Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mekanisk Stimulation-induceret Calcium bølgeudbredelse i cellemonolag: eksempel med Bovin hornhindeendothelceller

Published: July 16, 2013 doi: 10.3791/50443
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

Summary

Intercellulære Ca

Abstract

Intercellulære kommunikation er afgørende for koordineringen af ​​fysiologiske processer mellem celler i en række forskellige organer og væv, herunder hjernen, lever, nethinde, cochlea og kar. I eksperimentelle indstillinger +-bølger intercellulære Ca2 kan fremkaldes ved at anvende en mekanisk stimulus til en enkelt celle. Dette fører til frigivelse af de intracellulære signalmolekyler IP 3 og Ca 2 +, der indleder udbredelsen af Ca 2 +-bølge koncentrisk fra mekanisk stimuleret celle til de omkringliggende celler. De vigtigste molekylære veje, der styrer intercellulære Ca 2 +-bølgeudbredelse leveres af gap junction-kanaler gennem direkte overførsel af IP 3, og ved hemichannels gennem udgivelsen af ATP. Identifikation og karakterisering af ejendommene og regulering af de forskellige connexin og pannexin isoformer som gap junction-kanaler og hemichannels er tilladt af quantification af spredningen af det intercellulære Ca2 +-bølge, siRNA, og anvendelsen af inhibitorer af gap junction-kanaler og hemichannels. Her beskriver vi en metode til at måle intercellulære Ca2 +-bølge i monolag af primære hornhindeendothelceller læsset med Fluo4-AM i respons på en kontrolleret og lokaliseret mekaniske stimuli provokeret af en akut, kortvarigt deformation af cellen som et resultat for at røre cellemembranen med en mikromanipulator-kontrolleret glas mikropipette med en spids diameter på mindre end 1 um. Vi beskriver også den isolering af primære bovine hornhindeendothelceller og dens anvendelse som model system til at vurdere Cx43-hemichannel aktivitet som den drevne kraft intercellulære Ca2 +-bølger gennem frigivelse af ATP. Endelig diskuterer vi brug fordele, begrænsninger og alternativer ved denne metode i forbindelse med gap junction kanal og hemichannel forskning.

Introduction

Intercellulære kommunikation og signalering er afgørende for koordineringen af fysiologiske processer som reaktion på ekstracellulære agonister på vævet og hel-orgel niveau 1,2. Den mest direkte måde intercellulære kommunikation er skabt af forekomsten af ​​gap junctions. Gap junctions er platter gap junction-kanaler, som er proteinholdige kanaler dannet af head-to-head docking af to connexin (Cx) hemichannels af tilstødende celler 3,4 (Figur 1). Gap junctions tillader passage af små signalmolekyler med en molekylvægt på mindre end 1,5 kDa, herunder Ca2 + eller IP 3 5, forårsager og modulerende Ca2 +-frigivelse fra intracellulære lagre af nabocellerne 6 (figur 2). Gap junction kanaler er stramt reguleret af intra-og intermolekylære proteininteraktioner og cellulære signalering processer som redox modifikation ogfosforylering 7.. GJS lette koordineret reaktion af tilsluttede celler og dermed handle som en kemisk og elektrisk syncytium. For eksempel er udbredelsen af hjertets handling potentiale på tværs af de atrielle og ventrikulære myocytter medieret af CX-baserede GJ kanaler 85. Cxs ikke kun har en rolle som gap junction-kanaler, men også danne uparrede hemichannels, derved fungerer som kanaler i membraner samme regelmæssige ionkanaler 8-10 (figur 1). Hemichannels deltager i parakrine signalering mellem naboceller ved at styre udveksling af ioner og signalmolekyler mellem intra-og ekstracellulære miljø.

I mange celletyper (som epitelceller, osteoblastiske celler, astrocytter, endotelceller, etc.) og organer (som hjerne, lever, nethinde, cochlea og kar), +-bølger intercellulære Ca2 er fundamentale for koordineringen af flercellede svar Ca2 +-niveauer i en bestemt celle er ikke begrænset til denne celle, men forplante sig til de omgivende naboceller, hvorved der etableres et intercellulært Ca2 +-bølge 12,13. Disse intercellulære Ca2 +-bølger er vigtig for normal fysiologisk regulering af cellelag som et syncytium og deres dysregulation er blevet forbundet med patofysiologiske processer 11. I hornhindeendothelet og epitelet, studerede forskellige grupper 14-24, herunder vores egen 25-33, mekanismerne og roller intercellulære kommunikation. I ikke-exciterbare celler, ligesom hornhindeendothelceller to forskellige former for intercellulær kommunikation forekommer 28,29, nemlig kløften forbindelsesepitop intercellulær kommunikation og parakrine intercellulær kommunikation. Gap forbindelsesepitop intercellulære kommunikation indebærer en direkte udveksling af signalmolekyler via mellemrumssammenføjninger 7.. Gap junctionale intercellulære kommunikation er afgørende for at opretholde vævshomeostase, kontrollerende celledeling, og etablere en synkroniseret reaktion på ekstracellulær stress 10,34,35. I en række patologier er gap junction kobling reduceret på grund af defekte cxs og hermed påvirke kløft forbindelsesepitop intercellulære kommunikation 36.. Dette understreger vigtigheden og indflydelse kløften forbindelsesepitop intercellulære kommunikation i flercellede organismer. I modsætning til kampen forbindelsesepitop intercellulær kommunikation, er paracrine intercellulær kommunikation ikke afhængig af celle-celle anbringelsen, idet det indebærer frigivelse af diffunderbare ekstracellulære budbringere (figur 2). Forskellige typer af signalstoffer frigives i det ekstracellulære rum ved at signalere celler. Molekylet er derefter transporteres til målcellen hvor det er detekteret af en specifik receptor-protein. Efterfølgende receptor-signal kompleks inducerer et cellulært respons, derafsluttes ved fjernelse af signalet, inaktivering eller desensibilisering. Frigivet lipofile ekstracellulære signalering budbringere trænge membranen og handle på intracellulære receptorer. I modsætning hertil hydrofile budbringere ikke krydse plasmamembranen af ​​den responderende celle, men fungerer som en ligand, som binder til overflade-udtrykte receptorproteiner, som derefter videresender signalet til det intracellulære miljø. Tre store familier af celleoverfladereceptor proteiner deltager i denne proces: ionkanal-forbundet, enzymbundet, og G-protein-bundet. Den frigivne messenger molekyle kan handle på receptorer af samme celle (autokrin), på målceller i umiddelbar nærhed (paracrine), eller på fjerne målceller, der kræver kredsløbssygdomme (endokrine).

I mange celletyper, herunder hornhindeendothelet 28,29, er ATP en af de større hydrofile, parakrine faktorer, som driver udbredelsen af intercellulære Ca2 +-bølger 37-40. During mekanisk deformation, hypoxi, betændelse eller stimulering af forskellige agenter, kan ATP frigøres fra raske celler 41-44 reaktion på forskydningsspænding, stræk, eller osmotisk hævelse 44,45. Forskellige ATP-frigivelse mekanismer er blevet postuleret, herunder vesikulær exocytose 44 og en overflod af transportmekanismer, såsom ATP-bindende kassette (ABC) transportere, plasmalemmal spændingsafhængige anion kanaler 46, P2X7 receptor kanaler 47,48, samt connexin hemichannels 49-52 og pannexin hemichannels 43,49,53. Ekstracellulær ATP kan være hurtigt hydrolyseres til ADP, AMP og adenosin 54,55 af ectonucleotidases der er til stede i det ekstracellulære miljø. Den ekstracellulært udgivet ATP og dets metabolit ADP 56 vil spredes via diffusion. Den efterfølgende vekselvirkning af disse nukleotider med purinerge receptorer i de omkringliggende celler har været impliceret i propagation af intercellulære Ca2 +-bølger 28,37,51. To forskellige klasser af purinerge receptorer findes: adenosin er den vigtigste naturlige ligand for P1-purinreceptorer, mens både purin (ATP, ADP) og pyrimidin (UTP, UDP) nukleotider handle på de fleste P2-purinreceptorer 57.

Intercellulære kommunikation kan undersøges ved forskellige metoder såsom skrabe lastning, dye transfer, lokal uncaging af agonister som IP 3 og Ca 2 +, mekanisk stimulering, etc.. Her beskriver vi studiet af Ca 2 +-bølgeudbredelse fremkaldes ved mekanisk stimulering af en enkelt celle. Fordelen ved at studere Ca 2 +-bølgeudbredelse ved mekanisk stimulering er, at det giver en let værktøj til at kvantificere udbredelsen af Ca 2 +-bølge over tid, og det giver kvantitativt at sammenligne forskellige forbehandlinger af cellerne. I hornhindeendothelet, +-bølger disse intercellulære Ca2 tillader en cokoordineret reaktion fra monolaget, herved fungerer som en mulig forsvarsmekanisme af den ikke-regenererende hornhindeendothelet hjælper endothelium at modstå ekstracellulære belastninger under intraokulær kirurgi, eller ved udsættelse for inflammatoriske mediatorer under immunafvisning eller uveitis 58,59.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Isolering af hornhindeendothelceller

Før du går i gang: Isoler celler fra friske øjne, opnået fra en lokal slagteri, så snart som muligt efter enucleating øjet. Sørg for, at øjet blev udskrællet fra en ko af de maksimalt 18 måneder, fem minutter efter slagtning og bevaret i Earle Balanced Salt Solution - 1% jodopløsning ved 4 ° C for transport til laboratoriet.

  1. Tag øjet ud af Earle Balanced Salt Solution - 1% jodopløsning og placere den i en petriskål (100 x 20 mm).
  2. Steriliser øjet med en opløsning indeholdende 70% ethanol og skyl med Earles balancerede saltopløsning indeholdende 1% iod.
  3. Fra dette trin på, arbejder i en steril hætte. Omhyggeligt dissekere hornhinden fra øjet og placere den i en petriskål (35 x 10 mm) indeholdende Earles Balanced Salt Solution, med epithelcellelaget opad. Fjern forsigtigt eventuelt resterende iris væv still fastgjort til hornhinden, hvis nødvendigt.
  4. Overfør hornhinden til en anden Earles balancerede saltopløsning indeholdende petriskål med endothelcellelaget opad og skylles to gange med Earles Balanced Salt Solution.
  5. Overfør hornhinden med endothellaget opad til et timeglas, der er en skålformet skålen, og dække det med vækstmedium. Vækstmediet består af Dulbeccos Modified Eagles medium indeholdende 25 mM glucose, 10% føtalt bovint serum, 6,6% L-glutamin, 2,5 ug / ml amphotericin-B og 1% antibiotikum-antimykotikum blanding indeholdende 10.000 enheder / ml penicillin, 10.000 ug / ml streptomycin og 25 ug / ml amphotericin B.
  6. Fjern mediet med en suge pipette.
  7. Påfør 300 pi af en trypsinopløsning (0,5 g / L) til endotel lag af hornhinden (alle de trin, der omfatter trypsin er færdig med den samme koncentration).
  8. Placer timeglas med hornhinden i en overdækket petriskål og sætte det i udtagningenubator i 30 min ved 37 ° C og 5% CO2.
  9. Forsigtigt skrabe endotelceller væk fra hornhinden med en flammepoleret krogformede glas Pasteur-pipette i en steril hætte.
  10. Opsug opløsningen indeholdende endothelcellerne og føje den til dyrkningskolber (25 cm2) indeholdende 4 ml dyrkningsmedium.
  11. Påfør 300 pi vækstmedium til hornhinden og gentage skrabning og tilsæt opløsningen indeholdende endothelcellerne til kulturen kolben.
  12. Gentag dette sidste trin (1,11) en gang mere.
  13. Anbring dyrkningskolberne indeholdende hornhindeendothelceller i vækstmediet i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
  14. Efter to dage, tilsættes 6 ml dyrkningsmedium.
  15. Opdater vækstmediet hver anden dag.

2.. Cellekultur

  1. Fjern dyrkningsmedium og vaskes cellerne to gange med Earles Balanced Salt Solution, når sammenflydning er nået (inden About 10 dage efter isolation).
  2. Tilføj 1,5 ml trypsin løsning på de celler til at løsrive dem og kolben anbringes i inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2) i 3 til 4 min.
  3. Der tilsættes 12 ml vækstmedium. Pipettere mellemlang tre gange ind og ud for at sprede cellerne og tæl cellerne.
  4. Frø cellerne med variabel fraktion afhængig celledensiteten og sætte dem i inkubatoren. Forbered to godt kamre slides (med et areal på 4,2 cm 2) med celletal på 165.000 celler (celle tæthed 39.286 per cm 2). Forbered 80 cm 2 dyrkningskolber til en ny passage med en tæthed på 6.250 pr cm 2, og tilføje frisk dyrkningsmedium op til et samlet volumen på 25 ml.
  5. Opdater mediet hver to dage.
  6. Sammenflydning af cellelaget nås efter 3 til 4 dage. Brug celler til eksperimenter.
  7. Når sammenflydning af cellen laget i kolberne er nået, skal du gentage trin 2.1 til 2.6. Celle kulturer op til passagen 2 kan anvendes feller eksperimenter.

3.. Mekanisk stimulering til induktion Calcium Wave

  1. Indlæse celler i kammer slide med 10 pM Fluo-4:00 i phosphatbufret saltvand i 30 minutter ved 37 ° C under forsigtig omrystning.
  2. Fjern Fluo-4:00 opløsning, vaskes cellerne fem gange med phosphatbufret saltvand, inkuberes cellerne med phosphatpufret saltvand og forlade cellerne i mindst 5 minutter ved stuetemperatur før måling.
  3. Excite ved 488 nm med Argon laser og brugen beam splitter HFT 488, indsamle fluorescensemissionen ved 530 nm ved hjælp af en longpass emission filter LP 505, indstilles pinhole på minimum. Brug et olieimmersion 40X mål (Air, 1,2 NA). I forsøg med ARL-67156, skal du bruge en 10X mål (Air, 0,3 NA).
  4. Søg efter et område, hvor cellerne er sammenflydende på konfokal mikroskop.
  5. Position pipetten så det er ved 45 ° i forhold til kammer dias og rører cellemembranen.Fremprovokere en kort (≈ 1 sek) mekanisk stimulering til en enkelt celle. Den mekaniske stimulering består af en akut, kortvarig deformering af cellen ved at røre mindre end 1% af cellemembranen med en glasmikropipette (spidsdiameter <1 um) koblet til en piezoelektrisk krystal nanopositioner, drives gennem en forstærker, der er monteret på en mikro-manipulator. Glasset mikropipetter er lavet med en mikroelektrode aftrækker. Sørg for, at nanopositioner drives af en spænding mellem 0,2 og 1,5 V under mekanisk stimulation. En højere spænding end 1,5 V kan medføre cellebeskadigelse. For hver celle type og tilstand, skal den optimale spænding for mekanisk stimulering uden celleskader omhyggeligt bestemmes ved anvendelse af en række spændinger startende fra lav (0,2 V) til høj (1,5 V) spænding. Spændingen er et mål for den kraft af stimulering da denne spænding bestemmer den mekaniske belastning og belastning, der anvendes til cellemembranen. Denkraft af den mekaniske stimulering kan beregnes ved at multiplicere den mekaniske belastning med området. Da både området (<3,14 um 2) og den mekaniske belastning er meget lav, kraften af den mekaniske stimulering er lav. (Bemærk, at når en celle er beskadiget, fluorescens lækker ud af cellen, og cellen bliver mørk.)
  6. Måle rumlige ændringer i [Ca 2 +] i efter mekanisk stimulering med det konfokale mikroskop.
  7. Indsamle og gemme billeder.
  8. Tegn en polygonal område af interesse at definere det samlede overfladeareal af responsive celler (aktivt område, AA) ved hjælp af softwaren i det konfokale mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alle forsøg udføres i overensstemmelse med alle relevante retningslinjer, bestemmelser og reguleringsorganer og protokollen bliver demonstreret udføres under vejledning og godkendelse af dyret pleje og brug udvalg af KU Leuven.

Hos kvæg hornhindeendothelceller (BCEC), er funktionelle gap junctions udtrykt og begge kløften forbindelsesepitop intercellulær kommunikation og paracrine intercellulær kommunikation bidrage væsentligt til intercellulær kommunikation på en interaktiv måde, men den vigtigste vej er blevet vist at være den paracrine intercellulære kommunikationsvej medieret af ATP udslip gennem Cx43-baserede hemichannels 28,29. ATP og ADP er hydrolyseres til adenosinmonofosfat (AMP) med ectonucleotidase E-NTPD1 (ectonucleoside trifosfat diphosphohydrolase 1, CD39 ATP diphosphohydrolase) og efterfølgende til adenosin ved 5'-ectonucleotidase CD73 28,29. ATP og ADP bidrager tilCa 2 +-bølgeudbredelse ved at binde til P2Y1 og P2Y2-receptorerne 28,29. Begge receptorer par til PLC via Gq og derved fremkalde IP 3-induceret Ca2 +-frigivelse (fig. 2). I BCEC, stimulering af de purinerge P2Y receptorer resulterer i en hurtig stigning i [Ca 2 +] Jeg, som er ufølsom over for fjernelsen af [Ca 2 +] o 60 år. [Ca2 +] i toppe fremkaldt af agonist stimulering efterfølges af en [Ca 2 +] i fald der kan føre til en stabil, agonist-afhængig elevation, [Ca2 +] o-afhængige oscillerende svingninger, eller en tilbagevenden til baseline 60-62. I BCEC, har der været tegn på, at Ca2 +-frigivelse sker via en vej involverer PLC og IP3 29.. Tømning af IP 3-sensitive butikker fører til en indledende top i [Ca 2 +] i, efterfulgt af en capacitative Ca2 +-tilstrømning fører til udbrud af plateaufasen 63..

Mekanisk stimulering fører til en hurtig indledende stigning i Ca2 +, der stammer fra det punkt i stimulering og derefter spredes i hele mekanisk stimuleret celle. Endelig intracellulære Ca 2 +-niveauer langsomt aftage tilbage til baseline-niveau. Efter at have nået cellegrænserne. Intercellulære Ca2 +-bølge udbreder til de omgivende naboceller (NB) i en bølge-lignende måde som en Ca 2 +-forbigående, som henfalder til basisniveauet (figur 3) I kontrolforsøg betingelser +-transienter Ca2 blev observeret op til ca 4 til 8, cellelag væk fra mekanisk stimuleret celle (figur 3). Linjen graf (på højre side af panelerne i figur 3) viser tidsforløbet for Ca 2 +-transienter (repræsenteret normaliserede fluorescens (NF) værdier) iden mekanisk stimuleret celle og i de omkringliggende cellelag 04:59 (NB1, NB2, NB3, NB4 og NB5). Fra figur 3, er det klart, at de normaliserede fluorescens falder, mens tidsforsinkelsen til indtræden af [Ca 2 +] i-stigning stiger med stigende afstand fra den mekanisk stimuleret celle. Den maksimale normaliserede fluorescens i mekanisk stimuleret celle blev nået i 0,95 ± 0,04 sek. Efter at have nået en maksimal normaliseret fluorescens værdi viste det normaliserede fluorescens en meget gradvis og langsom tilbagegang, vender tilbage til den basale værdi 152 ± 6 sek efter anvendelse af stimulus 25..

Hæmning af paracrine intercellulære kommunikationsvej ved hjælp af en kombination af eksogent apyrase VI (5 U / ml i 30 minutter) og apyrase VII (5 U / ml i 30 min) forårsagede en 7,5-fold fald i det område, der er omfattet af Ca2 +-bølge, den såkaldte aktive område (AA, P <0,001, N = 7, N = 35) (figur 4A). Apyrase er kendt for at hydrolysere ATP og ADP. Apyrase VI har en høj ATPase / ADPase forholdet og apyrase VII fortrinsvis hydrolyserer ADP 56..

Da paracrine intercellulære kommunikation i hornhindeendothelet hovedsagelig sker gennem ATP release, 28,29 og ATP hydrolyseres i det ekstracellulære rum ved ectonucleotidases, kendt for at blive udtrykt i hornhindeendothelet, 29,64,65 undersøgte vi effekten på AA i forhold hvor ATP hydrolyse hæmmes ved hjælp ectonucleotidase inhibitorer. Inhibering af ectonucleotidases med ARL-67156 (ARL, 100 uM i 30 min) resulterede i en stærk forbedring af Ca 2 +-bølgeudbredelse, som er blevet påvist tidligere i BCEC 25,26,28,29. Eksponeringen af BCEC til ARL forårsagede en 3,5-fold forøgelse af AA sammenlignet med kontrol betingelser (P <0,001, N = 12, n = 60) (figur 4B).

I prægere studier i vores laboratorium, connexin mimetiske peptider (Gap26 og Gap27, tabel 2) blev anvendt til at adskille de relative bidrag af kløften forbindelsesepitop intercellulær kommunikation og paracrine intercellulær kommunikation til intercellulære Ca2 +-bølgeudbredelse efter mekanisk stimulering, med en inaktiv peptid ( tabel 2) som en kontrol 28,29.

Hæmning af gap junction-kanaler med Gap27 faldt betydeligt udbredelsen af Ca 2 +-bølge i BCEC 30.. AA var signifikant reduceret ved forbehandling med Gap27 (300 uM i 30 min) (P <0,001, N = 8, n = 40) 25 (tabel 1). Hæmning af connexin hemichannels med connexin-mimetiske peptid Gap26 28,30 væsentligt reduceret udbredelsen af Ca 2 +-bølge i BCEC 28.. AA var signifikant reduceret ved forbehandling med Gap26 (300 uM i 30 min)(P <0,001, N = 8, n = 40) 25 (tabel 1).

Vi viste også, at 43-kDa Cx isoform var en hovedkomponent ligger til grund for hemichannel-medieret ATP release der provokerer intercellulære Ca 2 +-bølger. Ved hjælp af to uafhængigt udformede siRNA molekyler rettet Cx43, fandt vi, at AA blev reduceret med omkring 65% 33 (tabel 1). Dette blev yderligere understøttet af forsøg med TAT-L2 (100 uM, 30 min), en celle-gennemtrængelig peptid svarende til den anden halvdel af den intracellulære løkke af Cx43 (tabel 2), hvilket fremprovokerede en væsentlig reduktion i AA (P <0,001 , N = 3, n = 30) (tabel 1). Vigtigere var denne reduktion i AA TAT-L2 inkubation ikke observeret i fravær af parakrine signalering, støtte det koncept, at TAT-L2 hæmmer selektivt Cx43-baserede hemichannels men ikke gap junction-kanaler 33.. Desuden en inaktiv TAT-L2-mutant (TAT-L2 H126K/I130N) kan anvendes som en kontrol (tabel 2).

Figur 1
Figur 1. Dannelse af gap junction-kanaler og hemichannels: skematisk. A. En connexin eller pannexin hemichannel dannes, når seks connexins eller pannexins, der er fire-transmembrane-domæne-holdige proteiner, er radialt arrangeret omkring en central pore. Hemichannels er placeret i plasmamembranen. De kan bestå af identiske protein undertyper (homomeric hemichannels), eller de kan bestå af forskellige protein undertyper, når to eller flere isoformer er udtrykt i samme celle (heteromere hemichannels). En homotypisk gap junction-kanal følger af docking af to identiske homomeric eller heteromere hemichannels. En heterotypic gap junction kanalresultater fra docking af to forskellige homomeric eller heteromer kanaler. B. Skematisk struktur connexin og pannexin gap junction-kanaler forbinder to tilstødende celler og hemichannels.

(Delvis ændret fra 66)

Dette tal blev oprindeligt udgivet i BioEssays. Catheleyne D'Hondt, Raf Ponsaerts, Humbert De Smedt, Geert Bultynck og Bernard Himpens. Pannexins, fjerne slægtninge af connexin familie med specifikke cellulære funktioner. BioEssays. 2009, 31, 953-974 (2009). BioEssays. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. I ikke-overgearet celler itercellular Ca2 +-bølgeudbredelse involverer både hul forbindelsesepitop intercellulær kommunikation og parakrine intercellulær kommunikation. Ved mekanisk stimulering af en enkelt celle, en Ca 2 +-stigningen sker i mekanisk stimuleret celle (MS) via Ca2 +-indstrømning og / eller Ca2 +-frigivelse. Efterfølgende Ca 2 +-rise forplanter fra mekanisk stimuleret til de omkringliggende celler (NB) som et intercellulært Ca2 +-bølge. Den intercellulære formering involverer to mekanismer, nemlig kløften forbindelsesepitop intercellulære kommunikation og paracrine intercellulære kommunikation. I kampen forbindelsesepitop intercellulær kommunikation, forekommer en direkte udveksling af en mediator (IP3 og / eller Ca 2 +) mellem cytoplasmaer af tilstødende celler via gap junctions (GJS). I paracrine intercellulære kommunikation er en budbringer (fx ATP) frigives i det ekstracellulære rum, og dermed handler på receptorer placeret på the overflade af naboceller. Hemichannels (HC) eller andre mekanismer mægle denne ATP frigivelse (se tekst). Ectonucleotidases hydrolysere ATP til ADP og AMP. ATP og ADP handle på P2Y og / eller P2X receptorer på naboceller. (Taget fra 66.)

Dette tal blev oprindeligt udgivet i BioEssays. Catheleyne D'Hondt, Raf Ponsaerts, Humbert De Smedt, Geert Bultynck og Bernard Himpens. Pannexins, fjerne slægtninge af connexin familie med specifikke cellulære funktioner. BioEssays. 2009. 31, 953-974 (2009). BioEssays.

Figur 3
Figur 3. Calcium bølgeudbredelse i kontrolvilkår i BCEC. Mekanisk stimulering induceret calcium transienter er vist på forskellige tidspunkter-point i kontrolvilkår i BCEC af repræsentative pseudo-farvede fluorescens billeder. Den fluorescence intensiteter før stimulation er vist i det første billede. Den hvide pil i det andet billede identificerer mekanisk stimuleret celle. Calcium bølge forplanter til seks tilstødende cellelag med et samlet areal på celler nået af bølgen (aktive område: AA) i 62.870 um 2.

Den rigtige panel med linjegrafer viser tidsforløbet for den normaliserede fluorescens værdi (NF) i mekanisk stimuleret celle (MS), og den gennemsnitlige værdi af NF i de omkringliggende celler (NB) lag 1 til 5 (NB1 til NB5). (Delvist ændres fra 25..)

Dette tal blev oprindeligt udgivet i Investigative Oftalmologi og Visual Science. Catheleyne D'Hondt, Raf Ponsaerts, Sangly P Srinivas, Johan Vereecke og Bernard Himpens. Thrombin hæmmer intercellulære calcium bølgeudbredelse i hornhindeendothelceller ved modulering af hemichannels og gap vejkryds. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. Investigative Oftalmologi og Visual Science.

Figur 4
Figur 4.. Væsentlige ændringer i udbredelsen af intercellulære Ca2 +-bølger efter behandling med eksogene nucleotidases (til venstre) og med ectonucleotidase hæmmere (til højre) i BCEC. A. Signifikant fald i AA efter behandling af BCEC med exogene apyrases (apyrase VI (5 U / ml) og apyrase VII (5 U / ml) i 30 min), der hydrolyserer ATP og ADP, herved hæmme paracrine intercellulær kommunikation pathway (N = 7, n = 35). * Betyder p <0,001 i tilstedeværelse vs fravær af apyrase B. Betydelig stigning i AA efter behandling af BCEC med en selektiv ectonucleotidase inhibitor ARL-67156 (ARL, 100 uM til 30 min)., Herby enhancing den paracrine intercellulære kommunikationsvej (N = 12, n = 60). * Betyder p <0,001 i nærvær vs fravær af ARL.

Normaliseret AA St. error N n Statistik
styre 100 8.31 3 30
siScramble 87,97 9.3 3 30
siCx43-1 32.45 8.23 3 30 *
siCx43-2 35.49 7,06 3 30 *
Kontrol-peptid 91,68 6.5 8 40
Gap 26 46.67 4.24 8 40 *
Gap 27 53 4.76 8 40 *
TAT-L2 6.99 0,71 3 30 *

Tabel 1. Effekt af siRNA molekyler rettet Cx43, connexin mimetiske peptider og celle-permeable peptid TAT-L2 på den normaliserede aktive område (AA) i BCEC.
N repræsenterer det antal dage, eksperimenter, n betegner antallet af mekaniske stimulationer. * Betyder P <0,001 sammenlignet med kontrol forhold.

<tr>
AA-sekvensen
Kontrol-peptid SRGGEKNVFIV
Gap26 VCYDKSFPISHVR
Gap27 SRPTEKTIFII
TAT-L2 YGRKKRRQRRR-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK
TAT-L2H126K/I130N YGRKKRRQRRR-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK
10Panx1 WRQAAFVDSY

Tabel 2. Aminosyresekvenser af de anvendte peptider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskript, beskriver vi en simpel metode til at måle intercellulære Ca2 +-bølgeudbredelse i monolag af primære bovine hornhindeendotelceller ved at tilvejebringe en lokaliseret og kontrolleret mekanisk stimulering ved hjælp af en mikropipette. Mekanisk stimulerede celler reagere med en lokal stigning i intracellulær IP3 og Ca2 +, som begge er vigtige intracellulære signalmolekyler, der driver intercellulære Ca2 +-bølgeudbredelse 11,67. IP 3 direkte overføres til de omkringliggende celler via gap junction kanalerne 5, mens Ca2 + provokerer åbningen af hemichannels og frigivelse af ATP 68,69, hvilket udløser Ca2 + signaler i naboceller gennem aktivering af G-protein-koblede P2 receptorer 37-40. Det relative bidrag af gap junction-kanaler og hemichannels i denne proces kan karakteriseres ved anvendelse af CX-mimetiskpeptider, ATP-nedbrydende enzymer (ectonucleotidases) og hæmmere af ectonucleotisdases. Egenskaberne af mekanisk stimulering induceret intercellulære Ca2 +-bølgeudbredelse i kvæg hornhindeendothelceller er blevet grundigt karakteriseret i vores laboratorium 25-33. Vores resultater viser, at intercellulære Ca2 +-bølgeudbredelse hovedsagelig er drevet af en CX-hemichannel-medieret frigivelse af ATP, med Cx43 spiller en fremtrædende rolle. Som sådan er denne metode, der anvendes til primære bovine hornhindeendothelceller specielt egnet til at identificere eller karakterisere reguleringen af ​​Cx43 hemichannels på endogene niveauer i native celler. Ved hjælp af denne metode, har vi fundet, at aktiviteten af Cx43 hemichannels kritisk styres af actomyosin cytoskeleton, der kan tjene som et endogent bremse forhindrer overdreven og dermed skadelig, Cx43 hemichannel åbning 25,31,32. Vi yderligere at belyse de molekylære mekanismer bag denne forordning og finden vigtig rolle for intramolekylære loop / hale interaktioner, der er afgørende for åbningen af Cx43 hemichannels 33.

Klart, at dette system er meget velegnet til at studere funktionen af ​​Cx og Panx-baserede gap junction kanaler og hemichannels og er absolut ikke begrænset til kvæg hornhindeendothelceller men kan tilpasses til praktisk talt enhver celletype og også mere komplekse væv, som er blevet vist i hjernen, hvor mekanisk stimulering udløst store intercellulære Ca2 +-bølger omfatter hele halvkugle 70. Forskellige værktøjer er til stede for at vurdere bidraget af gap junction-kanaler og hemichannels, herunder CX-mimetiske peptider, ATP-nedbrydende enzymer, inhibitorer af ectonucleotidases og farmakologiske forbindelser som carbenoxolone og 10 Panx1 (tabel 2) 49,50. At bestemme bidraget fra en bestemt Cx eller Panx isoform i denne proces, omhyggeligt designet siRNA sonder targeting to uafhængige regioner af mRNA og en kodet kontrol bør anvendes. Omfanget af knockdown skal bestemmes på det totale protein niveau ved hjælp af vestligt blotting assays og enkelt celle niveau med fluorescerende mikroskopi. Den transfektion effektivitet siRNA prober i de eksperimentelle cellemonolag bør vurderes af fluorescerende mikroskopi. Til dette kan man udvikle en duplex siRNA hvor et fluorescerende mærke er blevet inkorporeret ved 3'-enden af ​​sense-strengen. Det er vigtigt at bemærke, at for korrekt analyse, en fremtrædende reduktion af Cx eller Panx isoform (> 90% reduktion), samt en homogen transfektion af siRNA duplekser i cellemonolaget (> 90% af cellerne transficeret med siRNA sonden) skal indhentes. Selektiviteten af designet siRNA sonder mod målet bør vurderes 71. Kort sagt bør disse værktøjer valideres, således at de ikke påvirker ekspressionen af ​​andre Cx eller Panx isoformer eller andre centrale comkomponenter køre intercellulære Ca2 +-bølger, ligesom P2X eller P2Y-receptorer. At vurdere bidraget fra Cx43 hemichannels har vi samarbejdet med laboratoriet af Dr. Leybaert i at udvikle en celle-gennemtrængelig peptid svarende til den anden halvdel af den intracellulære løkke af Cx43 (TAT-L2), der fungerer som en selektiv, potent hæmmer af Cx43 hemichannels samtidig opretholde Cx43-gap junction kanalaktivitet 33.. I vores studier, bruger vi 100 uM TAT-L2 for at opnå en fuldstændig hæmning af Cx43 hemichannels, men lavere koncentrationer kan være tilstrækkeligt 72.. TAT-L2H126K/I130N anbefales som en negativ kontrol 73.. For at vurdere det bidrag Panx1 kanaler, kan 10Panx1 peptid anvendes. Disse værktøjer er vigtig, ikke kun for at udelukke plasma membran forstyrrelser (se nedenfor), men også for at demonstrere, at parakrine ATP signalering medierer mekanismerne i intercellulære Ca 2 +-bølgeudbredelse ved hemichannels og ikke af andre mekanismer (som maksialradial anion kanaler eller frigivelse af ATP-holdige vesikler). Endelig, som til alle undersøgelser med primære celler, skal celledyrkningsbetingelser og antallet af passager standardiseres, da de biologiske egenskaber af cellerne og dermed ekspressionen profilen af de forskellige Cx og Panx isoformer kan ændre sig over tid 26.

Der er imidlertid en række ulemper til denne metode. En væsentlig ulempe ved fremgangsmåden er, at mekanisk stimulation kan udløse plasmamembran forstyrrelser, hvilket fører til optagelse af ekstracellulær Ca2 + og frigivelse af signalmolekyler såsom ATP, som begge ligger til grund bona fide intercellulære Ca2 +-bølgeudbredelse 11. Denne absolut komplicerer (kvantitativ) analyse af den intercellulære Ca 2 +-bølgen. Derfor er det stærkt anbefales, at man skal i) bruge en ordentlig kontrol, dvs cellelinjer, der mangler udtryk for Cx eller Panx isoformer, og værktøjer, som interfere med funktionen af ​​Cx og Panx som gap junction-kanaler og / eller hemichannels og ii) standardisere mekanisk stimulering procedure (sørg for, at under mekanisk stimulus nanopositioner drives af en spænding mellem 0,5 og 2 V).

Desuden er det vigtigt at bemærke, at denne metode ikke stå ved sig selv, men bør understøttes af yderligere eksperimentelle metoder til at studere Cx og Panx kanaler. Dette kan opnås ved hjælp af en lokal forøgelse af intracellulære signalmolekyler, der deltager i mekanisk stimulering-medieret intercellulære Ca2 +-bølgeudbredelse, ligesom uncaging af intracellulære IP3 eller Ca2 + 11,74. At indlede intercellulære Ca2 +-bølge uafhængig af mekanisk stimulation, kan man anvende mikro-injektion, såsom rekombinant pro-apoptotisk Bax 11,75 og foto-aktiverbare Ca2 +-buffere som diazo-2, der forårsager en lokal fald i ekstracellulær [Ca2 + 76, en kendt udløsende faktor for hemichannel åbning. Alternativt kan man bruge in situ elektroporation af celle-uigennemtrængelige signalmolekyler, der udløser intracellulære Ca2 +-frigivelse og intercellulære Ca2 +-bølger, såsom IP 3 67,68. Sidstnævnte teknik anvendes også til at undersøge udbredelsen af celledød 5,77. Disse ikke-mekaniske stimuli give en bedre vurdering af stimulus intensitet-respons. Ud over disse Ca 2 +-bølgeudbredelse metoder, er det vigtigt at bestemme aktiviteten af CX eller Panx kanaler med andre metoder, herunder bestemmelse af hydrofilt farvestofoptagelse (ligesom Lucifer gul) 78 og frigivelse af ATP ikke blot i respons på mekanisk stimulering, men også som reaktion på ekstracellulær Ca2 +-buffere (ligesom EGTA) og intracellulære Ca 2 +-frigivelse molekyler (som Ca 2 +-A23187) 11,74. Desuden than bedste bevis for regulering på kanalen plan, tilvejebringes gennem elektrofysiologiske eksperimenter, enten dobbelt spænding clamp systemer eller hel-celle vej klemme i Xenopus oocytter injiceret med Cx eller Panx mRNA eller HeLa-celler ectopically udtrykker Cx isoformer sammen med en markør som GFP 79-84.

Konklusionen er, at brugen af mekanisk stimulering for at fremkalde intercellulære Ca2 +-bølger giver en enkel og pålidelig metode til at undersøge intracellulære kommunikation og undersøger bidrag og egenskaber Cx og Panx kanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forskning udført i laboratoriet blev støttet af tilskud fra Research Foundation - Flandern (FWO, tilskud numrene G.0545.08 og G.0298.11) er universitetscenter seværdighed polakker Program (belgisk Science Policy, tilskud nummer P6/28 og P7/13) og er indlejret i en FWO-støttet forskning samfund. CDH er en post-ph.d.-stipendiat for Research Foundation - Flandern (FWO). Forfatterne er meget taknemmelige for alle nuværende og tidligere medlemmer af Laboratoriet for Molekylær og Cellulær signalering (KU Leuven), Dr. SP Srinivas (Indiana University School of Optometri, USA), laboratoriet af Dr. Leybaert (Ghent University) og Dr. Vinken (VUB), som forudsat nyttige diskussioner, optimeret procedurer eller var involveret i udviklingen af ​​værktøjer til studiet af connexin hemichannels.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14155-048
Iodine Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) 38060-1EA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 11960-044
L-glutamine (Glutamax) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 35050-038
Amphotericin-B Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A2942
Antibiotic-antimycotic mixture Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 15240-096
Trypsin Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 25300-054
Dulbecco's PBS Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14190-091
Fluo-4 AM Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A265
Apyrase VI Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6410
Apyrase VII Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR) Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII) Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV) Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark) 155380
Confocal microscope Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany) LSM510
Piez–lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner) PI Polytech (Karlsruhe, Germany) P-280
HVPZT-amplifier PI Polytech (Karlsruhe, Germany) E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter) World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA 4878
Micr–lectrode puller Zeitz Instrumente (Munchen, Germany) WZ DMZ-Universal Puller

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18, 592-600 (2006).
  2. Mese, G., Richard, G., White, T. W. Gap junctions: basic structure and function. J. Invest. Dermatol. 127, 2516-2524 (2007).
  3. Bruzzone, R., White, T. W., Paul, D. L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur. J. Biochem. 238, 1-27 (1996).
  4. White, T. W., Bruzzone, R., Paul, D. L. The connexin family of intercellular channel forming proteins. Kidney Int. 48, 1148-1157 (1995).
  5. Decrock, E., et al. Connexin-related signaling in cell death: to live or let die? Cell Death Differ. 16, 524-536 (2009).
  6. Herve, J. C. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 1-4 (2007).
  7. Herve, J. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Duffy, H. S. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 29-65 (2007).
  8. Bruzzone, R., Barbe, M. T., Jakob, N. J., Monyer, H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem. 92, 1033-1043 (2005).
  9. Ebihara, L., Steiner, E. Properties of a nonjunctional current expressed from a rat connexin46 cDNA in Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. 102, 59-74 (1993).
  10. Evans, W. H., De Vuyst, E., Leybaert, L. The gap junction cellular internet: connexin hemichannels enter the signalling limelight. Biochem. J. 397, 1-14 (2006).
  11. Leybaert, L., Sanderson, M. J. Intercellular Ca2+ waves: mechanisms and function. Physiol. Rev. 92, 1359-1392 (2012).
  12. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intracellular Ca2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  13. Himpens, B., Stalmans, P., Gomez, P., Malfait, M., Vereecke, J. Intra- and intercellular Ca2+ signaling in retinal pigment epithelial cells during mechanical stimulation. Faseb J. 13, 63-68 (1999).
  14. Williams, K. K., Watsky, M. A. Bicarbonate promotes dye coupling in the epithelium and endothelium of the rabbit cornea. Curr. Eye Res. 28, 109-120 (2004).
  15. Hernandez Galindo, E. E., Theiss, C., Steuhl, K. P., Meller, D. Gap junctional communication in microinjected human limbal and peripheral corneal epithelial cells cultured on intact amniotic membrane. Exp Eye Res. 76, 303-314 (2003).
  16. Williams, K., Watsky, M. Gap junctional communication in the human corneal endothelium and epithelium. Curr. Eye Res. 25, 29-36 (2002).
  17. Anderson, S. C., Stone, C., Tkach, L., SundarRaj, N. Rho and Rho-kinase (ROCK) signaling in adherens and gap junction assembly in corneal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43, 978-986 (2002).
  18. Joyce, N. C., Harris, D. L., Zieske, J. D. Mitotic inhibition of corneal endothelium in neonatal rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2572-2583 (1998).
  19. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Trinkaus-Randall, V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  20. Klepeis, V. E., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randall, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. J. Cell Sci. 114, 4185-4195 (2001).
  21. Laux-Fenton, W. T., Donaldson, P. J., Kistler, J., Green, C. R. Connexin expression patterns in the rat cornea: molecular evidence for communication compartments. Cornea. 22, 457-464 (2003).
  22. Rae, J. L., Lewno, A. W., Cooper, K., Gates, P. Dye and electrical coupling between cells of the rabbit corneal endothelium. Curr. Eye Res. 8, 859-869 (1989).
  23. Watsky, M. A., Rae, J. L. Dye coupling in the corneal endothelium: effects of ouabain and extracellular calcium removal. Cell Tissue Res. 269, 57-63 (1992).
  24. Williams, K. K., Watsky, M. A. Dye spread through gap junctions in the corneal epithelium of the rabbit. Curr. Eye Res. 16, 445-452 (1997).
  25. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Thrombin inhibits intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells by modulation of hemichannels and gap junctions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 120-133 (2007).
  26. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Reduced intercellular communication and altered morphology of bovine corneal endothelial cells with prolonged time in cell culture. Curr. Eye Res. 34, 454-465 (2009).
  27. D'hondt, C., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Adenosine Opposes Thrombin-Induced Inhibition of Intercellular Calcium Wave in Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 1518-1527 (2007).
  28. Gomes, P., Srinivas, S. P., Van Driessche, W., Vereecke, J., Himpens, B. ATP release through connexin hemichannels in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1208-1218 (2005).
  29. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. ATP-dependent paracrine intercellular communication in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 104-113 (2005).
  30. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Gap junctional intercellular communication in bovine corneal endothelial cells. Exp Eye Res. , (2006).
  31. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4816-4827 (2008).
  32. Ponsaerts, R., et al. RhoA GTPase Switch Controls Cx43-Hemichannel Activity through the Contractile System. PLoS ONE. 7, e42074 (2012).
  33. Ponsaerts, R., et al. Intramolecular loop/tail interactions are essential for connexin 43-hemichannel activity. Faseb J. 24, 4378-4395 (2010).
  34. Charles, A. Reaching out beyond the synapse: glial intercellular waves coordinate metabolism. Sci STKE. 2005, pe6 (2005).
  35. Laird, D. W. Life cycle of connexins in health and disease. Biochem. J. 394, 527-543 (2006).
  36. Kelsell, D. P., Dunlop, J., Hodgins, M. B. Human diseases: clues to cracking the connexin code. Trends Cell Biol. 11, 2-6 (2001).
  37. Pearson, R. A., Dale, N., Llaudet, E., Mobbs, P. ATP released via gap junction hemichannels from the pigment epithelium regulates neural retinal progenitor proliferation. Neuron. 46, 731-744 (2005).
  38. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Randall, V. T. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  39. Cotrina, M. L., Lin, J. H., Lopez-Garcia, J. C., Naus, C. C., Nedergaard, M. ATP-mediated glia signaling. J. Neurosci. 20, 2835-2844 (2000).
  40. Burnstock, G., Williams, M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic potential. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 862-869 (2000).
  41. Schwiebert, E. M., Zsembery, A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. Biochim. Biophys Acta. 1615, 7-32 (2003).
  42. Lazarowski, E. R., Boucher, R. C., Harden, T. K. Mechanisms of release of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol. Pharmacol. 64, 785-795 (2003).
  43. Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol. 265, C577-C606 (1993).
  44. Blair, S. A., Kane, S. V., Clayburgh, D. R., Turner, J. R. Epithelial myosin light chain kinase expression and activity are upregulated in inflammatory bowel disease. Lab. Invest. 86, 191-201 (2006).
  45. Boudreault, F., Grygorczyk, R. Cell swelling-induced ATP release and gadolinium-sensitive channels. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C219-C226 (2002).
  46. Romanov, R. A., Rogachevskaja, O. A., Khokhlov, A. A., Kolesnikov, S. S. Voltage dependence of ATP secretion in mammalian taste cells. J. Gen. Physiol. 132, 731-744 (2008).
  47. Pelegrin, P., Surprenant, A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. Embo J. 25, 5071-5082 (2006).
  48. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272, 735-738 (1996).
  49. D'hondt, C., et al. Pannexin channels in ATP release and beyond: an unexpected rendezvous at the endoplasmic reticulum. Cell Signal. 23, 305-316 (2011).
  50. Leybaert, L., et al. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. Cell Commun. Adhes. 10, 251-257 (2003).
  51. Stout, C. E., Costantin, J. L., Naus, C. C., Charles, A. C. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J. Biol. Chem. 277, 10482-10488 (2002).
  52. Verma, V., Hallett, M. B., Leybaert, L., Martin, P. E., Howard Evans, W. Perturbing plasma membrane hemichannels attenuates calcium signalling in cardiac cells and HeLa cells expressing connexins. Eur. J. Cell Biol. , (2008).
  53. Pharmacol, B. rJ. 147, S172-S181 (2006).
  54. Slakey, L. L., Gordon, E. L., Pearson, J. D. A comparison of ectonucleotidase activities on vascular endothelial and smooth muscle cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 603, 366-378 (1990).
  55. Gordon, E. L., Pearson, J. D., Slakey, L. L. The hydrolysis of extracellular adenine nucleotides by cultured endothelial cells from pig aorta. Feed-forward inhibition of adenosine production at the cell surface. J. Biol. Chem. 261, 15496-15507 (1986).
  56. Moerenhout, M., Himpens, B., Vereecke, J. Intercellular communication upon mechanical stimulation of CPAE- endothelial cells is mediated by nucleotides. Cell Calcium. 29, 125-136 (2001).
  57. Ralevic, V., Burnstock, G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50, 413-492 (1998).
  58. Edelhauser, H. F. The resiliency of the corneal endothelium to refractive and intraocular surgery. Cornea. 19, 263-273 (2000).
  59. George, A. J., Larkin, D. F. Corneal transplantation: the forgotten graft. Am. J. Transplant. 4, 678-685 (2004).
  60. Hong, S. J., Wu, K. Y., Wang, H. Z., Fong, J. C. Change of cytosolic Ca2+ mobility in cultured bovine corneal endothelial cells by endothelin-1. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 19, 1-9 (2003).
  61. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Histamine H1 receptor-mediated Ca2+ signaling in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33, 3041-3049 (1992).
  62. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Agonist-induced Ca2+ mobilization in cultured bovine and human corneal endothelial cells. Curr. Eye Res. 12, 303-311 (1993).
  63. Srinivas, S. P., Yeh, J. C., Ong, A., Bonanno, J. A. Ca2+ mobilization in bovine corneal endothelial cells by P2 purinergic receptors. Curr. Eye Res. 17, 994-1004 (1998).
  64. Satpathy, M., Gallagher, P., Jin, Y., Srinivas, S. P. Extracellular ATP opposes thrombin-induced myosin light chain phosphorylation and loss of barrier integrity in corneal endothelial cells. Exp Eye Res. 81, 183-192 (2005).
  65. Srinivas, S. P., et al. Cell volume response to hyposmotic shock and elevated cAMP in bovine trabecular meshwork cells. Exp. Eye Res. 78, 15-26 (2004).
  66. D'hondt, C., Ponsaerts, R., De Smedt, H., Bultynck, G., Himpens, B. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions. Bioessays. 31, 953-974 (2009).
  67. Boitano, S., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular propagation of calcium waves mediated by inositol trisphosphate. Science. 258, 292-295 (1992).
  68. De Vuyst, E., et al. Intracellular calcium changes trigger connexin 32 hemichannel opening. EMBO J. 25, 34-44 (2006).
  69. De Vuyst, E., et al. Ca2+ regulation of connexin 43 hemichannels in C6 glioma and glial cells. Cell Calcium. 46, 176-187 (2009).
  70. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium waves propagate through radial glial cells and modulate proliferation in the developing neocortex. Neuron. 43, 647-661 (2004).
  71. Iyer, S., Deutsch, K., Yan, X., Lin, B. Batch RNAi selector: a standalone program to predict specific siRNA candidates in batches with enhanced sensitivity. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 85, 203-209 (2007).
  72. Stehberg, J., et al. Release of gliotransmitters through astroglial connexin 43 hemichannels is necessary for fear memory consolidation in the basolateral amygdala. Faseb J. 26, 3649-3657 (2012).
  73. Evans, W. H., Bultynck, G., Leybaert, L. Erratum to: Manipulating Connexin Communication Channels: Use of Peptidomimetics and the Translational Outputs. J. Membr. Biol. 245, 451 (2012).
  74. Majumder, P., et al. ATP-mediated cell-cell signaling in the organ of Corti: the role of connexin channels. Purinergic Signal. 6, 167-187 (2010).
  75. Carvalho, A. C., et al. affects intracellular Ca2+ stores and induces Ca2+ wave propagation. Cell Death Differ. 11, 1265-1276 (2004).
  76. Torres, A., et al. Extracellular Ca2+ acts as a mediator of communication from neurons to glia. Sci. Signal. 5, ra8 (2012).
  77. Decrock, E., et al. Transfer of IP(3) through gap junctions is critical, but not sufficient, for the spread of apoptosis. Cell Death Differ. 19 (3), 947-957 (2012).
  78. Beltramello, M., Piazza, V., Bukauskas, F. F., Pozzan, T., Mammano, F. Impaired permeability to Ins(1,4,5)P3 in a mutant connexin underlies recessive hereditary deafness. Nat. Cell Biol. 7 (1,4,5), 63-69 (2005).
  79. Bukauskas, F. F., Bukauskiene, A., Verselis, V. K. Conductance and permeability of the residual state of connexin43 gap junction channels. J. Gen. Physiol. 119, 171-186 (2002).
  80. Bukauskas, F. F., Verselis, V. K. Gap junction channel gating. Biochim. Biophys. Acta. 1662, 42-60 (2004).
  81. Dahl, G. Where are the gates in gap junction channels? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 1047-1052 (1996).
  82. Retamal, M. A., Schalper, K. A., Shoji, K. F., Bennett, M. V., Saez, J. C. Opening of connexin 43 hemichannels is increased by lowering intracellular redox potential. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8322-8327 (2007).
  83. Shibayama, J., et al. Effect of charge substitutions at residue his-142 on voltage gating of connexin43 channels. Biophys. J. 91, 4054-4063 (2006).
  84. Desplantez, T., Verma, V., Leybaert, L., Evans, W. H., Weingart, R. Gap26, a connexin mimetic peptide, inhibits currents carried by connexin43 hemichannels and gap junction channels. Pharmacological Research: The Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 65, 546-552 (2012).
  85. Delmar, M. Gap junctions as active signaling molecules for synchronous cardiac function. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 11, 118-120 (2000).

Tags

Cellular Biology Molekylærbiologisk Institut Medicine Biomedical Engineering Biofysik Immunologi Ophthalmology Gap Junctions Connexins connexin 43 Calcium Signaling Ca parakrin Kommunikation intercellulær kommunikation calcium bølge formering gap junctions hemichannels endotelceller cellesignalering cell isolation cellekultur
Mekanisk Stimulation-induceret Calcium bølgeudbredelse i cellemonolag: eksempel med Bovin hornhindeendothelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck,… More

D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck, G. Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (77), e50443, doi:10.3791/50443 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter