Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

RNAi-medieret Double Gene Knockdown og gustatoriske Perception Måling i Honey Bees ( Published: July 25, 2013 doi: 10.3791/50446
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1School of Life Sciences, Arizona State University, 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

Summary

I denne protokol, beskriver vi to strategier, der samtidig undertrykker to gener (dobbelt gen knockdown) i honningbier. Så præsenterer vi, hvordan du bruger snabel forlængelse respons (PER) assay for at undersøge effekten af ​​dobbelt gen knockdown på honningbi gustatory perception.

Abstract

Denne video viser nye teknikker til RNA-interferens (RNAi), der nedregulere to gener samtidig i honningbier anvender dobbelt-strenget RNA (dsRNA) injektioner. Det præsenterer også en protokol snabel forlængelse respons (PER) assay til måling gustatory perception.

RNAi-medieret gen knockdown er en effektiv teknik nedregulere målgenekspression. Denne teknik er normalt bruges til enkelt genmanipulation, men det har sine begrænsninger til at opdage interaktioner og fælles effekter mellem gener. I den første del af denne video præsenterer vi to strategier til samtidig vælte to gener (kaldet dobbelt gen knockdown). Vi viser begge strategier er i stand til effektivt at undertrykke to gener, vitellogeninrespons (VG) og ultraspiracle (USP), som er i en regulerende feedback-sløjfe. Denne dobbelte gen knockdown fremgangsmåde kan anvendes til at dissekere sammenhænge mellem gener og kan let anvendes iforskellige insektarter.

Den anden del af denne video er en demonstration af snabel forlængelse respons (PER) assay i honningbier efter behandlingen dobbelt gen knockdown. Den PER-analysen er en standard test for at måle gustatory opfattelsen i honningbier, hvilket er en vigtig prædiktor for, hvor hurtigt en honningbi adfærdsmæssige modning er. Større gustatory opfattelse af reden bier indikerer øget adfærdsmæssig udvikling, som ofte er forbundet med en tidligere alder ved debut af fouragerende og fouragere specialisering i pollen. Desuden kan PER assay anvendes til at identificere metaboliske tilstande af mæthed eller sult i honningbier. Endelig PER assay kombineret med parring forskellige lugt stimuli til konditionering bierne er også almindeligt anvendt til indlæring og hukommelse studier i honningbier.

Introduction

RNA-interferens (RNAi) er RNA-baseret post-transkriptionel gendæmpning, som forekommer i en lang række eukaryote organismer. Processen med RNAi udløses af endogene eller exogene dobbeltstrengede RNA (dsRNA) forstadier. DsRNA aktiverer ribonuklease protein Dicer, som binder og spalter dsRNA til små fragmenter (20-25 bp). Så de små fragmenter af dsRNA'et guide en anerkendelse og spaltning af komplementære mRNA ved argonaute proteiner, en katalytisk bestanddel af RNA-induceret silencing kompleks (RISC) 1.. I pattedyr aktivere dsRNAs længere end 30 nt, et antiviralt respons (interferon respons, IFN), som fører til ikke-specifik nedbrydning af RNA transkripter 2.. Imidlertid har lange dsRNAs vist sig at være effektiv og specifik i insekter, da der er en mangel på denne IFN 3..

Lange dsRNAs er blevet anvendt til nedregulering af målgener i forskellige insektarter. Honningbier er en af ​​pionEER insekt organismer, hvor funktioner mange vigtige gener i udvikling og adfærd er blevet afsløret ved hjælp af dsRNA 4,5. Adskillige dsRNA levering metoder er blevet udført i honningbier: dsRNA fodring effektivt nedregulerer target genekspression i honningbi larver 6, mens dsRNA injektion er en effektiv metode til gen-knockdown i honningbi embryoner 4 og voksne bier 7,8.

Gene Knockdown effekter udstillet ved anvendelse dsRNA til insekter er forbigående og lokaliseret. Undersøgelser har vist, at begge abdominal dsRNA injektioner og thorax dsRNA injektioner effektivt undertrykke målgenekspression i abdominal fedt kropsceller af insekter 9,10. DsRNA sprøjtes ind mave-og thorax hulrum og fedt kropsceller er i stand til at tage op dsRNA fra hæmolymfe hvor cellerne er badet 10.. Dog kan gener i andre organer, såsom æggestokke og hjerne, ikke målrettes ved entenabdominal eller thorax injektioner. For at målrette gener i honningbi hjerne, har hjerne injektion af dsRNA også blevet udført, hvilket faktisk påvirker målgenekspression i lokale områder i hjernen 11. Her har vi kun dokumentere abdominal dsRNA indsprøjtning, som er mere almindeligt anvendt i voksne honningbier.

RNAi har primært været brugt til at målrette et enkelt gen, og har været et effektivt redskab til at afsløre genfunktionen. Imidlertid helst gen ikke isoleret fra andre, og det er i komplekse regulerende netværk. En nøgle til at forstå en biologisk proces er at dissekere hvordan gener interagerer med hinanden, hvilket kræver samtidige manipulationer af flere gener snarere end et enkelt gen Knockdown. I mammaliacellelinier, har forskerne lykkedes samtidig hæmmer to eller tre gener ved hjælp af doseringssystemer 12 eller flere microRNA (miRNA) hårnål designs 13.. Men i insekter, er flere gen knockdowns stadig uprøvet. Her har vi præsentat forskellige injektionssteder strategier, som kan opnå en dobbelt gen knockdown. Vi målretter to gener: vitellogenin (VG), som koder for en æggeblomme proteinprecursor, og ultraspiracle (USP), der koder for en putativ receptor for juvenil hormon (JH) og kan tjene som en transkriptionsfaktor medierende svar til JH 14 i honningbier. Vg og JH regulere hinanden i en feedback-sløjfe 15 og er involveret i honningbi adfærdsregulering 9.. Brug af dobbelt-genet knockdown, vi forstyrrer både Vg og JH veje, og opdag, hvordan de i fællesskab påvirker honningbi adfærd og fysiologi, og hvordan vg, USP og JH interagere 9..

Gustatory opfattelsen er en adfærdsmæssig indikator for honningbi social adfærd 16. Med hensyn til adfærdsmæssige udvikling, reden bier med høj gustatory opfattelse adfærdsmæssigt modne hurtigt, og normalt foder tidligt i livet og foretrækker at indsamle pollen 16,17. Selvom regulerende mechanisms underliggende gustatory opfattelse er stadig uklart, har undersøgelser vist, at gustatory opfattelse er knyttet til interne energi stofskifte 9, hormonel sekretion 18,19 og biogenetisk amin veje 20. Både Vg og JH er vigtige hormonelle regulatorer modulerende gustatory opfattelse 7,21. I laboratoriet kan en variation af gustatory opfattelse i honningbier blive evalueret ved at teste snabel forlængelse respons (PER) til forskellige rørsukkeropløsning. Hver bi testes ved at røre både hendes antenner med en dråbe vand efterfulgt af en stigende koncentration serie af 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% saccharose. Et positivt svar er noteret, hvis en bi fuldt udvider hendes snabel, når en dråbe vand eller sucrose er rørt til hver antenne. Baseret på antallet af positive reaktioner på de løsninger, kan smagssansen opfattelse niveauet af enkelte bestemmes 16. Imidlertid er anvendelsen af ​​PER ikke begrænset til måling af gustatory perception. PER er også en effektiv metode til at teste den metaboliske tilstand af bier såsom mæthed vs sult. Bierne med større reaktioner på sucrose er mere sulten i almindelighed (Wang og Amdam, upublicerede data). Endvidere kan PER paradigme også anvendes i associativ indlæring og hukommelse i honningbier. I dette tilfælde bier vil blive uddannet til at associere tilstedeværelsen af ​​saccharose vand med en lugt. Når bierne lærer foreningen kan kun tilstedeværelsen af lugten fremkalde en positiv snabel respons uden at belønne dem med sucrose 22,23. I denne video viser vi, hvordan du udfører PER at evaluere gustatory opfattelse, som har været forbundet med vg og USP dobbelt knockdown i en tidligere undersøgelse 9..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Del 1: RNAi-medieret dobbelt gen knockdown

1.. dsRNA Syntese

  1. Design primere af dsRNAs målrettet vg, USP og en kontrolgruppe gen, der koder grøn fluorescens protein (GFP) som ikke er i honningbien genomet: primere blev designet ved hjælp af online gratis software Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. dsRNA syntese for vg, USP og GFP: brug RiboMax T7 RNA produktionssystem fra Promega for in vitro-transskription.
  3. dsRNA oprensning:
    1. Denaturering og renaturering: varme dsRNA til 85 ° C i 5 min og lad den afkøle ved stuetemperatur i 1 time.
    2. DNase I-behandling: Tilsæt 1 ml DNase I i hver dsRNA'et reaktion og bland dem ved at tænde rørene. Inkuber i 15 minutter ved 37 ° C.
    3. Tilsæt 150 pi nuklease-frit vand og 750 pi Trizol - LS i hver reaktion, og forsigtigt blandes de ved inverting røret. Inkuber prøverne i 5 min ved 30 ° C.
    4. Tilsæt 200 ul kloroform i hver prøve. Bland kraftigt i 20 sek. Centrifuger prøverne i 15 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
    5. Supernatanten overføres fase til hver ny rør og tilsættes 500 pi isopropylalkohol i hvert rør. Bland dem ved at vende røret. Inkuber blandingen i 20 minutter ved -20 ° C. Centrifugeres den i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
    6. Fjern supernatanten og bruge 1.000 pi 75% ethanol til at vaske bundfaldet. Efter centrifugering af røret i 5 minutter ved 7.500 xg ved 4 ° C, lufttørre dsRNA pellet, og bruge nuclease frit vand til at opløse bundfaldet. For at sikre effektiviteten af ​​genet ned-regulering bør dsRNA koncentration omkring 9 -10 ug / ul.

2.. dsRNA Abdominal Injection

For dobbelt gen knockdown, er der to strategier: 1) enkelt injektion: mix dsRNA af to gener og inject blandingen, 2) to-dages injektion: injicere første dsRNA målrettet et gen på den første dag, og injicere den anden dsRNA ind i de samme bier på andendagen.

  1. Chill nyopstået bier i et 4 ° C køleskab til 1-2 min. Når bierne er immobiliserede, montere 3-4 bier parallelt på petriskåle fulde af fast voks med insekt ben krydsede mellem deres underliv og thoraces.
  2. Chill bierne igen i en 4 ° C køleskab. Sørg bierne er helt immobile. Det tager omkring 1-2 min. Bierne skal se løs. Hvis bierne bliver krøllet eller forvredne, det betyder, at de nedkøles for lang hvilket bør undgås. Nedkøling for meget forårsager høj dødelighed, men fuldstændig immobilisering er vigtigt, da enhver bevægelse øger størrelsen af ​​såret og dødelighed.
  3. Sæt en engangs 30 G kanyle (BD) på en Hamilton micro sprøjte. Tag 3 pi dsRNA og sørg for der er ingen luftboble i sprøjten. Nålen indsættes i en side af underlivet at undgå Damaging indre organer. Tryk sprøjtens stempel langsomt at tillade dsRNA at blive absorberet. Da dsRNA er meget tyktflydende, det tager 2-3 sek at være helt udstødt fra sprøjten. Efter fuldstændig skubbe stemplet ned, lade nålen i såret for 4-5 sek. Overhold bier i 3-5 sek efter injektioner. Hvis en hemolymph dråbe lækager fra såret, kasseres bi.
  4. Brug forskellige farver til at markere deres thoraces svarende til forskellige behandlinger. På dette punkt, hvis den enkelt injektion strategi blev anvendt, kan bierne sættes tilbage i en koloni efter 1 time observation. Men hvis de to-dages injektion strategi blev anvendt, efter at være blevet injiceret med den første dsRNA bør bierne placeres i en cylinder mesh bur med honning leveres på siden og holdes i en inkubator ved 34 ° C og 80% luftfugtighed .
  5. På andendagen, følg trin 2.2 og 2.3 til nedkøling bierne i mesh bure, og montere dem på voks plader. Udfør injektioner med den anden dsRNA som det er beskreseng i trin 2.4.
  6. Lad bierne inddrive ved stuetemperatur i 1 time og indføre dem i en koloni.

Bemærk: Knockdown virkninger kan påvises ved kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og western blotting. Varierer generelt knockdown effektivitet og afhænger af mange faktorer. I vores undersøgelse, kan den dobbelte gen knockdown påvises 7 dage efter enkelte injektioner og to-dages injektioner.

Del 2: Proboscis udvidelse respons (PER)-assay

1.. Indsamling Bier fra Hive

På dag 6 efter injektionerne, indsamle behandlede bier fra kolonien uden at bruge en ryger. Saml bier i metal mesh cylinder bure. Hold 3 bier i hvert bur.

2.. Montering bier PER

Chill bierne ved 4 ° C, indtil de er helt immobiliseret. Monter bien lodret i et plastikrør specielt designet til PER. Hold maven inde i røret ved using to små stykker tape, og holde hovedet stikker ud af røret. Sæt rørene på en rist med to rækker af små plastik søjler, og tildele hvert rør (bi) med et ID-nummer. Derefter sætte behandlede bier på stativer i en inkubator (34 ° C og 80% fugtighed) og holde dem i inkubatoren i 2 timer.

3.. Forberedelse af en serie af saccharose Water Solutions

Forbered 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% og 30% sucrose vandopløsninger og indlæse de løsninger i sprøjter med 15-20 G nåle.

4.. PER Assay

Berøre bi antenne med en dråbe af 0% opløsning (vand) efterfulgt af 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% og 30% sucrose vandige opløsninger. Test alle bier med vand først og tillade mindst to minutter som intervallet mellem hver løsning er brugt. Derfor har vi som regel mindst 20 bier for hvert forsøg. Hvis en bi fuldt udvider hendes snabel er et positivt svar tælles.

5..Data Management

Opsummere de samlede positive svar for hver enkelt for gustatory respons score (GRS). Udføre en passende statistisk analyse af data.

Del 3. Gene knockdown validering

Fat organer dissekeret fra et andet sæt af 7-dages gamle behandlede bier. En standard TRIzol procedure anvendes til RNA-ekstraktion, som er efterfulgt af DNase I-behandling 24.. Vg og USP genekspression analyseres ved en totrins QRT-PCR. Actin anvendes som reference gen, da det har stabile udtryk i forskellige væv af honningbier. Offentliggjorte real-time PCR primere til vg og USP genet anvendt i dette eksperiment 24. Data analyseres ved hjælp af Delta-Delta CT metode 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Både single-injektion og to dag-injektion strategier betydeligt reduceret vg (One-way ANOVA, p <0,001) (Figur 2A) og USP (One-way ANOVA, p <0,001) (Figur 2B) udskrift niveauer i honningbier Seks dage efter dsRNA blev injiceret. Undertrykkelse af usp udskrift ved at bruge enkelt injektion med dsRNA blanding, og den to-dages injektion med vg først og USP sekund (vg / USP) var signifikant lavere end de to-dages injektion med usp først og vg sekund (USP / VG) (Post-hoc analyser, s. blanding vs USP / vg = 0,013, p vg / USP vs USP / vg = 0,019).

GRS i dobbelt knockdown bier var betydeligt højere end GFP kontrol bier (Student T-test, p = 0,0496) (Figur 3).


Figur 1. Rutediagram over RNA-interferens (RNAi) / snabel forlængelse respons (PER) assay. Fire grupper af 50 nyklækkede bier blev injiceret med dobbeltstrenget RNA (dsRNA) i vitellogenin (VG) og ultraspiracle (USP) ved hjælp af forskellige kombinationer strategier eller med dsRNA af grøn fluorescens-protein (GFP) gen, som ikke findes i honningbi genomet. Bierne blev anbragt tilbage til en bistade efter injektionerne, og blev opsamlet efter 6 dage. Seksten bier pr gruppe blev indsamlet til gen knockdown validering ved hjælp af real-time PCR, og tredive per gruppe var for snabel forlængelse respons (PER) assay. Den "GFP dsRNA 'angiver bierne injiceret med GFP dsRNA, den' vg + USP blanding 'angiver bierne ifremskrives med vg og USP dsRNA blandingen den "vg / USP 'angiver bierne injiceret med vg dsRNA på den første dag, og derefter injiceret med usp dsRNA på den anden dag, den" USP / vg' angiver bierne injiceret med usp dsRNA på den første dag, og injiceret med vg dsRNA på den anden dag.

Figur 2
Figur 2. Dobbelt gen knockdown validering ved hjælp af real-time PCR. Log forvandlet mRNA relativ værdi (middelværdi ± SEM) i abdominal fedt kroppen af de behandlede bier. MRNA relative værdi blev beregnet ved anvendelse af Delta-Delta CT metoden. (A) Vg ekspression 6 dage efter dsRNA injektioner. VG udskrifter var signifikant nedreguleret med tre dobbelt k nockdown tilgange (One-way ANOVA, p <0,001). (B) Usp udtryk 6 dage efter dsRNA'et injektioner. Den USP udskrifter blev signifikant reduceret med tre dobbelte knockdown tilgange (One-way ANOVA, p <0,001). Men USP ekspression i bierne injiceret med dsRNA blandingen og vg / USP var meget lavere end i bierne injiceret med USP / vg (post-hoc analyse, s. blanding vs USP / vg = 0,013, p vg / USP vs USP / vg = 0,019), hvilket indikerer, vg kan være en primær regulator i vg og JH regulerende sløjfe. Den "RQ 'angiver relativ kvantificering niveau af målgenet udskrifter. De forskellige bogstaver over søjler angiver signifikante forskelle mellem behandlingsgrupperne.

ig3.jpg "/>
Figur 3. Smagsmæssige respons score (GRS) ved anvendelse snabel forlængelse respons (PER) assay. Bierne, der blev injiceret med vg og USP dsRNA blanding havde højere GRS end GFP kontrol, angiver, at de var mere følsomme over for saccharose. De forskellige bogstaver over søjler angiver signifikante forskelle mellem behandlingsgrupper (Student T-test, p = 0,0496).

Figur 4
Figur 4.. Mulige regulerende gen net afsløret ved hjælp vg og USP dobbelt knockdown tilgang. Juvenile hormon (JH) fremstilles i honningbi hjerne og udskilles til hæmolymfe. Vitellogenin (VG) er en æggeblomme protein forløber produceres af fedt celler i kroppen. Vg og JH er i en feedback-sløjfe regulering metabolisk Physiollogi, gustatoriske perception, og alderen ved debut af fouragerende og fouragere præference honningbier. Undersøgelser tyder på, at ultraspiracle (USP) er en putativ receptor for JH og kan tjene som en transkriptionsfaktor. Vores dobbelte knockdown af vg og USP har afsløret vg spiller centrale roller i forholdet mellem vg, USP og JH. 1.. Vi fandt dobbelt knockdown af vg og USP forårsagede en større stigning i JH end en vg enkelt knockdown og en USP enkelt knockdown inducerede ikke nogen ændring i JH. Det tyder på, at Vg hæmmer ikke kun JH produktion, men inhiberer en tilbagemelding respons JH USP knockdown (A). I dobbelt knockdowns, forårsagede den dramatiske stigning i JH produktionsresultater fra en reduceret hæmning fra Vg ved vg knockdown og en kompenserende reaktion på en reduceret JH transduktion forårsaget af USP knockdown (B). 2.. Vi fandt USPafskrift overflod var mere reduceret med usp dsRNA da vg primært eller samtidig nedreguleres, hvilket tyder vg undertrykker følsomhed usp mRNAto sin dsRNA. Hvordan kan vg være involveret i RNA-interferens (RNAi)? Vg regulerer honningbi immunforsvar og RNAi er en del af antiviral medfødte immunsystem. Vores tidligere undersøgelse viser argonaute 3 (GB19389, Piwi), en vigtig komponent af RNA-induceret silencing kompleks (RISC), er en af kandidatgener påvirker honningbi social adfærd (gustatoriske opfattelse, alder ved debut fouragering og fouragering præference), som er kontrolleres af Vg / JH modul. Derfor ene mulighed er, at Vg kan undertrykke argonaute proteiner påvirker aktiviteten af RISC (A). Når vg er nedreguleret, USP dsRNA er i stand til mere effektivt at nedbryde USP mRNA (B). 3.. Vores dobbelt knockdown undersøgelse viser også, at USP ikkeikke mediere hæmmende virkning JH på Vg produktion i fedt kroppen fordi hverken enkelt USP knockdown påvirker vg udskrift overflod eller dobbelt vg og USP knockdown forårsager yderligere reduktion af vg udskrifter. Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vores undersøgelse er den første forsøg på at samtidig vælte to gener i voksne insekter. Vores resultater viser, at de to strategier dsRNA injektioner (enkelt injektion og to-dages injektion) er effektive til dobbelt gensuppression, og samtidig gen silencing af vg og USP kan testes 6 dage efter dsRNA injektioner i bier 8,9. Men gen-knockdown effekt varierer i forskellige insektarter afhængigt udskrift niveau af target-genet, protein omsætning satser og dsRNA optagelse effektivitet ved celler eller organer. Desuden er virkningen af ​​RNAi dosisafhængig. Vi fandt en nyopstået bi kunne vel acceptere 4 gl dsRNA, men dødeligheden steg hurtigt, hvis mere end 4 pi dsRNA blev injiceret. Derfor kan to-dages injektion strategien være mere egnede end enkelt injektion til et eksperiment, der kræver højere mængde injektionsvolumen.

Her dobbelte gen knockdown 9

For eksempel Vg og JH er i en feedback-sløjfe regulering honningbi fysiologi 9 og adfærdsmæssige modning 26,27. Tidligere undersøgelser har vist, at vg gen knockdown kan øge JH niveau honningbier 28, hvorimod lokal applikation af JH kan reducere vg udtryk 29.. Desuden har undersøgelser antydet USP er en formodet receptor for JH, og kan mediere responser til JH som en transkriptionsfaktor 14,30. Men hvor vg modulerer JH titer, og om usp er involveret i reguleringen af vg af JH stadig dårligt forstået. Brug af dobbelt knockdown tilgang, har vi opdaget detaljerede indbyrdes forhold mellem vg, USP og JH ( vg spiller en central rolle blandt vg, USP og JH. Højt niveau af Vg ikke kun hæmmer JH produktion 15, men hæmmer en systematisk feedback-respons på USP knockdown (figur 4A). I vg og USP dobbelt knockdown bier blev JH produktionen steget mere 9 end i vg enkelt knockdowns. En mulig forklaring er, at den dramatiske stigning i JH i dobbelt knockdowns resultater fra en betydelig reduktion i den negative effekt af Vg på JH forårsaget af vg knockdown og en kompenserende reaktion på en reduceret JH transduktion forårsaget af usp knockdown (figur 4B). Andet knockdown af vg først og USP anden eller samtidig knockdown af begge forårsagede mere reduktion af USP end hvad en enkelt knockdown USP gjorde. Dette kan tyde på, at vg hæmmer følsomhed usp mRNAto sine dsRNA. Dette resultat er den første til at linke Vg med RNAi-processer. Vg er involveret i immunforsvaret hos honningbier 31 og RNAi er en af mange antivirale systemer 32 i eukaryote organismer. Undersøgelser har vist, at RNAi proces indebærer argonaute proteiner, som er konserveret i hele Eukaryoter 33. Interessant, vi tidligere fundet, at argonaute 3 (GB19389, Piwi) er en af kandidatgener regulerer honningbi social adfærd, hvor Vg / JH-modulet spiller centrale roller 34.. Derfor er et alternativ forklaring er, at Vg undertrykker funktioner argonaute proteiner påvirker mRNA nedbrydning (figur 4A). Når vg er nedreguleret, Argonautes bidrage mere aktivt til USP mRNA nedbrydning forårsaget af dets dsRNA (figur 4B). Endelig fandt vi vg udskrift overflod blev ikke ændret med usp knockdown, og det blev reduceret med vg og USP dobbelt knockdown på the tilsvarende niveau som det, vg single knockdown. Disse resultater tyder på, at USP ikke er involveret i hæmmende effekt af JH på Vg. Samlet set dobbelt genet knockdown tilsyneladende er en kraftfuld metode til at hjælpe os med at forstå regulerende gen netværk i detaljer.

PER er en standard assay til måling gustatory opfattelsen i honningbier, der er blevet brugt som en indikator for udviklingen af honningbi social adfærd 35.. Bier med høj følsomhed over for sukker starter som regel fouragering tidligt i livet og foretrækker at indsamle pollen. Gustatory opfattelse kan også testes for at forudsige behandlingseffekt på social adfærd, før nogen andre store adfærdsstudier udføres. Derudover har vi vist, at smagsmæssige opfattelse er korreleret med intern metaboliske tilstand 9 Derfor PER kan udnyttes til at identificere mæthed og sult niveauer. Endvidere er PER parret med lugt anvendte betingelser for at studere læringog hukommelse i honningbier. Kollektivt, PER assay er en meget nyttig teknik til at studere honningbi adfærd og metaboliske fysiologi. Men PER er følsom håndtering metoder 36.. For eksempel var bier, der var bedøvet ved nedkøling eller CO 2 mere lydhøre over for sucrose end kontrol 36. PER varierer også i løbet af dagen, og er følsom over for miljøforhold og stress. Derfor er det meget vigtigt at holde miljøet og procedurer konsistente under eksperimentet. Generelt slut vi PER om morgenen og følger den samme tidsplan i følgende dage. Vi plejer begynde at indsamle bier i tidlig morgen på 8:00, og det tager 3 timer at blive klar til PER. Hvis PER behov, der skal udføres på tværs af flere dage, er det vigtigt at afslutte den i en kort periode i tilfælde af miljø ændringer. PER bør tages i grupper og hver gruppe bør omfatte mere end 20 bier fordi der i mindst 2 minutters interval skal holdes mellem forskellige Concentrations saccharose løsninger. Vi har gjort 75-100 bier pr gruppe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Erin Fennern for at bistå eksperiment. Dette arbejde blev finansieret af Norges Forskningsråd (180504, 185.306 og 191.699), PEW Charitable Trust, og National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE Healthcare PCR beads in 96 well plate GE Healthcare 27-9557-01
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
RiboMax T7 RNA production system Promega P1300
Trizol LS Invitrogen 10296028
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma-Aldrich C0549
isopropyl alcohol Sigma-Aldrich I9516
Hamilton micro syringe Hamilton 80301
30G BD disposable needles BD Biosciences 305106
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
1 ml Syringe BD Biosciences 30960
Stereo dissection microscope Leica Microsystems S6D
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
Wax plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
  2. Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
  3. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  4. Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
  5. Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).
  6. Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509 (2007).
  7. Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
  8. Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).
  9. Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).
  10. Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).
  11. Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
  12. Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).
  13. Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
  14. Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).
  15. Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
  16. Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
  17. Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
  18. Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
  19. Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
  20. Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
  21. Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
  22. Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
  23. Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
  24. Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899 (2009).
  25. Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
  26. Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
  27. Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. Hormones, Brain and Behavio. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).
  28. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
  29. Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
  30. Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
  31. Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
  32. Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
  33. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
  34. Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
  35. Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
  36. Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).

Tags

Neuroscience genetik adfærd neurobiologi molekylær biologi kemi biokemi biologi (generelt) genetik (dyr og planter) dyr biologi RNA-interferens RNAi dobbeltstrenget RNA dsRNA dobbelt gen knockdown vitellogenin gen , Ultraspiracle gen, Vitellogenin protein Vg ultraspiracle protein USP grøn fluorescens protein GFP gustatory perception snabel forlængelse respons PER honningbier,
RNAi-medieret Double Gene Knockdown og gustatoriske Perception Måling i Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V.… More

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V. RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (77), e50446, doi:10.3791/50446 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter