Summary
이 프로토콜에서는, 우리는 동시에 꿀벌 두 개의 유전자 (더블 유전자 최저를) 억제 두 가지 전략에 대해 설명합니다. 그럼 우리는 꿀벌 미각 지각을 두 번 유전자 최저의 효과를 연구하는 코 확장 응답 (PER) 분석을 사용하는 방법을 제시한다.
Abstract
이 비디오는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 주사를 사용하여 꿀벌에서 동시에 두 개의 유전자를 downregulate RNA 간섭 (RNAi의)의 소설 기법을 보여줍니다. 또한 미각 지각을 측정하기위한 코 확장 응답 (PER) 분석의 프로토콜을 제공합니다.
RNAi를 매개 유전자 때려 눕힘은 표적 유전자의 발현을 downregulating 효과적인 기술이다. 이 기술은 일반적으로 하나의 유전자 조작을 위해 사용하지만, 그것은 상호 작용과 유전자 사이의 공동 효과를 감지하는 한계를 가지고있다. 이 비디오의 첫 번째 부분에서, 우리는 동시에 두 개의 유전자 (더블 유전자 최저라고도 함) 노크하는 두 가지 전략을 제시한다. 우리는 두 전략을 효과적으로 규제 피드백 루프에있는 두 개의 유전자, 비텔로 제닌 (VG)과 ultraspiracle (USP)를 억제 할 수 있습니다 보여줍니다. 이 두 유전자 녹다운 방식은 유전자 사이의 상호 관계를 해부하는 데 사용할 수 있으며 쉽게 적용 할 수있다다른 종의 곤충.
이 비디오의 두 번째 부분은 두 유전자 최저의 치료 후 꿀벌의 코 확장 응답 (PER) 분석의 데모입니다. PER 분석은 꿀벌, 꿀 꿀벌의 행동 성숙이 얼마나 빨리에 대한 중요한 예측 인자로 미각 지각을 측정하는 표준 테스트입니다. 둥지 꿀벌의 큰 미각 인식은 종종 화분에 전문성을 구하고과 꼴의 발병 이전의 시대와 연관되어 증가 된 행동 발달을 나타냅니다. 또한, PER 분석은 꿀벌에 포만이나 굶주림의 대사 상태를 식별하기 위해 적용 할 수 있습니다. 마지막으로, 분석 원에 꿀벌이 널리 꿀벌의 학습과 기억 연구에 사용되는 에어컨에 대해 서로 다른 냄새 자극을 페어링과 함께.
Introduction
RNA 간섭 (RNA interference, RNAi) 진핵 생물의 다양한에서 발생하는 RNA 기반의 전사 후 유전자 침묵입니다. RNAi의 과정은 내인성 또는 외인성 이중 가닥 RNA (dsRNA) 전구체에 의해 트리거됩니다. dsRNA에 귀속 작은 조각 (20 ~ 25 BP)에 dsRNA의를 클리브 리보 뉴 클레아 단백질 주사위 놀이를 활성화합니다. 다음 dsRNA에 가이드의 작은 조각 argonaute 단백질에 의해 보완의 mRNA의 인식과 분열, RNA 유도 침묵 복합 (RISC) 1의 촉매 성분. 포유류, 30 NT 이상 dsRNAs는 RNA 전사 2 비특이적 저하로 연결 바이러스 반응 (인터페론 반응 IFN)을 활성화합니다. 그러나 긴 dsRNAs이 IFN 3의 부족이 있기 때문에 벌레에 효과적이고 구체적으로 입증했다.
긴 dsRNAs는 다른 곤충 종 표적 유전자의 downregulation은 사용되어왔다. 꿀 꿀벌 파이온 중 하나입니다EER 곤충 유기체는 어떤 개발 및 행동에 많은 중요한 유전자의 기능은 dsRNA가 4,5를 사용하여 공개하고 있습니다. 여러 dsRNA를 전달 방법은 꿀벌에서 수행되었습니다 dsRNA를 주입 꿀 꿀벌 배아 4 성인 꿀벌 7,8에서 유전자 최저에 대한 효과적인 접근 반면 dsRNA를 먹이는 효율적으로, 꿀벌 유충 6 표적 유전자 발현을 downregulates.
곤충에 dsRNA에 적용하여 전시 유전자 넉다운 효과를 과도 지역화 된입니다. 연구는 복부 dsRNA를 주입하고 가슴 dsRNA를 주입 모두 효과적으로 곤충 9,10의 복부 체지방 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 것으로 나타났습니다. dsRNA를이 세포가 10 목욕하는 혈 림프에서의 dsRNA를 취할 수 있습니다 복부 및 흉부 충치와 체지방 세포로 주입된다. 그러나, 난소와 뇌 등 다른 장기에서 유전자가 하나의 대상이 될 수 없습니다복부 또는 흉부 주사. 꿀벌 뇌의 유전자를 표적으로하기 위해, dsRNA를의 뇌 주입 효과적으로 지역의 뇌 영역 11 표적 유전자의 발현에 영향을주는, 수행되었습니다. 여기, 우리는 어른 꿀벌에 더 일반적으로 사용되는 복부의 dsRNA 주입을 문서화합니다.
RNAi를 주로 단일 유전자를 대상으로하는 데 사용되었습니다 및 유전자 기능을 밝혀하는 강력한 도구이다. 그러나, 어떤 유전자는 다른 사람들로부터 고립되지 않고 복잡한 규제 네트워크에 있습니다. 생물학적 과정을 이해하는 열쇠는 유전자가 여러 유전자의 동시 조작이 아닌 단일 유전자 최저를 요구하는 서로 상호 작용하는 방법을 해부하는 것입니다. 포유 동물 세포 라인에서, 과학자들은 전달 시스템 12 또는 다중 마이크로 RNA (miRNA의) 자형 디자인 13를 사용하여 동시에 억제 두 개 또는 세 개의 유전자에 성공했다. 그러나 곤충의 여러 유전자 knockdowns은 아직 검증되지 않은 수 있습니다. 여기, 우리는 프리젠이중 유전자 최저를 달성 할 수 t 다른 분사 전략. 난황 단백질 전구체를 인코딩 및 청소년 호르몬 (JH)에 대한 추정 수용체를 인코딩하고 ultraspiracle (USP)는 꿀벌의 JH 14에 대한 응답을 중재하는 전사 인자로서 역할을 할 수 비텔로 제닌 (VG) : 우리는 2 개의 유전자를 대상으로. VG와 JH는 피드백 루프 15 서로를 조절 꿀 꿀벌의 행동 규칙 9에 참여하고 있습니다. 두 유전자 최저를 사용하여, 우리 교란 VG 모두와 JH 경로, 그리고 그들이 공동으로 꿀벌의 행동과 생리학 및 방법 VG, USP 및 JH 9 상호 작용에 미치는 영향을 발견 할 수 있습니다.
미각 인식 꿀 꿀벌 사회적 행동 16 행동 예측이다. 높은 미각 인식과 행동 발달, 둥지 꿀벌 행동으로 성숙 빠르고, 일반적으로 삶의 초기 사료의 측면에서 꽃가루 16,17를 수집하는 것을 선호합니다. 하지만 규제 m미각 인식을 기본 echanisms는 연구 미각 지각이 내부 에너지 대사 9, 호르몬 분비 18,19 및 생물 발생 아민 20 통로로 연결되어있는 것으로 나타났습니다, 아직 불분명하다. VG와 JH 모두 변조 미각 인식 7,21 중요한 호르몬 레귤레이터이다. 실험실에서, 꿀벌의 미각 인식의 변화가 다른 자당 솔루션 코 확장 응답 (PER) 시험에 의해 평가 될 수있다. 각 꿀벌은 0.1 오름차순 농도 시리즈, 0.3, 1, 3, 10, 30 % 자당 다음에 물 방울과 그녀의 안테나를 모두 터치 테스트합니다. 물이나 자당의 물방울은 각 안테나에 터치하면 꿀벌이 완전히 그녀의 코를 확장하는 경우 긍정적 인 반응이 주목된다. 솔루션 긍정적 인 응답의 수에 따라 각 개인의 미각 인식 수준은 16 결정될 수있다. 그러나 PER의 응용 프로그램은 g의 측정에 국한되지 않습니다ustatory 인식. PER은 또한 포만 대 기아로 꿀벌의 대사 상태를 테스트 할 수있는 효과적인 방법입니다. 