فمن المهم لتحديد النشاط من القنوات معادل أو Panx باستخدام المناهج الأخرى، بما في ذلك تحديد ماء امتصاص الصبغة (مثل لوسيفر الأصفر) 78 والإفراج عن ATP ليس فقط في ردا على التحفيز الميكانيكي ولكن أيضا في الاستجابة إلى خارج الخلية كا 2 +-مخازن (مثل EGTA) وبين الخلايا كا 2 + الافراج عن جزيئات (مثل كا 2 +-A23187 حامل الأيون) 11،74. وبالإضافة إلى ذلك، رانه خير دليل لتنظيم على مستوى القناة يتم توفيرها من قبل التجارب الكهربية، إما نظم المشبك الجهد المزدوج أو المشبك مسار كامل الخلية من البويضات القيطم حقنوا معادل أو Panx مرنا أو من خلايا هيلا معربا عن ectopically الإسوية معادل معا مع علامة مثل GFP 79-84.

وفي الختام، واستخدام التحفيز الميكانيكي لإحداث بين الخلايا كا 2 + موجات يوفر طريقة بسيطة وموثوق بها للتحقيق الاتصال بين الخلايا ودراسة مساهمة وخصائص القنوات معادل وPanx.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد أعمال البحث التي أجريت في المختبر من المنح المقدمة من مؤسسة أبحاث - فلاندرز (FWO؛ أرقام منحة G.0545.08 وG.0298.11)، وبين الجامعات الجذب برنامج البولنديين (سياسة العلوم البلجيكي؛ منح عدد P6/28 وP7/13) ومضمن في الأوساط البحثية FWO المدعومة. CDH هو زميل ما بعد الدكتوراه من مؤسسة البحوث - فلاندرز (FWO). المؤلفون ممتنون جدا لجميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر الجزيئية والخلوية اشارة (جامعة لوفين الكاثوليكية)، د. SP سرينيفاس (مدرسة جامعة إنديانا في علم البصريات، الولايات المتحدة الأمريكية)، ومختبر الدكتور Leybaert (جامعة غنت) ولل د. Vinken (VUB) الذين قدموا مناقشات مفيدة، إلى أقصى حد أو الإجراءات شاركوا في تطوير أدوات لدراسة hemichannels connexin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14155-048
Iodine Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) 38060-1EA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 11960-044
L-glutamine (Glutamax) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 35050-038
Amphotericin-B Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A2942
Antibiotic-antimycotic mixture Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 15240-096
Trypsin Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 25300-054
Dulbecco's PBS Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14190-091
Fluo-4 AM Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A265
Apyrase VI Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6410
Apyrase VII Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR) Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII) Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV) Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark) 155380
Confocal microscope Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany) LSM510
Piez–lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner) PI Polytech (Karlsruhe, Germany) P-280
HVPZT-amplifier PI Polytech (Karlsruhe, Germany) E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter) World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA 4878
Micr–lectrode puller Zeitz Instrumente (Munchen, Germany) WZ DMZ-Universal Puller

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18, 592-600 (2006).
  2. Mese, G., Richard, G., White, T. W. Gap junctions: basic structure and function. J. Invest. Dermatol. 127, 2516-2524 (2007).
  3. Bruzzone, R., White, T. W., Paul, D. L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur. J. Biochem. 238, 1-27 (1996).
  4. White, T. W., Bruzzone, R., Paul, D. L. The connexin family of intercellular channel forming proteins. Kidney Int. 48, 1148-1157 (1995).
  5. Decrock, E., et al. Connexin-related signaling in cell death: to live or let die? Cell Death Differ. 16, 524-536 (2009).
  6. Herve, J. C. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 1-4 (2007).
  7. Herve, J. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Duffy, H. S. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 29-65 (2007).
  8. Bruzzone, R., Barbe, M. T., Jakob, N. J., Monyer, H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem. 92, 1033-1043 (2005).
  9. Ebihara, L., Steiner, E. Properties of a nonjunctional current expressed from a rat connexin46 cDNA in Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. 102, 59-74 (1993).
  10. Evans, W. H., De Vuyst, E., Leybaert, L. The gap junction cellular internet: connexin hemichannels enter the signalling limelight. Biochem. J. 397, 1-14 (2006).
  11. Leybaert, L., Sanderson, M. J. Intercellular Ca2+ waves: mechanisms and function. Physiol. Rev. 92, 1359-1392 (2012).
  12. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intracellular Ca2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  13. Himpens, B., Stalmans, P., Gomez, P., Malfait, M., Vereecke, J. Intra- and intercellular Ca2+ signaling in retinal pigment epithelial cells during mechanical stimulation. Faseb J. 13, 63-68 (1999).
  14. Williams, K. K., Watsky, M. A. Bicarbonate promotes dye coupling in the epithelium and endothelium of the rabbit cornea. Curr. Eye Res. 28, 109-120 (2004).
  15. Hernandez Galindo, E. E., Theiss, C., Steuhl, K. P., Meller, D. Gap junctional communication in microinjected human limbal and peripheral corneal epithelial cells cultured on intact amniotic membrane. Exp Eye Res. 76, 303-314 (2003).
  16. Williams, K., Watsky, M. Gap junctional communication in the human corneal endothelium and epithelium. Curr. Eye Res. 25, 29-36 (2002).
  17. Anderson, S. C., Stone, C., Tkach, L., SundarRaj, N. Rho and Rho-kinase (ROCK) signaling in adherens and gap junction assembly in corneal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43, 978-986 (2002).
  18. Joyce, N. C., Harris, D. L., Zieske, J. D. Mitotic inhibition of corneal endothelium in neonatal rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2572-2583 (1998).
  19. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Trinkaus-Randall, V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  20. Klepeis, V. E., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randall, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. J. Cell Sci. 114, 4185-4195 (2001).
  21. Laux-Fenton, W. T., Donaldson, P. J., Kistler, J., Green, C. R. Connexin expression patterns in the rat cornea: molecular evidence for communication compartments. Cornea. 22, 457-464 (2003).
  22. Rae, J. L., Lewno, A. W., Cooper, K., Gates, P. Dye and electrical coupling between cells of the rabbit corneal endothelium. Curr. Eye Res. 8, 859-869 (1989).
  23. Watsky, M. A., Rae, J. L. Dye coupling in the corneal endothelium: effects of ouabain and extracellular calcium removal. Cell Tissue Res. 269, 57-63 (1992).
  24. Williams, K. K., Watsky, M. A. Dye spread through gap junctions in the corneal epithelium of the rabbit. Curr. Eye Res. 16, 445-452 (1997).
  25. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Thrombin inhibits intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells by modulation of hemichannels and gap junctions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 120-133 (2007).
  26. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Reduced intercellular communication and altered morphology of bovine corneal endothelial cells with prolonged time in cell culture. Curr. Eye Res. 34, 454-465 (2009).
  27. D'hondt, C., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Adenosine Opposes Thrombin-Induced Inhibition of Intercellular Calcium Wave in Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 1518-1527 (2007).
  28. Gomes, P., Srinivas, S. P., Van Driessche, W., Vereecke, J., Himpens, B. ATP release through connexin hemichannels in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1208-1218 (2005).
  29. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. ATP-dependent paracrine intercellular communication in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 104-113 (2005).
  30. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Gap junctional intercellular communication in bovine corneal endothelial cells. Exp Eye Res. , (2006).
  31. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4816-4827 (2008).
  32. Ponsaerts, R., et al. RhoA GTPase Switch Controls Cx43-Hemichannel Activity through the Contractile System. PLoS ONE. 7, e42074 (2012).
  33. Ponsaerts, R., et al. Intramolecular loop/tail interactions are essential for connexin 43-hemichannel activity. Faseb J. 24, 4378-4395 (2010).
  34. Charles, A. Reaching out beyond the synapse: glial intercellular waves coordinate metabolism. Sci STKE. 2005, pe6 (2005).
  35. Laird, D. W. Life cycle of connexins in health and disease. Biochem. J. 394, 527-543 (2006).
  36. Kelsell, D. P., Dunlop, J., Hodgins, M. B. Human diseases: clues to cracking the connexin code. Trends Cell Biol. 11, 2-6 (2001).
  37. Pearson, R. A., Dale, N., Llaudet, E., Mobbs, P. ATP released via gap junction hemichannels from the pigment epithelium regulates neural retinal progenitor proliferation. Neuron. 46, 731-744 (2005).
  38. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Randall, V. T. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  39. Cotrina, M. L., Lin, J. H., Lopez-Garcia, J. C., Naus, C. C., Nedergaard, M. ATP-mediated glia signaling. J. Neurosci. 20, 2835-2844 (2000).
  40. Burnstock, G., Williams, M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic potential. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 862-869 (2000).
  41. Schwiebert, E. M., Zsembery, A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. Biochim. Biophys Acta. 1615, 7-32 (2003).
  42. Lazarowski, E. R., Boucher, R. C., Harden, T. K. Mechanisms of release of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol. Pharmacol. 64, 785-795 (2003).
  43. Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol. 265, C577-C606 (1993).
  44. Blair, S. A., Kane, S. V., Clayburgh, D. R., Turner, J. R. Epithelial myosin light chain kinase expression and activity are upregulated in inflammatory bowel disease. Lab. Invest. 86, 191-201 (2006).
  45. Boudreault, F., Grygorczyk, R. Cell swelling-induced ATP release and gadolinium-sensitive channels. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C219-C226 (2002).
  46. Romanov, R. A., Rogachevskaja, O. A., Khokhlov, A. A., Kolesnikov, S. S. Voltage dependence of ATP secretion in mammalian taste cells. J. Gen. Physiol. 132, 731-744 (2008).
  47. Pelegrin, P., Surprenant, A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. Embo J. 25, 5071-5082 (2006).
  48. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272, 735-738 (1996).
  49. D'hondt, C., et al. Pannexin channels in ATP release and beyond: an unexpected rendezvous at the endoplasmic reticulum. Cell Signal. 23, 305-316 (2011).
  50. Leybaert, L., et al. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. Cell Commun. Adhes. 10, 251-257 (2003).
  51. Stout, C. E., Costantin, J. L., Naus, C. C., Charles, A. C. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J. Biol. Chem. 277, 10482-10488 (2002).
  52. Verma, V., Hallett, M. B., Leybaert, L., Martin, P. E., Howard Evans, W. Perturbing plasma membrane hemichannels attenuates calcium signalling in cardiac cells and HeLa cells expressing connexins. Eur. J. Cell Biol. , (2008).
  53. Pharmacol, B. rJ. 147, S172-S181 (2006).
  54. Slakey, L. L., Gordon, E. L., Pearson, J. D. A comparison of ectonucleotidase activities on vascular endothelial and smooth muscle cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 603, 366-378 (1990).
  55. Gordon, E. L., Pearson, J. D., Slakey, L. L. The hydrolysis of extracellular adenine nucleotides by cultured endothelial cells from pig aorta. Feed-forward inhibition of adenosine production at the cell surface. J. Biol. Chem. 261, 15496-15507 (1986).
  56. Moerenhout, M., Himpens, B., Vereecke, J. Intercellular communication upon mechanical stimulation of CPAE- endothelial cells is mediated by nucleotides. Cell Calcium. 29, 125-136 (2001).
  57. Ralevic, V., Burnstock, G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50, 413-492 (1998).
  58. Edelhauser, H. F. The resiliency of the corneal endothelium to refractive and intraocular surgery. Cornea. 19, 263-273 (2000).
  59. George, A. J., Larkin, D. F. Corneal transplantation: the forgotten graft. Am. J. Transplant. 4, 678-685 (2004).
  60. Hong, S. J., Wu, K. Y., Wang, H. Z., Fong, J. C. Change of cytosolic Ca2+ mobility in cultured bovine corneal endothelial cells by endothelin-1. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 19, 1-9 (2003).
  61. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Histamine H1 receptor-mediated Ca2+ signaling in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33, 3041-3049 (1992).
  62. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Agonist-induced Ca2+ mobilization in cultured bovine and human corneal endothelial cells. Curr. Eye Res. 12, 303-311 (1993).
  63. Srinivas, S. P., Yeh, J. C., Ong, A., Bonanno, J. A. Ca2+ mobilization in bovine corneal endothelial cells by P2 purinergic receptors. Curr. Eye Res. 17, 994-1004 (1998).
  64. Satpathy, M., Gallagher, P., Jin, Y., Srinivas, S. P. Extracellular ATP opposes thrombin-induced myosin light chain phosphorylation and loss of barrier integrity in corneal endothelial cells. Exp Eye Res. 81, 183-192 (2005).
  65. Srinivas, S. P., et al. Cell volume response to hyposmotic shock and elevated cAMP in bovine trabecular meshwork cells. Exp. Eye Res. 78, 15-26 (2004).
  66. D'hondt, C., Ponsaerts, R., De Smedt, H., Bultynck, G., Himpens, B. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions. Bioessays. 31, 953-974 (2009).
  67. Boitano, S., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular propagation of calcium waves mediated by inositol trisphosphate. Science. 258, 292-295 (1992).
  68. De Vuyst, E., et al. Intracellular calcium changes trigger connexin 32 hemichannel opening. EMBO J. 25, 34-44 (2006).
  69. De Vuyst, E., et al. Ca2+ regulation of connexin 43 hemichannels in C6 glioma and glial cells. Cell Calcium. 46, 176-187 (2009).
  70. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium waves propagate through radial glial cells and modulate proliferation in the developing neocortex. Neuron. 43, 647-661 (2004).
  71. Iyer, S., Deutsch, K., Yan, X., Lin, B. Batch RNAi selector: a standalone program to predict specific siRNA candidates in batches with enhanced sensitivity. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 85, 203-209 (2007).
  72. Stehberg, J., et al. Release of gliotransmitters through astroglial connexin 43 hemichannels is necessary for fear memory consolidation in the basolateral amygdala. Faseb J. 26, 3649-3657 (2012).
  73. Evans, W. H., Bultynck, G., Leybaert, L. Erratum to: Manipulating Connexin Communication Channels: Use of Peptidomimetics and the Translational Outputs. J. Membr. Biol. 245, 451 (2012).
  74. Majumder, P., et al. ATP-mediated cell-cell signaling in the organ of Corti: the role of connexin channels. Purinergic Signal. 6, 167-187 (2010).
  75. Carvalho, A. C., et al. affects intracellular Ca2+ stores and induces Ca2+ wave propagation. Cell Death Differ. 11, 1265-1276 (2004).
  76. Torres, A., et al. Extracellular Ca2+ acts as a mediator of communication from neurons to glia. Sci. Signal. 5, ra8 (2012).
  77. Decrock, E., et al. Transfer of IP(3) through gap junctions is critical, but not sufficient, for the spread of apoptosis. Cell Death Differ. 19 (3), 947-957 (2012).
  78. Beltramello, M., Piazza, V., Bukauskas, F. F., Pozzan, T., Mammano, F. Impaired permeability to Ins(1,4,5)P3 in a mutant connexin underlies recessive hereditary deafness. Nat. Cell Biol. 7 (1,4,5), 63-69 (2005).
  79. Bukauskas, F. F., Bukauskiene, A., Verselis, V. K. Conductance and permeability of the residual state of connexin43 gap junction channels. J. Gen. Physiol. 119, 171-186 (2002).
  80. Bukauskas, F. F., Verselis, V. K. Gap junction channel gating. Biochim. Biophys. Acta. 1662, 42-60 (2004).
  81. Dahl, G. Where are the gates in gap junction channels? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 1047-1052 (1996).
  82. Retamal, M. A., Schalper, K. A., Shoji, K. F., Bennett, M. V., Saez, J. C. Opening of connexin 43 hemichannels is increased by lowering intracellular redox potential. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8322-8327 (2007).
  83. Shibayama, J., et al. Effect of charge substitutions at residue his-142 on voltage gating of connexin43 channels. Biophys. J. 91, 4054-4063 (2006).
  84. Desplantez, T., Verma, V., Leybaert, L., Evans, W. H., Weingart, R. Gap26, a connexin mimetic peptide, inhibits currents carried by connexin43 hemichannels and gap junction channels. Pharmacological Research: The Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 65, 546-552 (2012).
  85. Delmar, M. Gap junctions as active signaling molecules for synchronous cardiac function. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 11, 118-120 (2000).

Tags

البيولوجيا الخلوية، العدد 77، علم الأحياء الجزيئي، الطب، الهندسة الطبية الحيوية، الفيزياء الحيوية، علم المناعة، طب العيون، جاب المفارق، Connexins، Connexin 43، الكالسيوم اشارة، كاليفورنيا
تحفيز الميكانيكية التي يسببها الكالسيوم انتشار الموجات في الخلية monolayers: مثال من الأبقار الخلايا البطانية القرنية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck,… More

D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck, G. Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (77), e50443, doi:10.3791/50443 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter