Summary
גירוי עצב אינפרא אדום הוצע כחלופה לגירוי חשמלי במגוון רחב של סוגי עצב, כוללים אלה הקשורים למערכת השמיעה. פרוטוקול זה מתאר שיטת תיקון מהדק ללימוד המנגנון של גירוי עצב אינפרא אדום בתרבות של נוירונים שמיעתיים ראשוניים.
Abstract
זה כבר הוכיח בשנים האחרונות כי אור לייזר פעם, אינפרא אדום יכול לשמש כדי לעורר תגובה חשמלית ברקמה עצבית, ללא תלות בכל שינוי נוסף של רקמת המטרה. גירוי עצבי אינפרא אדום כבר דיווח במגוון רחב של רקמה עצבית היקפית וחושית in vivo, בעניין מסוים שמוצג בגירוי של תאי עצב בעצב השמיעה. עם זאת, בעוד אח"י הוכח לעבוד בהגדרות אלה, המנגנון (או מנגנונים) שבאמצעותו אור אינפרא אדום גורם לעירור עצבי כיום אינו מובן היטב. הפרוטוקול המובא כאן מתאר את כל שיטת תיקון מהדק תא שנועדה להקל על החקירה של גירוי עצבי אינפרא אדום בנוירונים שמיעתיים ראשוניים בתרבית. על ידי ביסודיות המאפיין את התגובה של תאים אלה לתאורת לייזר אינפרא אדום במבחנה בתנאים מבוקרים, זה עשוי להיות אפשרי כדי להשיג הבנה משופרת של Physica היסודיl ותהליכים ביוכימיים שבבסיס גירוי עצבי אינפרא אדום.
Introduction
תחומי bionics נוירופיזיולוגיה והרפואי להסתמך בכבדות על טכניקות המאפשרות גירוי לשליטה של תגובות חשמליות ברקמה עצבית. בעוד גירוי חשמלי נשאר תקן הזהב בעירור עצבי, הוא סובל ממספר חסרונות, כגון נוכחות של חפצי גירוי בעת הקלטת תגובות עצביות, וחוסר גירוי ספציפי בשל התפשטות נוכחית לתוך רקמה הסובבת 1.
בשני העשורים האחרונים שראו את הפיתוח של טכניקות גירוי אופטי תיווך 2. כמה מטכניקות אלה דורשות שינוי של רקמות היעד, או באמצעות תוספת של מולקולה מסוימת (מולקולות כלוב למשל) 3 או צורה כלשהי של מניפולציה גנטית (למשל optogenetics) 4, אף אחת מהן הן קלים ליישום מחוץ למסגרת מחקר. עניין מיוחד ולכן הוא גירוי עצבי אינפרא אדום (INS), wherebרקמה העצבית Y היא נרגשת על ידי אור לייזר אינפרא אדום פעם. יש אח"י הפוטנציאל להתגבר רבים מהחסרונות של גירוי חשמלי על ידי הפעלת גירוי של רקמה עצבית 2 מאוד ספציפי, ללא מגע. עם זאת, בעוד אח"י הודגם בהצלחה במגוון רחב של הגדרות in vivo, המנגנון המדויק של עירור נשאר לא ברור.
כמה פרסומים האחרונים הראו התקדמות לקראת גילוי המנגנון עומד מאחורי אח"י 5-7. חימום מהיר עקב ספיגה של אור לייזר על ידי מים שנראה לשחק תפקיד מפתח. עם זאת, מעבר לכך קונסנסוס הוא עדיין לא הגיע. שפירא ואח'. 7 להציע מנגנון כללי ביותר לפיה חימום מהיר גורם להפרעות בהפצה של חלקיקים טעונים הסמוכים לקרום התא, מה שמוביל לשינוי בקיבול של קרום התא ושלילת הקוטביות שלאחר מכן. בנוסף, אלברט ואח'. 5 טוענים כי laseחימום המושרה R מפעיל מחלקה מסוימת של טמפרטורת תעלות יונים הרגישות (הקולטן החולף ערוצי vanilloid פוטנציאליים), המאפשר ליונים לעבור דרך קרום התא. בשלב זה לא ברור כיצד מנגנונים אלה לשלב, או אם אכן יש גורמים נוספים שעדיין לא זוהה.
למרות מספר קטן של פרסומים (הפניות 5,7-9) חקרו אח"י במבחנה, הרוב המכריע של עבודה שפורסם בתחום זה בוצע in vivo (למשל 1,6,10-18 הפניות). גירוי אינפרא אדום של נוירונים שמיעתיים כבר שטח של עניין מיוחד, בשל היישומים האפשריים בשתלי שבלול 10,14-18. בעוד בניסויי vivo הם חשובים כדי לוודא את היעילות של הטכניקה במסגרות שונות, הרמה המוגברת של שליטה המוענקת על ידי ניסויים במבחנה צפוי להוביל להבנה מפורטת יותר של mechליברטריאניות אחראית לאח"י. דו"ח זה מתאר את ההכנה של נוירונים בתרבית הגנגליון ספירלה לחקירות מהדק תיקון, כמו אלה יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים בסיסיים גם בעת קישור לגוף הגדול של נתונים קיימים ממערכת השמיעה.
טכניקת מהדק התיקון היא כלי מצוין לחקירות של תופעות אלקטרו, לספק אמצעי הקלטת פעילות חשמלית בתאים בודדים ולומד את תרומתם של זרמי 19 הבודדים המשמשים כבסיס. כאשר טכניקה זו מיושמת לאורווה בהכנה במבחנה של נוירונים העיקרי, כגון תאי עצב הגנגליון ספירלה בתרבית, היא מציעה את ההזדמנות ללמוד לעומק את המנגנונים שבאמצעותם פעילות עצבית היא בשליטה ומניפולציה.
הפרוטוקולים המפורטים בשיטות מתאר בעבודה זו לחוקרת את ההשפעה של גירוי לייזר על התכונות החשמליות של תאי עצב הגנגליון ספירלה באמצעות מהדק תיקוןהקלטות. הגישה מבוססת על לייזר סיב מצמידים ולא לייזר ללא מרחב, מאפשרת תפעול בטוח יותר, כמו גם קל יותר לשחזור יישור ללא הצורך לשנות את תצורת מיקרוסקופ הרגילה. על בסיס הפרוטוקולים הללו, זה צריך להיות אפשרי לביצוע מגוון רחב של ניסויים במטרה בצורה ברורה יותר על מנת לקבוע את המנגנון או מנגנונים מאחורי אח"י.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות של נוירונים גנגליון ספירלה
- לעקר עגול קטן (בקוטר 10 מ"מ לדוגמה) coverslips זכוכית ומלקחיים מעוקלים בחיטוי. העבר את coverslips מעוקר לתוך בארות בודדות של צלחת סטרילית 4-טבעת 35 מ"מ פטרי או צלחת 4 היטב, תוך שימוש במלקחיים מעוקרים. החלת 150 μl של פולי-L-ornithine (500 מיקרוגרם / מ"ל) והעכבר laminin (0.01 מ"ג / מ"ל) למשטח העליון של coverslip והמקום באינקובטור (37 מעלות צלזיוס) לתקופה של עד 48 שעות. להבטיח כי את coverslips לא יצוף מתחתית הבאר.
- הכן 50 תקשורת Neurobasal סטריליים מ"ל (NBM) לכל תרבות עצבית: 47.5 מיליליטר Neurobasal, 0.5 מ"ל N 2 תוספת, תוספת 1 מ"ל B27, 0.5 L-גלוטמין מ"ל, ו0.5 פניצילין, סטרפטומיצין מ"ל. הערה: אפשר להקפיא תוספי, מאוחסן ב -20 ° C והוסיף לתקשורת ביום הנדרש.
- לנתק את תאי עצב הגנגליון ספירלה מגורי חולדת 4-7 שלאחר הלידה יום כפי שתואר לעיל 20,21,ing שניהם (טריפסין 0.025% 0.001% וDNase אני) אנזימטי וטכניקות מכאניות. עיין Whitlon et al. -22 ויירה ואח'. 23 לנהלים מפורטים של תרבות ספירלת גנגליון נוירון, או פארקר et al. 24 להפגנה של בידוד כישור.
- לשאוב כל פתרון poly-L-ornithine/laminin שנותר מאת coverslips ולשטוף בקצרה עם NBM.
- הוסף 150-200 μl של ההשעיה תא עצב גנגליון הספירלה ניתקה את coverslips ולמקום לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 10% CO 2). הערה: ניתן להכין עד 20 coverslips מהמלטה ממוצעת של 8 גורי חולדה.
- ארבע שעות אחרי נוירונים ציפוי, לשאוב את הפתרון להסרת תא פסולת ולהחליף עם NBM הטרי חימם μl 150-200. הערה: תקשורת עשויה לדרוש חידוש יומי כדי למנוע התייבשות.
- לחזור coverslips לחממה עד נדרשים עבור קלטות אלקטרו. הערה: ספירלה ניתקהתרבויות נוירון גנגליון יכולות לשמש לניסויי אלקטרו ארבע שעות לאחר ניתוק ולעד יומיים לאחר מכן. זמן במבחנה צריך להילקח בחשבון בעת הניתוח של תוצאות. לחדש NBM כל 24-48 שעות.
2. הכנה להקלטות מהדק תיקון
- הכן את פתרונות
- פתרון תאי (micropipette): 115 מ"מ K-גלוקונאט, 7 מ"מ KCl, 10 HEPES מ"מ, 0.05 מ"מ EGTA, 2 מ"מ Na 2 ATP, 2 מ"מ MgATP, 0.5 מ"מ Na 2 GTP (להתאים ל-pH 7.3 עם KOH; להסתגל ל295 / ק"ג mOsmol עם סוכרוז). לעבור את הפתרון באמצעות סינון סטרילי (0.2 מיקרומטר) ומחלקים ל200 aliquots μl להיות מאוחסן ב -20 ° C עד ליום ההקלטה.
- פתרון תאי (אמבטיה): 137 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgCl 2, 10 HEPES מ"מ, גלוקוז 10 מ"מ (להתאים ל-pH 7.4 עם NaOH; להסתגל ל300-310 mOsmol / ק"ג עם סוכרוז) . פתרון זה הוא עשה ביום ההקלטה.
- הכן micropipettes הקלטה עם התנגדות של 2-6 MΩ. אנו משתמשים בליזר CO 2 חולץ (P-2000; מכשירי סאטר) והתכה של זכוכית בורה (קוטר 1.0 מ"מ חיצוני; קוטר 0.58 מ"מ פנימי, אורך 75 מ"מ).
- הכן את לייזר. פרוטוקול זה מיועד לשימוש עם סיבי מצמידים לייזר, כגון גירוי עצב אינפרא אדום 1870 ננומטר מOptoTech P / ל ' הסיב האופטי המשמש למשלוח אור בניסויים שלנו הוא סיב מיקרומטר 200/220 ליבה / שכבת מגן קוטר סיליקה עם צמצם מספרי של 0.22 ומחברים FC-PC בשני קצותיו (AFW טכנולוגיות MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). את מיתרי התיקון נחתכו במחצית כדי לייצר שתי צמות סיבים (connectorized כלומר בקצה אחד והבקיע בשני). את ההשפעות של קוטר ליבת סיב וצמצם מספרי על שינויי טמפרטורה מושרה לייזר כבר נדונו בהרחבה על ידי תומפסון ואח'. 25
- קליב קצה סיב משלוח האור באמצעות טכניקות סטנדרטיותולהבטיח כי הקצה המתקבל הוא באיכות גבוהה על ידי התבוננות במיקרוסקופ אופטי (כלומר הקצה צריך להיות ניצב לציר הסיבים ויופיעו שטוח על בדיקה חזותית). חבר את סיבי האור למסירת פלט סיבי מצמידים של לייזר באמצעות הגירוי מתאים באמצעות מחבר (למשל Thorlabs ADAFC2).
- למדוד את כוח לייזר הפלט מהקצה ביקע של סיבי משלוח האור באמצעות מכשיר מתאים (למשל עם FieldMate קוהירנט LM-3 גלאי ראש). מומלץ לבדוק את כוח לייזר בכל פעם שמשלוח סיבי האור הוא ביקע או התאמה משמעותית הוא עשה לליזר (לדוגמא תחבורה ממעבדה אחת לשנייה).
- הכנס סיבי אספקת אור לצ'אק סיבים או מכשיר שווה ערך ולהדביק את צ'אק לmicropositioner המתאים. חשוב להיות מסוגל לקבוע את זווית θ שהסיב האופטי עושה עם coverslip במדויק. angl זהניתן למדידה בדואר על ידי לקיחת תצלום של ההסדר הניסיוני ושימוש בתוכנות עיבוד תמונה (למשל ImageJ) כדי להשיג את הזווית. זווית θ (או טווח זוויות אפשריות) היא מוגבלת בעיקר על ידי מגבלות מרחביות של הסדר ניסיוני - במיוחד במיקרוסקופ. ערכים אופייניים של θ בניסויים שלנו (המבוסס על מיקרוסקופ זקוף) הם סביב 36 מעלות, לעומת זאת זווית האופטימלית עשויה להיות שונה באופן משמעותי עבור setups חלופי (למשל אלה באמצעות מיקרוסקופ הפוכה).
- ליצור קשרים בין מערכת תיקון מהדק נתונים הרכישה (למשל Digidata 1440A, התקנים מולקולריים) כפי שמוצג באיור 2 והליזר. היציאה הדיגיטלית ממערכת נתונים רכישת מהדק התיקון צריכה להיות מחוברת לליזר באמצעות מחולל אותות חיצוניים, כך שניתן להגדיר פרמטרים דופק לייזר עצמאיים של מערכת איסוף הנתונים. לחלופין פלט זה יכול להיות מחובר ישירות לנהג לייזר (המחייב את אורך הפולס ושיעור החזרה שייקבעו על ידי תוכנת רכישת נתונים). בכל מקרה, את האות המשמשת להפעלת לייזר צריכה להיות מחוברת בחזרה לקלט של מערכת רכישת נתונים על מנת להבטיח כי העיתוי והאורך של פעימות לייזר ניתן להקליט במקביל לאות אלקטרו.
3. הקלטות מהדק תיקון לחקירת של אח"י
- מלא את המכל המתאים של מערכת זלוף עם פתרון תאי ולהתאים את קצב הזרימה לספק טפטוף של האמבטיה בשיעור של 1-2 מ"ל / דקה. אנו משתמשים בגרוויטציה מערכת (בקבוק aspirator, שסתום קורט, וצינור PE) עם דוד בשורה כדי לאפשר חימום מהיר של הפתרון, ומשאבת peristaltic להסיר פתרון בילה על ידי יניקה.
- מניחים coverslip עם תאים בתרבית לתוך תא ההקלטה (אמבטיה) של מיקרוסקופ זקוף. באמצעות מטרת מים טבילת ההגדלה גבוהה (ה. גרם. 40X) ושלב בניגוד (לעומת פער התערבות למשל או ניגוד שיפוע Dodt), מבחינה ויזואלית לאתר את תאי עצב הגנגליון הספירלה בתוך התרבות. נוירון גנגליון ספירלה טיפוסי הוא שלב בהיר, עגול וכ 15 מיקרומטר בקוטר עם גרעין בולט, כפי שמוצג באיור 1 א.
- ברגע שתא עצב כבר נמצא, לעבור למטרה בהגדלה נמוכה (למשל 10X) ולאתר את היעד בתוך נוירון שדה הראייה.
- הזז את הסיב האופטי משלוח האור למקומו באמצעות ההליך הבא (או שווה ערך):
- השתמש micropositioner להעביר סיבי הפלט עד הקצה קרוב לנוירון היעד בשני המישורים האופקיים ואנכיים. המצב האנכי של קצה הסיב יכול להיות מאומת על ידי נע מעלה ומטה האובייקטיבי (סריקת המיקוד).
- לעבור בחזרה למטרת ההגדלה הגבוהה ולמקם את הקצה של הסיב האופטי בתפקידו המיועד בסמוך לtהוא נוירון (ראה איור 2 הבלעה). בעת כוונון המיקום האנכי של הסיבים, חשוב שהקצה התחתון של הסיבים מונח על (כלומר רק נגיעה) coverslip, כדי למזער את אי הוודאות במיקום של הסיבים. היישור אופטימלי במישור האופקי יהיה תלוי בזווית θ שהסיבים עושה עם coverslip והרדיוס של R הסיבים. על מנת למקם את הסיב כך שהמרכז של נוירון היעד שוכן לאורך ציר הסיבים, מרחק האופקי בין הקצה העליון של הסיבים ותא המטרה צריך להיות
Δ target = R (cosec θ - 2 חטא θ),
שבו ערכים שליליים היו מציינים כי את סככות סיבים האופטיות לתא. כאשר יישור הסיבים, מרחק של יעד Δ בין הקצה העליון של הסיבים והמרכז של נוירון יכול להיות מושגת על ידי כ בדיקה חזותית. עם זאת יעד Δ נועדתשמש כקו מנחה גס בלבד. מיצוב הסיבים כך שהמרחק בפועל Δ בין הקצה העליון של הסיבים והמרכז של הנוירון מדידה שונה מΔ היעד (כמו באיור 1) יכול לספק תובנות לגבי ההשפעה של שניהם עקירת רדיאלי (כלומר מהמרכז עקירת קורה) וצירי (כלומר לאורך ציר הסיבים) של הקרן ביחס לנוירון היעד. לדוגמה, הגדרת Δ ≈ 0 יהיו צפויים להגדיל את הטמפרטורה המקומית באזור של התא - כלומר מאז פרופיל הקרן לסיבי multimode טיפוסיים הוא מקורב היטב על ידי הפצה עליונה כובע 26, הירידה באנרגיה נספגת באופן מקומי (טמפרטורה) בשל עקירה ממרכז האלומה הוא מינימאלי בהשוואה לעלייה באנרגיה נספגת מהזזת פני סוף הסיב קרוב יותר לתא.
אמנם יש להקפיד למקם את הסיבים בצורה מדויקת וrepeatably כפוssible באמצעות רמזים חזותיים, מדידה מדויקת של מיקום הסיבים יחסית ליעד נוירון (למשל Δ) הוא בעל חשיבות גדולה יותר ממיקומה במרחק קבוע מראש משם. ניתן לקבוע Δ (עם חוסר ודאות מרבי משוער של ± 3 מיקרומטר) על ידי ניתוח תמונה כמתואר בשלב 3.8.2 של הפרוטוקול. בכמה ניסויים 5,8, כבר מצמידים מקורות אור לבנים דרך הסיב על מנת למקד את התא הרצוי. גישה זו נמצאה כיעיל בהתקנת מיקרוסקופ הזקופה, כעוצמת האור מפוזר מאזור היעד הייתה נמוכה יחסית בזוויות הרדודות האלה (θ). - ברגע שהסיבים הוא במיקום, להזיז אותו על ידי סכום ידוע כדי לאפשר מיצוב ברור של micropipette. הסיבים אז יכולים להיות חזרו לעמדתו המקורית בעת הקלטה עצבית מושגת.
- מלא micropipette עם פתרון תאי ובאופן מאובטח שיתאים למקומו על הראשיםכאחוז מהמגבר (כגון התקני 700B, מולקולריים Multiclamp). באמצעות צינור המחובר לצדו של בעל microelectrode, להחיל כמות קטנה של לחץ חיובי כדי למנוע סתימה של micropipette.
- באמצעות micromanipulator, הזז את micropipette למקום בדיוק מעל נוירון היעד.
- פרוטוקול לכל הקלטות סלולריים:
- החל 10 אלפיות שנייה, 10 mV כיכר גל דופק (מבחן חותם למשל) במצב מתח מהדק של המגבר ולהתאים את פוטנציאל micropipette (פיפטה קיזוז) של האות לתחילת המחקר 0 NA. גם מבחן החותם צריך לשמש כדי לקבוע אם ההתנגדות של microelectrode נמצאת בטווח הרצוי (למשל 2 - 6 MΩ).
- תוך מעקב ההתנגדות, השתמש התאמות קנס של micromanipulator למקם micropipette עדינות על פני השטח של תא עצב היעד. כאשר micropipette נמצא במגע עם העצב, ההתנגדות תגדיל (על ידי ~ 0.5-1 MΩ). אניmmediately בעקבות עליית ההתנגדות, הסר את לחץ הנוזל החיובי וליישם את לחץ שלילי קטן. ברגע שהתנגדות עברה 10 - 20 MΩ, לתקן את קרום הפוטנציאל לרמה מחזיקה (למשל סביב -60 mV).
- התנגדות האלקטרודה צריכה להמשיך לעלות עד שהוא עולה על GΩ 1, מסמן כי חותם יעיל (שמכונה 'gigaseal') כבר נוצר בין קרום התא וmicropipette. בשלב זה, להסיר את כל לחץ הנוזל מmicropipette.
- ברגע שgigaseal כבר נוצר, השתמש בפולסים קצרים (הנוכחיים 25 עד 100 μsec; 1 V) או קטניות קצרות של לחץ נוזל שלילי לקרע של קרום התא ולהשיג את כל תצורת תא.
- רשום את קיבול הקרום, התנגדות והתנגדות סדרת קלט כפי שיקבע מעקומת מעריכי מצויד הנוכחי במהלך בדיקת דופק החותם. למזער את ארעיים קיבול על ידי התאמת בקרות CpFast וCpSlow על המגבר, אז switcשעות מגבר לכל מצב תא, ולפצות את הקיבול והתנגדות עד נוכחי שטוחה הוא ציין במהלך בדיקת החותם. החלת פיצוי התנגדות סדרה (~ תיקון 70%; 70% חיזוי), התאמת בקרות קיבול והתנגדות כדי לשמור על תגובת חותם מבחן שטוחה.
- מעבר למצב נוכחי מהדק במגבר. שימו לב לפוטנציאל הממברנה במנוחה (בהעדר ההזרקה הנוכחית). הגדרה נוכחית מחזיק לייצב את פוטנציאל הממברנה ברמה הרצויה (למשל -60 mV). לנטרל את קיבול פיפטה ולהתאים את איזון הגשר כדי לאזן את הירידה במתח.
- בדקו את מאפייני הירי של נוירון על ידי גירוי עם depolarizing הנוכחי (10-200 הרשות הפלסטינית ב10 צעדי הרשות הפלסטינית; 300 אלפיות משך זמן).
- להזיז את גב הסיב האופטי למקומו בסמוך לתא העצב. שימוש בתוכנת הדמיה מצמידים את מצלמת CCD, ללכוד תמונות של העמדה של הסיבים ביחס לנוירו היעדn, תוך התמקדות במישור של נוירון בתחילה, ולאחר מכן, בקצה העליון של הסיבים אופטיים (ראה איור 1).
- על ידי ניתוח שלאחר מכן מהתמונות שהתקבל (למשל 1b דמויות ו1 ג') ניתן לקבוע באופן מדויק Δ (עמדת הקצה העליון של קרוב המשפחה הסיב האופטי למרכז נוירון היעד). ברגע שΔ ידוע, ניתן לחשב פרמטרים כגון מרחק מהפנים סוף הסיבים לנוירון היעד (לאורך ציר הסיבים) z והעקירה הרדיאלי של נוירון ממרכז r δ הקרן באמצעות יחסים טריגונומטריות פשוטים:
Z = R חטא 2θ + cos θ Δ
δ r = ((r cos 2θ - Δ חטא θ) 2 + δy 2) 1/2,
בי δy הוא המרחק בין ציר הסיבים ומרכז נוירון כפי שניתן לראות מלמעלה למשל SE (דואר איור 1).
ניתוח צריך לקחת בחשבון וריאציות positional מתא לתא, כפי שהידע מדויק של מיקום פרמטרים אלה ייתכן שיהיה צורך לפתור את מחלוקות אפשריות בין תהליכי גירוי 25.
4. ניסויי INS
- בעת הקלטת נתונים אלקטרו באו מהדק נוכחי או תצורות מהדק מתח, הפעל את לייזר הגירוי בפרמטרים הרצויים (למשל חשמל, אורך הפולס, שיעור החזרה וכו '). עם לייזר שלנו, כוח האופטי נשלט באמצעות הזנה ישירה לנהג לייזר והיא מצוינת באופן ידני לפני כל הקלטה. אורך הפולס ושיעור החזרה יכולים להיות נשלטו על ידי מי ממחולל אותות חיצוני או תוכנת רכישת נתונים (כמתואר בשלב 2.3.4). ודא שנתונים הם משני ערוץ מהדק התיקון וערוץ הדק לייזר.
פעימות לייזר עם אורכים הנעיםמכל 500 μsec עד 15 אלפיות השני ואנרגיות של 0.25-5 ~ mJ לדופק בדרך כלל תשואת תגובות חשמליות הניתנות למדידה. הגדרת שיעור החזרה של פעימות לייזר כדי להיות הרץ 1 פחות או עשויה להיות שימושית עבור ניסויים ראשוניים, שכן הוא יהיה למזער את ההשפעות של פרמטר זה. תוצאות אופייניות המראות את השינוי באות המוקלטת מוצגות בסעיף הבא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נוירונים הגנגליון ספירלה להגיב לתאורת לייזר עם צורות גל הדיר בשני תצורות הקלטה נוכחי, מהדק מתח ומהדק. 3a איור מראה שינויים אופייניים בזרימה הנוכחית על פני קרום תא בתגובה ל2.5 אלפיות שנייה, 0.8 mJ דופק לייזר (תגובה ממוצעת מ6 פעימות לייזר, שחזרו במרווחים של 1 SEC) עם פוטנציאל הממברנה שנערך ב -70 mV, ו-60 mV -50 mV. זרמים פנימה נטו עוררו באופן עקבי בתגובה לפעימות לייזר, וחזרו לערכים ההתחלתיים לאחר ההארה חדלה. הצורה של הזרמים המושרה לייזר ניתן לראות להשתנות כפוטנציאל הממברנה הוא שונה, מצביע על כך שזה עשוי להיות חשוב לבצע ניסויים במגוון של פוטנציאלים המחזיקים על מנת להשיג הבנה מלאה של התהליכים שבבסיס אח"י. ניתן לבצע ניסויים אלה עם שינוי קל של הפרוטוקול הנוכחי ונותחו באמצעות טכניקות ומבוססות כגון תשלום במתח (ע"ע) ניתוח (SEדואר התייחסות 7 לדוגמאות של עקומות המתקבלות מע"ע אח"י במבחנה).
הנתונים המוצגים באיור 3 מעידים על השינוי בפוטנציאל הממברנה בדרך כלל על ידי עורר 2.5 אלפיות שנייה, 0.8 mJ דופק לייזר (קרום ראשוני פוטנציאל-73mV, בממוצע מעל 16 פעימות לייזר נמסרו בשיעור החזרה של 4 הרץ). הקלטות הנוכחיים מהדק להראות שלילת קוטביות קרום יציבה במהלך דופק לייזר ואחריו ירידה של כ מעריכי כיוון פוטנציאל הממברנה מנוחה אחרי הדופק. הדוגמא באיור 3 מציגה גם שלילת קוטביות קרום קטנה נוספת בעקבות דופק לייזר. שפירא ואח'. 7 הוכיחו כי שינויים המושרה לייזר בפוטנציאל הממברנה קשורים באופן הדוק לשינויים מקומיים בטמפרטורה (כלומר את הטמפרטורה בסביבה הישירה של התא). יתר על כן, המודל שתואר על ידי תומפסון ואח' 27.קבע כי בתנאים מסוימים יישור, דיפוזיה כתוצאה מטמפרטורה הדרגתיים צירית ורדיאלי באזור המואר יכולה להוביל לשינויים בטמפרטורה המקומיים דומים מאוד לשינויים בפוטנציאל הממברנה שמוצגים באיור 3. כתוצאה מממצאים אלו, הוא חשב כי עמדתו של תא המטרה ביחס לקצה פניו של סיבי משלוח האור משחקת תפקיד משמעותי בקביעה הן את מהלך הזמן של וריאציות לייזר עוררו בפוטנציאל הממברנה והטמפרטורה המקסימלית באזור של התא.
מאיר עם עודף אנרגיה או חשיפה לעליות חדות בטמפרטורה עלול לגרום לניזק לנוירון היעד. זה לעתים קרובות ניתן להבחין בהידרדרות של תכונות חשמליות של תא (לדוגמה: עלייה פתאומית בזרם נדרשת לשמור על פוטנציאל הממברנה ברמה קבועה, ו / או עלייה גדולה ברעש וחוסר יציבות בתוך האות). במקרה קיצונימוות של התאים של מתרחש באופן כמעט מיידי בחשיפת לייזר. איור 4 מראה הקלטת מתח מהדק למותו של תא עצב גנגליון ספירלה כתוצאה מחשיפה ל25 אלפיות שנייה, 8 mJ לייזר דופק.
איור 1. בניגוד שלב תמונות מראות נוירון גנגליון ספירלה טיפוסי ואת המיקומים היחסיים של סיב אופטי וmicropipette (כפי שניתן לראות מלמעלה) במהלך ניסויי גירוי אופטיים. נוירון גנגליון ספירלה טיפוסי). ב) הסיב האופטי בעמדה (תמונה מתמקדת בחלקו העליון קצה הסיב האופטי) ג) תמונות המציגות את עמדת מעולף הסיבים יחסית לתא (הערה:. הקצה העליון של הסיבים נטויים מעט התא כלומר Δ הוא שלילי). כפי שניתן לראות מy לעיל, δ והדלת"א; הם עקירה הרדיאלי של מרכז נוירון מהציר הסיבים ומרחק מהקצה העליון של הסיבים למרכז של נוירון בהתאמה. חצים מצביעים על מיקומו של תא עצב גנגליון הספירלה. ברים סולם 20 מיקרומטר.
איור 2. סכמטי של הגדרת הניסוי לניסויי גירוי אופטי (שלא בקנה מידה) הבלעה:. עמדה של סיבים וmicroelectrode יחסית לתא היעד אופטיים. θ, Δ וZ הם כהגדרתו בצעדי פרוטוקול 3.4.2 ו3.8.2.
איור 3.) מתח מהדק (תגובה ממוצעת מ6 פעימות לייזר deliveאדום בשיעור של 1 הרץ) ו-B) הנוכחי מהדק (תגובה ממוצעת של 16 פעימות לייזר חזר בשיעור של 4 הרץ) הקלטות מתא עצב הגנגליון ספירלה מראה שינויים המושרה לייזר בקרום פוטנציאלי נוכחית וקרום על ידי תאורה 2.5 אלפיות שנייה , 0.8 mJ לייזר דופק. אזורים מוצלים מצביעים על העיתוי של חשיפת לייזר. ריבועי להראות תגובות בתאורת לייזר ביתר פירוט. הערה: בהבלעה) מתמקדת בזכר שהושג עם פוטנציאל הממברנה של -60 mV. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. הקלטת מתח-clamp מראה מוות של תאים כתוצאה מחשיפה לדופק יתר על המידה אנרגטי (25 אלפיות שני, 8 MJ) בלייזר. שים לב שהמשרעת שלהאות מוצגת בNa והוא גדול באופן משמעותי מזרמי הרשות הפלסטינית שמוצגים באיור 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שימוש בפרוטוקולים שתוארו במאמר זה ניתן לחלץ ונוירונים הגנגליון ספירלה תרבות ולחקור לייזר עורר פעילות חשמלית על ידי ביצוע ניסויים שלמים מהדק תיקון סלולרי. כאשר נעשה שימוש במבחנה, טכניקת מהדק התיקון מספקת רמה של שליטה על פרמטרים של ניסוי שזה לא אפשרי בגוף חי. פרמטרים גירוי לייזר כגון אורך גל, דופק אנרגיה, אורך הפולס, צורת דופק, ורצפי חזרה דופק ניתן ללמוד במסגרת שחזור. בנוסף, הסביבה שבה תאי העצב נשמרים (טמפרטורת פתרון למשל, גורמים כימיים) יכולה להיות שיטתי מגוונת, כך שניתן ללמוד את המאפיינים בממברנה, ולכן מנגנוני גירוי עצבי אינפרא אדום. האינטראקציה בין שיטות גירוי חשמליות ואופטיות גם יכולה להיחקר באופן מבוקר. לימודי יסוד אלה יכולים להיות מתקדמים יותר על ידי החדרת FLבדיקות uorescent לעקוב אחר פרמטרים נוספים כגון ריכוזים יוניים או ביטוי של חלבוני הלם חום. הבנה ברורה של אלה פרמטרים השונים היא קריטית לא רק כדי להשיג הבנה מלאה של התופעה, אלא גם כדי להשיג גירוי יעיל יותר בתהליך אופטימיזציה.
בשל התפקיד החשוב שמלא בטמפרטורת המנגנון של אח"י 5-7, מדידה מדויקת של החימום המקומי בשל תאורת לייזר היא בעלת חשיבות עליונה בהגדרת מנגנון זה 27. שיטה מפורטת של קבלת מדידות טמפרטורה מכוילת על ידי הקלטת הזרם שזורם דרך פיפטה תיקון פתוחה תוארה על ידי יאו et al. -28 ומועסקות על ידי מחברים רבים, כדי לקבוע את הגודל ומהלך הזמן של שינויי טמפרטורה מושרה לייזר בסביבות נציג של אלה מצא במבחנה (לדוגמה ראה הפניות 7, 8). לספקד העמדה של סיבי אור המשלוח ניתן לקבוע במדויק (למשל באמצעות הפרוטוקול הנוכחי), שיטה זו של מדידת טמפרטורה עשויה לאפשר מיפוי מדויק של השינוי בטמפרטורה המקומי בשל גירויי INS טיפוסיים.
אורך הגל של לייזר המעורר הוא פרמטר שיש לשקול בניסויי INS, שכן שינויי טמפרטורה מושרה לייזר (ולכן את המנגנון הבסיסי של אח"י) מתווכים על ידי מאפייני הקליטה התלויים אורך הגל של מים 7 (ראה תומפסון et al. ל25 דיון מפורט בהשפעות הגל צפויות). מלבד לייזר דיודה ננומטר 1870 שימוש בפרוטוקול זה (אינפרא אדום עצבי ממריץ, Optotech P / L), מגוון רחב של אורכי גל וחבילות לייזר היה בשימוש על ידי מחברים אחרים. כמה דוגמאות נפוצות של הלייזרים המשמשים בפרסומי INS קיימים הן: לייזרי דיודה מAculight עם אורכי גל הנעים בין 1,840-1,940 ננומטר 6,7,10,13,16-18; הולמיום: YAG לייזר (2.12 מיקרומטר) מהליזר 1-2-3 6,11,12,14,15; ולייזרי דיודה הפועלים ב1,875 5,8 ננומטר, 1470 ננומטר 8, ו1,535 ננומטר 8 מSheaumann לייזר.
חסרון פוטנציאל של יישום טכניקה זו לנוירונים בתרבית הגנגליון ספירלה הוא שבשל גודלו הקטן יחסית של תאי העצב (~ קוטר 10-15 מיקרומטר), את האלקטרודה ההקלטה מוארת ישירות על ידי לייזר. היה מי שהציע כי תאורת לייזר מעבר לסף מסוים עלולה לשנות את המאפיינים של מעגל הקלטת 7 (כלומר חותם והתנגדות פיפטה). שפירא ואח'. 7 נמדדו סף זה על ידי מעקב אחר השינוי בפוטנציאל היפוך של עקומות QV ככוח לייזר הוגדל, מציאת אנרגיה דופק סף של 3 MJ. כגישה חלופית, יתכן שניתן יהיה לקבוע את סדר הגודל של השפעה זו על ידי מדידת ההתנגדות המשולבת של החותם ופיפטה בwמצב תא חור (למשל על ידי הקלטת התגובה הנוכחית ל10 אלפיות שנייה, 10 דופק מתח mV) ואילו משתנה הטמפרטורה של הפתרון תאי. על מנת להבין באופן מלא את המנגנונים של אח"י, הוא חיוני, כי שינויי התנגדות מושרה לייזר למדידה ונלקחים בחשבון.
נכון להיום רוב העבודה ניסויית בנוגע גירוי עצבי אינפרא אדום כבר התחייב in vivo. בעוד ספי חשיפה קורנות מדווחות לגירוי אינפרא אדום in vivo להשתנות במידה מה (למשל 0.32 JCM -2 ב2.12 מיקרומטר לחולדת עצבי sciatic 1, <0.1 JCM -2 ב1.855 מיקרומטר לעצבי שמיעה עכברוש 18), שהם נמוכים משמעותי מערכי סף שנקבעו באמצעות מחקרים במבחנה (לדוגמה כ 20 JCM -2 ב1.875 מיקרומטר לתאי עכבר רשתית הגנגליון ותאי הגנגליון שיווי המשקל חולדת 5,8, 8.3 ס"מ J -2 לcardiomy ילוד החולדהcytes 9). בשלב זה את הפרטים של תהליך אח"י אינם מספיק הבינו היטב להשערות לגבי הסיבה להיבדל זה, עם זאת, שימוש במודלים חוץ גופית, כגון תאי עצב שמיעה הדומות באופן הדוק ביעדים קודמים בעבודת vivo עשוי להיות יתרון במציאת הסבר .
חלק אחר במודלים חוץ גופית כרוכה בתאים גדולים יותר כגון ביציות Xenopus (~ קוטר 1 מ"מ) בשימוש על ידי שפירא ואח'. 7 אלה עשויים להיות שימושיים לחיטוט וריאציות מרחביים ביעילות של אח"י פני תאים בודדים על מנת לבדוק האם מרכיבים תאיים מושפעים על ידי גירוי. דגמים פשוטים יותר כגון שלפוחית bilayer שומנים עשויים לאפשר שליטה מדויקת עוד יותר על פרמטרים של ניסוי מאשר בניסויים במבחנה, אך מודלים אלו הינם מוגבלים למדי בהיקפו ולא לחשוף את מלוא המורכב של אח"י.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר האוסטרלי תחת הצמדת פרויקט מענק LP120100264.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. | |||
References
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. Optical Waveguide Theory. , Chapman and Hall. (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