자당에 큰 반응과 꿀벌은 일반적으로 배고프 (왕과 Amdam, 게시되지 않은 데이터)입니다. 또한, PER 패러다임 꿀벌의 연관 학습과 기억에서 사용될 수있다. 이 경우 꿀벌은 냄새와 자당 물의 존재를 연결하는 훈련을한다. 꿀벌 관계를 배울 때, 냄새 만 존재 자당 22,23으로 그들을 보상을하지 않고 긍정적 코 응답을 보여주고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 이전의 연구 9 VG와 USP 더블 최저로 연결되어 미각 인식을 평가하는 PER을 수행하는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
1 부 : RNAi를 매개로 두 유전자 최저
1. dsRNA를 합성
- VG, USP와 꿀 꿀벌 게놈에없는 제어 유전자 인코딩 녹색 형광 단백질 (GFP)을 대상으로 dsRNAs의 디자인 프라이머 : 프라이머 온라인 무료 소프트웨어 Primer3 (사용하여 설계되었다 http://frodo.wi.mit.edu/를 ) .
- VG, USP 및 GFP에 대한 dsRNA를 합성 : 시험 관내 전사에 대한 프로 메가에서 사용 RiboMax T7 RNA 생산 시스템.
- dsRNA를 정화 :
- 변성 renaturation : 열 85 dsRNA에 ° C 5 분하고 1 시간 동안 실온에서 냉각시킨합니다.
- DNase의 I 처리 : 각 dsRNA의 반응에 1 μL DNase의 I를 추가하고 튜브를 가볍게 치면을 섞는다. 37 15 분 품어 ° C.
- 각 반응에 LS, 부드럽게 반전하여 그들을 혼합 - 150 μL nuclease가없는 물 750 μL TRIZOL 추가튜브를 erting. 30시 5 분 샘플을 품어 ° C.
- 각 샘플에 200 ㎕의 클로로포름을 추가합니다. 20 초 동안 적극적으로 섞는다. 4에서 12,000 XG에서 15 분 동안 원심 분리 ° C.
- 각각의 새로운 튜브에 뜨는 위상을 전송하고 각 튜브에 500 ㎕의 이소 프로필 알코올을 추가합니다. 반전 튜브로 그들을 섞는다. -20 ° C.에 20 분 동안 혼합물을 품어 4에서 12,000 XG에서 10 분 정도 원심 분리기 ° C.
- 상층 액을 제거하고 침전물을 씻어 1,000 ㎕의 75 % 에탄올을 사용합니다. 4에서 7,500 XG에서 5 분 튜브를 원심 분리 한 후 ° C, 건조한 공기 dsRNA의 펠렛과 펠렛을 녹여 핵산 무료로 물을 사용합니다. 유전자 아래로 규제의 효과를 보장하기 위해, dsRNA의 농도는 -10 약 9 ㎍ / μL해야한다.
2. dsRNA에 복부 사출
두 유전자 최저를 들어, 두 가지 전략이 있습니다 : 1) 단 하나 주입 두 유전자의 믹스 dsRNA를하고 인제코네티컷 혼합물 2) 이틀 주입 : 첫 번째 날에 하나의 유전자를 대상으로 한 최초의 dsRNA를 주입하고, 둘째 날에 동일한 꿀벌에 두 번째의 dsRNA를 주입.
- 냉기 새로 1 ~ 2 분 동안 4 ° C 냉장고에 꿀벌 나타났다. 꿀벌이 고정되면, 자신의 복부 및 thoraces 사이에 교차 곤충 핀 고체 왁스의 전체 배양 접시에서 병렬로 3-4 벌을 마운트합니다.
- 4 ° C 냉장고에 다시 벌을 진정. 꿀벌이 완전히 고정되어 있는지 확인. 그것은 약 1-2 분 걸립니다. 꿀벌이 느슨해 보일 것입니다. 꿀벌 말리거나 뒤틀린 될 경우, 그것은 그들이 너무 오래 피해야하는 냉각 의미합니다. 휴식이 너무 높은 사망률의 원인이 있지만 운동 부상과 사망의 크기를 증가로 완전 고정이 중요합니다.
- 해밀턴 마이크로 주사기 일회용 30 G 바늘 (BD)를 넣습니다. 3 μL의 dsRNA를 타고 주사기에 공기 기포가 없는지 확인합니다. 바늘 DAMA을 방지하기 위해 복부의 측면에 삽입내부 장기를 끼울. dsRNA를 흡수 할 수 있도록 천천히 주사기 플런저를 누르십시오. dsRNA를 매우 점성 때문에, 완전히 주사기에서 추방되는 2 ~ 3 초 정도의 시간이 소요됩니다. 완전히 플런저를 아래로 누른 후, 4-5 초 동안 상처에 바늘을 둡니다. 주사 후 3-5 초 동안 꿀벌을 준수하십시오. 상처 혈 림프 물방울 누출되면 꿀벌을 버린다.
- 다른 치료에 해당하는 자신의 thoraces을 표시하기 위해 다른 색상을 사용합니다. 단일 분사 전략이 사용 된 경우이 시점에서, 꿀벌은 1 시간 관찰 후 식민지로 다시 배치 할 수 있습니다. 이틀 분사 전략이 사용 된 경우, 최초의 dsRNA에 주입 된 후, 꿀벌 측에 제공 꿀 실린더 메쉬 케이지에 배치되어야하고, 34에서 인큐베이터에 보관 ° C와 80 %의 습도 .
- 둘째 날, 메쉬 새장에 꿀벌을 진정하고 왁스 접시에 그들을 마운트하는 단계 2.2 및 2.3을 따릅니다. 이 descri 그대로 두 번째 dsRNA가와 주사를 수행2.4 단계에있는 침대입니다.
- 꿀벌은 실온에서 1 시간 동안 복구하고 식민지로 그 (것)들을 소개하겠습니다.
참고 : 넉다운 효과를 정량적 RT-PCR (QRT-PCR)과 웨스턴 블로 팅에 의해 감지 할 수 있습니다. 일반적으로, 최저 효능은 다양하고 많은 요인에 따라 달라집니다. 본 연구에서는 두 유전자 녹다운은 7 일 단일 주사하고 이틀 주사 한 후 검색 할 수 있습니다.
2 부 : 코 확장 응답 (PER) 분석
1. 하이브에서 꿀벌 수집
주사 후 6 일째, 흡연자를 사용하지 않고 식민지에서 처리 꿀벌를 수집합니다. 금속 메쉬 실린더 케이지 꿀벌를 수집합니다. 각 케이지에 3 꿀벌을 유지합니다.
2. PER에 대한 설치 꿀벌
그들은 완전히 고정되어 ° C까지 4시에 꿀벌을 진정. 특별히 PER을 위해 설계 플라스틱 튜브를 수직으로 각 벌을 마운트합니다. 저기서하여 관 내부의 복부를 유지G 두 개의 작은 테이프의 조각, 그리고 관의 바깥으로 튀어 나와 머리를 유지합니다. 작은 플라스틱 열 개의 행이있는 랙에 튜브를 넣어 ID 번호와 함께 각 튜브 (꿀벌)을 지정합니다. 다음 인큐베이터 (34 ° C 및 80 % 습도)로 랙에 처리 꿀벌을 넣고 2 시간 동안 인큐베이터에 보관하십시오.
3. 자당 수용액 시리즈를 준비
0 %로, 0.1 %, 0.3 %, 1 %, 3 %, 10 % 및 30 %의 자당 수용액을 준비하고 15 ~ 20 G 바늘 주사기로 솔루션을로드합니다.
4. 분석 PER
0.1 %, 0.3 %, 1 %, 3 %, 10 % 및 30 %의 자당 수용액 다음에 0 %로 용액 (물)의 물방울과 꿀벌의 안테나를 누릅니다. 먼저 물을 모든 꿀벌을 테스트하고 각 솔루션 사이의 간격을 최소한 2 분을 사용 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 일반적으로 각 시험에 대해 적어도 20 꿀벌이 있습니다. 꿀벌이 완전히 그녀의 코를 확장하는 경우, 긍정적 인 반응이 계산됩니다.
5.데이터 관리
미각 응답 점수 (GRS) 각 개인에 대한 총 긍정적 인 반응을 요약. 데이터의 적절한 통계 분석을 수행합니다.
제 3 부. 유전자 최저 검증
지방 기관은 7 일 이전 처리 꿀벌의 또 다른 세트에서 해부한다. 표준 TRIZOL 절차는 DNase의 I 처리 24 뒤에 RNA 추출에 사용됩니다. VG와 USP 유전자 발현은 두 단계 QRT-PCR. 액틴에 의해 분석이 다른 조직에 안정된 표정을 가지고 있기 때문에 참조 유전자로 사용됩니다 꿀벌의. VG와 USP 유전자 게시 실시간 PCR 프라이머는이 실험 24에서 사용됩니다. 데이터가 델타 - 델타 CT 방법 25을 사용하여 분석됩니다.
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Representative Results
단일 주입 및 2 일 분사 전략이 모두 크게 꿀벌의 성적 수준 VG (편도 ANOVA, p <0.001) (그림 2A) 및 USP (편도 ANOVA, p <0.001) (그림 2B)를 감소 dsRNA에 6 일 후가 주입되었다. dsRNA의 혼합물로 단일 분사와 VG 첫 번째와 USP 초 (VG / USP)로 이틀 주사를 사용하여 USP 성적 증명서의 억제 USP 첫 번째와 VG 초 (USP / VG)을 이틀 주사보다 유의하게 낮았다 (사후 분석, p 혼합물 대 USP / VG = 0.013, p VG / USP 대 USP / VG = 0.019).
더블 최저 꿀벌의 GRS는 GFP 제어 꿀벌 (학생 T 테스트, p = 0.0496) (그림 3)보다 훨씬 높았다.
그림 1. RNA 간섭 (RNAi의) / 코 확장 응답 (PER) 분석. 50 새로 등장 꿀벌의 4 개의 그룹의 흐름도 또는 다른 조합 전략을 사용하여 이중 가닥 비텔로 제닌의 RNA (dsRNA를) (VG)과 ultraspiracle (USP)로 주입 하였다 꿀벌 게놈에 존재하지 않는 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자의 dsRNA를 가진. 꿀벌은 주사 후 하이브로 배치 된, 6 일 후에 수집되었다. 그룹 당 여섯 벌은 실시간 PCR을 이용하여 유전자 최저 검증을 위해 수집 및 그룹 당 서른이 코 확장 응답 (PER) 분석을위한 하였다 하였다. 'GFP dsRNA에'는 GFP dsRNA를 주입 꿀벌을 나타냅니다; 'VG + USP 혼합물'에서 꿀벌을 나타냅니다VG와 USP dsRNA의 혼합물로 수립하여야한다, 'VG / USP'는 두 번째 날에 USP dsRNA를 주입 첫날에 VG dsRNA를 주입 꿀벌를 나타냅니다; 'USP / VG'는에 USP dsRNA를 주입 꿀벌을 나타냅니다 첫날과 둘째 날 VG dsRNA를 주입.
그림 2. 실시간 PCR을 사용하여 두 유전자 최저 검증. 처리 꿀벌의 복부 체지방의 변화 mRNA의 상대적인 값 (± SEM을 의미) 로그인합니다. mRNA의 상대 값은 델타 - 델타 CT 방법을 사용하여 계산 하였다. (A) VG 식 육일 dsRNA를 주입 한 후. VG 성적이 크게 세 번 K로 하향 조절 하였다 nockdown 방식 (편도 ANOVA, p <0.001) 6. 일 dsRNA를 주입 한 후 (B) USP 식입니다. USP 성적이 크게 세 번 넉다운 방식 (편도 ANOVA, p <0.001) 감소 하였다. 그러나 dsRNA의 혼합물 및 VG / USP 주사 꿀벌의 USP 식 USP / VG (사후 분석, p 혼합물 대 USP / VG = 0.013, p VG / USP 주사 꿀벌에 비해 훨씬 낮았다 대 USP / VG = 0.019)는, VG는 VG와 JH 규제 루프에서 기본 조절 될 수 있다는 것을 나타냅니다. 'RQ'는 대상 유전자 전사의 상대 정량 수준을 나타냅니다. 바 위의 서로 다른 문자는 치료 그룹 사이에 큰 차이를 나타냅니다.
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그림 3. 코 확장 응답 (PER) 분석을 사용하여 미각 응답 점수 (GRS)가. VG와 USP dsRNA를 혼합 주입 된 꿀벌들은 자당에 더 민감했다 나타내는 GFP 컨트롤보다 높은 GRS했다. 바 위의 서로 다른 문자는 치료 그룹 (학생 T 테스트, p = 0.0496) 사이에 유의 한 차이를 나타냅니다.
그림 4. 가능한 규제 유전자 네트워크는 VG와 USP 더블 최저 접근법을 사용하여 발표했다. 청소년 호르몬 (JH)가 꿀벌의 두뇌에서 생산 혈 림프로 분비됩니다. 비텔로 제닌 (VG)은 체지방 세포에 의해 생산 된 난황 단백질 전구체이다. VG와 JH 대사 생리를 조절하는 피드백 루프에OGY, 미각 인식, 그리고 꿀벌의 선호도를 구하고과 꼴의 발병 연령. 연구는 ultraspiracle (USP)는 JH에 대한 추정 수용체와 전사 인자의 역할을 할 수 있습니다하는 것이 좋습니다. VG와 USP의 우리의 이중 최저는 VG 단일 최저보다 JH에 큰 증가를 야기 우리는 VG와 USP의 두 최저를 발견했다. VG는 VG, USP 및 JH 간의 관계 1. 중앙 역할을 제시하고, USP 단일 최저있다 JH에 변화를 유도하지 않았다. 그것은 VG는 JH 생산을 억제뿐만 것을 제안하지만, USP의 최저 (A)에 JH의 피드백 반응을 억제한다. 두 knockdowns에서 VG의 감소 억제에서 JH 생산 결과의 극적인 증가는 VG의 최저 및 USP의 최저 (B). 2에 의한 감소 JH의 전달에 대한 보상 반응에 의해 발생합니다. 우리는 USP 발견VG는 VG는 USP mRNAto의 dsRNA를의 감도를 억제 제안, 주로 또는 동시에 downregulated 때 성적 풍부 더 USP dsRNA에 의해 감소되었다. 어떻게 VG는 RNA 간섭 (RNAi의)에 관여 할 수 있는가? VG 꿀 꿀벌 면역 방어와 RNAi의 항 바이러스 타고난 면역 시스템의 일부입니다 조절합니다. 우리의 이전 연구는 argonaute 3 (GB19389, piwi), RNA 유도 침묵 복합 (RISC)의 중요한 구성 요소, 꿀 꿀벌 사회적 행동 (미각 인식, 발병 연령 선호하는 꼴을하고 꼴)을 좌우하는 후보 유전자 중 하나입니다 보여줍니다 VG / JH 모듈에 의해 제어됩니다. 따라서, 하나의 가능성은 VG는 RISC (A)의 활동에 영향을 미치는 argonaute 단백질을 억제 할 수 있다는 것입니다. VG가 downregulated 때, USP dsRNA를보다 효율적으로 USP mRNA의 (B). 3을 저하시킬 수 있습니다. 우리 배 최저의 연구는 또한 USP 수행을 보여준다어느 하나의 USP 최저는 VG 성적 증명서 풍부 영향을 미치는 않으며, 두 VG와 USP의 최저는 VG 성적의 추가 감소의 원인이되기 때문에 지방이 몸 VG 생산에 JH의 억제 효과를 중재하지. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
우리의 연구는 동시에 성충 두 개의 유전자를 허물고하는 최초의 노력입니다. 우리의 결과는 dsRNA를 주입 (단일 주입 및 2 일 분사)의 두 가지 전략은 두 유전자 억제하고, VG와 USP의 동시 유전자 침묵에 대한 효과적인 육일 꿀벌 8,9에 dsRNA를 주입 한 후 테스트 할 수있는 것을 보여줍니다. 그러나 유전자 넉다운 효과는 세포 또는 기관에 의해 표적 유전자, 단백질 회전율과 dsRNA를 흡수 효율의 성적 수준에 따라 서로 다른 종의 곤충 다릅니다. 또한, RNAi의 효과는 농도 의존적이다. 우리는 새로 등장 꿀벌이 잘 μL의 dsRNA를 받아 들일 수 찾았지만, 4 개 이상의 μL의 dsRNA가 주입 된 경우 사망률이 급격히 증가. 따라서, 이틀 분사 전략은 사출 볼륨의 높은 금액을 필요로 실험 한 주사보다 더 적합 할 수 있습니다.
여기, 두 유전자 최저 9
예를 들어, VG와 JH 꿀 꿀벌 생리학 9과 행동 성숙 26,27을 조절 피드백 루프에 있습니다. 이전 연구는 JH의 국소 응용 프로그램 VG 식 29을 줄일 수있는 반면 VG 유전자 녹다운이 꿀벌 28 JH 수준을 높일 수있는 것으로 나타났습니다. 또한, 연구는 USP는 JH에 대한 추정 수용체 제안하고, 전사 인자 14,30로 JH 응답을 중재 할 수 있습니다. 그러나 어떻게 VG는 JH 역가를 조절하고 USP는 JH에 의해 VG의 조절에 관여 여부를 여전히 제대로 이해하고 있습니다. 더블 최저 접근법 사용하여, 우리는 VG, USP 및 JH (사이 상세한 상호 관계를 발견했다
PER 꿀 꿀벌 사회 행동 35의 개발을위한 예측으로 사용되었습니다 꿀벌에 미각 지각을 측정하기위한 표준 분석이다. 설탕에 높은 감도를 가진 꿀벌은 일반적으로 초기 생활에서 먹이 찾아 돌아다 시작하고 꽃가루를 수집하는 것을 선호합니다. 미각 지각은 또한 다른 대규모 행동 연구가 수행되기 전에 사회적 행동에 대한 치료 효과를 예측 테스트 할 수 있습니다. 또한, 우리는 포식과 기아 수준을 식별하는 데 이용 될 수있다 PER 미각 인식은 내부 신진 대사 상태에 따라서 9와 상관 것으로 나타났습니다. 또한, PER 냄새 조건 짝이 학습을 공부 고용꿀벌과 메모리. 종합적으로 분석 PER 꿀벌의 행동과 대사 생리학 공부를위한 매우 유용한 기술입니다. 그러나 PER이 방법에게 36 처리에 민감합니다. 예를 들어, 냉각에 의한 마취 또는 CO 2 있었다 꿀벌 컨트롤 36보다 자당에 더 반응했다. 또한 PER 하루 동안의 변화와 환경 조건과 스트레스에 민감합니다. 따라서 환경과 실험 기간 동안 일관된 절차를 유지하는 것이 매우 중요합니다. 일반적으로, 우리는 아침에 PER 완료하고 다음과 같은 일에 같은 일정을 따릅니다. 우리는 보통 오전 8시에 이른 아침에 꿀벌 수집을 시작하고, 당을 위해 준비하기 3 시간이 걸립니다. PER 요구를 며칠에 걸쳐 수행해야하는 경우, 경우 환경 변화에 짧은 기간에 완성하는 것이 중요합니다. 최소 2 분 간격으로 서로 다른 concentrati 사이에 유지해야하기 때문에 PER은 그룹으로 촬영되어야하며, 각 그룹은 20 개 이상의 꿀벌을 포함해야자당 솔루션의 기능. 우리는 그룹 당 75-100 꿀벌을했다.
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Acknowledgments
저자는 실험 지원을위한 에린 Fennern에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 노르웨이 연구위원회 (180504, 185306 및 191699), PEW 자선 신탁, 그리고 노화에 국립 연구소 (NIA P01 AG22500)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GE Healthcare PCR beads in 96 well plate | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| RiboMax T7 RNA production system | Promega | P1300 | |
| Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Hamilton micro syringe | Hamilton | 80301 | |
| 30G BD disposable needles | BD Biosciences | 305106 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30960 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Wax plate |
References
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