Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

RNAi-gemedieerde Dubbele Gene Knockdown en Smaak Perception Meting in Honingbijen ( Published: July 25, 2013 doi: 10.3791/50446
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1School of Life Sciences, Arizona State University, 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

Summary

In dit protocol beschrijven we twee strategieën die tegelijkertijd in honingbijen te onderdrukken twee genen (dubbel gen knockdown). Dan presenteren we hoe de proboscis extensie respons (PER) test om het effect van de dubbele gen knockdown op honingbij smaak perceptie bestuderen gebruiken.

Abstract

Deze video demonstreert nieuwe technieken van RNA interferentie (RNAi), die twee genen tegelijk downregulate in honing bijen met dubbelstrengs RNA (dsRNA) injecties. Het bevat ook een protocol van proboscis extensie respons (PER) test voor het meten van smaak waarneming.

RNAi-gemedieerde knockdown gen is een effectieve techniek neerwaarts reguleren van expressie van het doelwitgen. Deze techniek wordt meestal gebruikt voor gen manipulatie, maar heeft beperkingen op interacties en het totale effect tussen genen detecteren. In het eerste deel van deze video, presenteren we twee strategieën tegelijk neerhalen twee genen (de zogenaamde double-gen knockdown). We tonen beide strategieën zijn in staat om twee genen, vitellogenine (vg) en Ultraspiracle (usp), die in een regelgevend feedback loop effectief te onderdrukken. Deze dubbele gen knockdown benadering kan worden gebruikt om verbanden tussen genen ontleden en kunnen gemakkelijk worden toegepastverschillende insectensoorten.

Het tweede deel van deze video is een demonstratie van proboscis extensie respons (PER) test bij honingbijen na de behandeling van dubbele gen knockdown. De PER test is een standaard test voor het meten van smaak perceptie bij honingbijen, dat is een belangrijke voorspeller voor hoe snel een honingbij's gedrags rijping is. Meer smaak perceptie van nest bijen geeft verhoogd gedragsontwikkeling die vaak wordt geassocieerd met een eerdere leeftijd bij aanvang van foerageer-en foerageren specialisatie in pollen. Bovendien kan PER assay toegepast om metabolische toestanden van verzadiging of honger identificeren honingbijen. Tenslotte PER test gecombineerd met pairing verschillende geur stimuli voor het conditioneren van de bijen wordt ook veel gebruikt voor leren en geheugen studies bij honingbijen.

Introduction

RNA interferentie (RNAi) is RNA gebaseerde post-transcriptional gene silencing, die optreedt in een grote verscheidenheid van eukaryote organismen. Het proces van RNAi wordt veroorzaakt door endogene of exogene dubbelstrengs RNA (dsRNA) precursors. De dsRNA activeert de ribonuclease eiwit Dicer die bindt en splitst de dsRNA om kleine fragmenten (20-25 bp). Dan is de kleine fragmenten van de dsRNA gids een erkenning en splitsing van complementaire mRNA door argonaute eiwitten, een katalytisch bestanddeel van RNA-induced silencing complex (RISC) 1. In zoogdieren, dsRNA langer dan 30 nt, activeert een antivirale respons (interferon respons, IFN) wat leidt tot niet-specifieke afbraak van RNA transcripten 2. Echter, lange dsRNA bewezen effectief en specifiek in insecten aangezien er een tekort aan dit IFN 3.

Lange dsRNA's zijn gebruikt voor downregulatie van doelgenen in verschillende insectensoorten. Honingbijen zijn een van de pioneer insect organismen waarin functies van veel belangrijke genen in de ontwikkeling en het gedrag zijn geopenbaard door dsRNA 4,5. Verschillende dsRNA levering methoden zijn uitgevoerd in honingbijen: dsRNA voeden efficiënt downregulates doelwit genexpressie in honingbij larven 6, terwijl dsRNA injectie is een effectieve aanpak voor gen knock-down in honingbij embryo's 4 en volwassen bijen 7,8.

Gen knock-down effecten vertoond door het toepassen van dsRNA om insecten zijn van voorbijgaande aard en gelokaliseerd. Studies hebben aangetoond dat zowel abdominale dsRNA injecties en thoracale dsRNA injectie effectief te onderdrukken doelwitgenexpressie in buikvet lichaamscellen insecten 9,10. DsRNA wordt geïnjecteerd in de buik en borstkas holten en vet lichaamscellen in staat zijn tot het nemen van de dsRNA uit de hemolymfe waar de cellen worden gebaad 10. Echter, kunnen genen in andere organen zoals eierstokken en de hersenen, niet gericht door eenabdominale of thoracale injecties. Om de genen in honingbij hersenen richten, heeft hersenen injectie van dsRNA ook uitgevoerd, die effectief beïnvloedt doelwit genexpressie in lokale hersengebieden 11. Hier, we documenteren alleen abdominale dsRNA injectie die wordt vaker gebruikt bij volwassen bijen.

RNAi is voornamelijk gebruikt voor richten op een enkel gen en is een krachtig middel om de genfunctie te onthullen. Echter een gen niet geïsoleerd van anderen, het is in complexe regulerende netwerken. Een sleutel tot een biologisch proces te begrijpen is te ontleden hoe de genen met elkaar, die gelijktijdig manipulaties van meerdere genen in plaats van een enkel gen knockdown vereist. In zoogdiercellijnen, hebben wetenschappers in gelijktijdig remmen van twee of drie genen opgevolgd door gebruik afgiftesystemen 12 of multi-microRNA (miRNA) haarspeld designs 13. Maar bij insecten, meerdere genen knockdowns zijn nog niet getest. Hier hebben we present verschillende injectie strategieën die een dubbele gen knockdown kan bereiken. We richten twee genen: vitellogenin (vg) die een dooier eiwit precursor codeert en Ultraspiracle (USP) dat een vermeende receptor voor juveniel hormoon (JH) codeert en kan dienen als een transcriptiefactor bemiddelende reacties op JH 14 in honingbijen. Vg en JH reguleren elkaar in een feedback loop 15 en zijn betrokken bij honingbij gedragregulatie 9. Met behulp van de dubbele-gen knock-down, we verstoren zowel Vg en JH paden en ontdekken hoe zij gezamenlijk invloed honingbij gedrag en fysiologie, en hoe vg, usp en JH interageren 9.

Smaak perceptie is een gedrags voorspeller voor honingbij sociaal gedrag 16. In termen van gedragsontwikkeling, nest bijen met hoge smaak perceptie gedragsgestoorde volwassen snel, en meestal voedergewassen vroeg in het leven en liever pollen 16,17 verzamelen. Hoewel de regelgeving mechanisms onderliggende smaak perceptie nog onduidelijk, studies hebben aangetoond dat smaak perceptie verbonden inwendige energie metabolisme 9, hormonale secretie 18,19 en biogene amine paden 20. Zowel Vg en JH zijn belangrijke hormonale regelaars moduleren smaak perceptie 7,21. In het laboratorium kan een variatie van smaak perceptie bij bijen worden beoordeeld door het testen van de proboscis extensie respons (PER) verschillende sacharoseoplossingen. Elke bij wordt getest door het aanraken haar beide antennes met een druppel water, gevolgd door een oplopende concentratie reeks van 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% sucrose. Een positief antwoord wordt genoteerd als een honingbij volledig breidt haar slurf als een druppel water of sucrose wordt geraakt aan elke antenne. Gebaseerd op het aantal positieve reacties op de oplossingen kan de smaak perceptie van elke afzonderlijke bepaald 16. Echter, de toepassing van de PER niet beperkt tot het meten gustatory perceptie. De PER is ook een effectieve methode om de metabole toestand van de bijen, zoals verzadiging vs honger te testen. De bijen met een grotere reacties op sucrose zijn hongeriger in het algemeen (Wang en Amdam, ongepubliceerde gegevens). Voorts kan de PER paradigma worden gebruikt associatief leren en geheugen bij bijen. In dit geval zal de bijen worden opgeleid om de aanwezigheid van sucrose water associëren met een geur. Wanneer de bijen te leren van de vereniging, kan alleen de aanwezigheid van de geur een positieve slurf reactie op te roepen zonder hen te belonen met de sucrose 22,23. In deze video laten we zien hoe PER naar smaak perceptie die is verbonden met vg en usp dubbele knock-down in een eerdere studie 9 evaluatie uit te voeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deel 1: RNAi-gemedieerde dubbel gen knockdown

1. dsRNA Synthese

  1. Ontwerp primers van dsRNAs targeting vg, usp en een controle-gen dat codeert voor groene fluorescentie eiwit (GFP) die niet in de honingbij genoom: primers werden ontworpen met behulp van online gratis software Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. dsRNA synthese voor vg, usp en GFP: gebruik RiboMax T7 RNA productiesysteem van Promega voor in vitro transcriptie.
  3. dsRNA zuivering
    1. Denaturatie en renaturatie: warmte het dsRNA tot 85 ° C gedurende 5 minuten en laat het afkoelen op kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    2. DNase I behandeling: voeg 1 pl DNase I in elk dsRNA reactie en meng ze door de buizen te vegen. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
    3. Voeg 150 ul nuclease-vrij water en 750 pi Trizol - LS in elke reactie, en ze zachtjes mengen door inverting de buis. Incubeer de monsters gedurende 5 min bij 30 ° C.
    4. Voeg 200 ul chloroform in elk monster. Meng krachtig gedurende 20 sec. Centrifugeer de monsters gedurende 15 min bij 12.000 xg bij 4 ° C.
    5. Breng de bovenstaande fase aan elke nieuwe buis en voeg 500 ul isopropylalcohol in elke buis. Meng ze door het buisje. Incubeer gedurende 20 minuten bij -20 ° C werd het mengsel Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C.
    6. Verwijder de bovenstaande vloeistof en gebruik 1000 ul 75% ethanol te wassen de pellet. Na het centrifugeren van de buis gedurende 5 min bij 7500 xg bij 4 ° C, de lucht drogen de dsRNA pellet, en gebruik nuclease vrij water tot ontbinding van de pellet. Om de effectiviteit van gen downregulatie waarborgen, dient de dsRNA concentratie ongeveer 9 -10 pg / pl zijn.

2. dsRNA Abdominale Injectie

Voor dubbel gen neerhalen, zijn er twee strategieën: 1) enkele injectie: mix dsRNA van twee genen en inject het mengsel; 2) twee-daagse injectie: injecteer de eerste dsRNA targeting een gen op de eerste dag, en injecteer het tweede dsRNA in dezelfde bijen op de tweede dag.

  1. Chill nieuw opgedoken bijen in een 4 ° C koelkast gedurende 1-2 minuten. Wanneer de bijen worden geïmmobiliseerd, monteren 3-4 bijen in parallel op petrischaaltjes vol met vaste was met insecten pinnen gekruist tussen hun buiken en thoraces.
  2. Chill de bijen weer in een 4 ° C koelkast. Zorg ervoor dat de bijen zijn volledig immobiel. Het duurt ongeveer 1-2 minuten. De bijen moeten kijken los. Als de bijen worden gekruld of verwrongen, het betekent dat ze zijn te lang, die moet vermeden worden gekoeld. Chilling teveel veroorzaakt hoge mortaliteit, maar volledige immobilisatie is belangrijk als elke beweging neemt de grootte van de wond en mortaliteit.
  3. Zet een wegwerp 30 G naald (BD) op een Hamilton micro spuit. Neem 3 pi dsRNA en zorg ervoor dat er geen luchtbel in de spuit. De naald wordt ingebracht om een ​​kant van de buik om dama te vermijdenGing interne organen. Druk langzaam op de zuiger om de dsRNA te worden geabsorbeerd. Aangezien dsRNA is zeer viskeus, duurt 2-3 seconden volledig worden verwijderd van de injectiespuit. Na het volledig naar beneden te drukken de zuiger, laat de naald in de wond voor 4-5 sec. Observeren na injecties bijen voor 3-5 sec. Als een hemolymfe druppel lekken uit de wond, gooi de bijen.
  4. Gebruik verschillende kleuren om hun thoraces overeenkomen met verschillende behandelingen markeren. Op dit punt als de enkele injectie strategie werd gebruikt, de bijen kunnen worden terug in een kolonie geplaatst na 1 uur observatie. Indien de tweedaagse injectiestrategie werd gebruikt, na injectie met de eerste dsRNA, de bijen worden in een cilinder mesh kooi met aan de zijkant voorzien honing geplaatst in een incubator bewaard bij 34 ° C en 80% vochtigheid .
  5. Op de tweede dag, volgt u de stappen 2.2 en 2.3 aan de bijen relaxen in het gaas kooien en monteer ze op wasplaten. Voer injecties met de tweede dsRNA zoals het is described in stap 2.4.
  6. Laat de bijen terug bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en te introduceren in een kolonie.

Opmerking: Knockdown effecten kunnen worden gedetecteerd door kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR) en western blotting. In het algemeen knockdown werkzaamheid varieert en hangt af van vele factoren. In onze studie kan een dubbele gen knockdown gedetecteerd 7 dagen na een enkele injectie en twee dagen injecties.

Deel 2: Zuigorganen extensie respons (PER) assay

1. Verzamelen Bijen van de Bijenkorf

Op dag 6 na de injecties, verzamel behandelde bijen uit de kolonie zonder gebruik van een roker. Verzamelen bijen in metalen gaas cilinder kooien. Houd 3 bijen in elke kooi.

2. Montage Bijen voor PER

Chill de bijen bij 4 ° C tot ze volledig geïmmobiliseerd. Monteer elke bij verticaal in een plastic buis speciaal ontworpen voor PER. Houd de buik in de buis door using twee kleine stukken tape, en houd het hoofd steken van de buis. Zet de buisjes op een rek met twee rijen van kleine plastic kolommen, en wijst elke buis (bee) met een ID-nummer. Zet vervolgens behandeld bijen op de rekken in een incubator (34 ° C en 80% luchtvochtigheid) en bewaar ze in de incubator voor 2 uur.

3. Het voorbereiden van een serie van sucrose Water Solutions

Bereid 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% en 30% sucrose water oplossingen en laadt de oplossingen in spuiten met 15-20 G naalden.

4. PER Assay

Druk antenne van de bij een druppel 0% oplossing (water) gevolgd door 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% en 30% sucrose wateroplossingen. Test alle bijen eerst met water en laat minstens twee minuten het interval tussen elke oplossing wordt gebruikt. Daarom hebben we meestal minstens 20 bijen voor elk onderzoek. Als een bij volledig breidt haar slurf, wordt een positieve reactie geteld.

5.Gegevensbeheer

Kortom het totale positieve reacties voor elk individu voor gustatory respons score (GRS). Voer een geschikte statistische analyse van de gegevens.

Deel 3. Gen knockdown validatie

Vetlaag ontleed uit een andere set van 7 dagen oude behandelde bijen. Een standaard TRIZol procedure wordt toegepast voor RNA-extractie, gevolgd door DNase I behandeling 24. Vg en usp genexpressie geanalyseerd door een twee-staps qRT-PCR. Actine gebruikt als een referentie-gen omdat zij stabiele expressie in verschillende weefsels van honingbijen. Gepubliceerd real-time PCR primers voor vg en usp gen worden in dit experiment 24. De gegevens worden geanalyseerd met behulp van Delta-Delta CT methode 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zowel de single-injectie en twee-daagse-injectie strategieën aanzienlijk verminderd vg (One-way ANOVA, p <0,001) (figuur 2A) en usp (One-way ANOVA, p <0,001) (figuur 2B) transcriptniveaus in honing bijen zes dagen na de dsRNA werd geïnjecteerd. De onderdrukking van usp transcript met de enkele injectie dsRNA mengsel en de twee-daagse injectie vg eerste en tweede usp (vg / usp) was significant lager dan de tweedaagse injectie usp eerste en tweede vg (USP / vg) (post-hoc analyse, p mengsel versus usp / vg = 0.013, p vg / usp vs usp / vg = 0,019).

De GRS in een dubbele knockdown bijen was significant hoger dan de controle GFP bijen (Student t-test, p = 0,0496) (Figuur 3).


Figuur 1. Stroomschema van de RNA interferentie (RNAi) / proboscis extensie respons (PER) assay. Vier groepen van 50 nieuw gebleken bijen werden geïnjecteerd met double-stranded RNA (dsRNA) van vitellogenin (vg) en Ultraspiracle (USP) met verschillende combinatiestrategieën of met dsRNA van groene fluorescentie eiwit (GFP) gen die niet bestaat in de honingbij genoom. De bijen werden teruggeplaatst naar een bijenkorf na de injecties, en na 6 dagen werden verzameld. Zestien bijen per groep werden verzameld voor gen knockdown validatie door met behulp van real-time PCR, en dertig per groep waren voor proboscis extensie respons (PER) assay. De 'GFP dsRNA' geeft de bijen geïnjecteerd met GFP dsRNA, de 'vg + usp mengsel' geeft de bijen ingeprojecteerde met vg en usp dsRNA mengsel, de 'vg / usp' geeft de bijen geïnjecteerd met vg dsRNA op de eerste dag, daarna geïnjecteerd met usp dsRNA op de tweede dag, de 'usp / vg' geeft de bijen geïnjecteerd met usp dsRNA op de eerste dag, en geïnjecteerd met vg dsRNA op de tweede dag.

Figuur 2
Figuur 2. Dubbel gen knockdown validering door gebruik real-time PCR. Meld getransformeerd mRNA relatieve waarde (gemiddelde ± SEM) in buikvet lichaam van de behandelde bijen. De mRNA relatieve waarde werd berekend met Delta-Delta CT methode. (A) Vg expressie 6 dagen na de injectie dsRNA. De vg transcripten werden aanzienlijk down-gereguleerd door drie dubbele k nockdown benaderingen (One-way ANOVA, p <0,001). (B) Usp expressie 6 dagen na de dsRNA injecties. De usp transcripten werden aanzienlijk verminderd door drie dubbele knock-down benadering (One-way ANOVA, p <0,001). De usp expressie in de bijen geïnjecteerd met het dsRNA mengsel en vg / usp was veel lager dan in de bijen geïnjecteerd met usp / vg (Post-hoc analyse, p mengsel versus usp / vg = 0.013, p vg / usp vs usp / vg = 0.019), wat aangeeft dat vg een primaire regulator in de vg en JH regulerende lus kan zijn. De 'RQ' geeft de relatieve kwantificatie niveau van de doelgroep gentranscripten. De verschillende letters hierboven bars geven significante verschillen tussen de behandelingsgroepen.

ig3.jpg "/>
Figuur 3. Gustatory respons score (GRS) door gebruik te maken proboscis extensie respons (PER) assay. De bijen die werden geïnjecteerd met vg en usp dsRNA mengsel hadden hogere GRS dan de GFP controles, wat aangeeft dat ze waren gevoeliger voor sucrose. De verschillende letters hierboven bars geven significante verschillen tussen de behandelingsgroepen (Student t-test, p = 0,0496).

Figuur 4
Figuur 4. Mogelijke regulerende netwerken van genen onthuld door gebruik vg en usp dubbele knockdown aanpak. Juvenile hormoon (JH) wordt geproduceerd in de honingbij hersenen en afgescheiden aan de hemolymfe. Vitellogenine (Vg) is een dooier eiwitvoorloper geproduceerd door vet lichaamscellen. Vg en JH zijn in een feedback loop regeling van het metabolisme Physiolgie, smaak perceptie, en de leeftijd bij aanvang van foerageer-en foerageren voorkeur van honingbijen. Studies suggereren dat Ultraspiracle (USP) is een vermeende receptor voor JH en kan dienen als een transcriptiefactor. Onze dubbele neerhalen van vg en usp is gebleken vg speelt een centrale rol in de relatie tussen vg, usp en JH. 1. We vonden dubbel neerhalen van vg en usp veroorzaakt een grotere verhoging van JH dan een vg enkele knock-down, en een usp enkele knockdown geen enkele verandering in JH niet opwekken. Het suggereert dat Vg remt niet alleen JH productie, maar remt een feedback reactie van JH op usp knockdown (A). In dubbele knockdowns, de enorme toename van JH productieresultaten een verlaagde remming van Vg door vg knockdown en een compenserende reactie op een verlaagd JH transductie door usp knockdown (B). 2. Hebben we usptranscript overvloed was meer verminderd door usp dsRNA toen vg was vooral of tegelijkertijd downregulated, wat suggereert vg onderdrukt de gevoeligheid van usp mRNAto haar dsRNA. Hoe kan vg worden betrokken bij RNA-interferentie (RNAi)? Vg reguleert honingbij immuunsysteem en RNAi is een onderdeel van antivirale aangeboren immuunsysteem. Onze vorige studie toont argonaute 3 (GB19389, Piwi), een belangrijk onderdeel van RNA-induced silencing complex (RISC), is een van de kandidaat-genen beïnvloeden honingbij sociaal gedrag (smaak beleving, leeftijd bij aanvang foerageren en foerageren voorkeur), dat is gecontroleerd door Vg / JH module. Daarom is een mogelijkheid is dat Vg argonaute eiwitten die de activiteit van RISC (A) kan onderdrukken. Als vg is downregulated, usp dsRNA is in staat om efficiënter te degraderen usp mRNA (B) 3.. Onze dubbele neerhalen studie toont ook aan dat usp doetremmende effect van JH bemiddelt niet Vg productie in het vet lichaam omdat geen enkele usp knockdown beïnvloedt vg transcript overvloed, noch dubbele vg en usp knockdown veroorzaakt verdere vermindering van vg transcripten. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Onze studie is de eerste poging om tegelijk neerhalen twee genen bij volwassen insecten. Onze resultaten tonen dat beide strategieën dsRNA injecties (een injectie en twee dagen injectie) zijn effectief voor een dubbele genonderdrukking en gelijktijdige gene silencing van vg en usp getest worden 6 dagen na het dsRNA injecties in bijen 8,9. Echter, varieert gen knockdown werkzaamheid bij verschillende insectensoorten afhankelijk transcript niveau van target-gen, eiwit omzet tarieven en dsRNA opname efficiency door cellen of organen. Bovendien, het effect van RNAi is dosisafhankelijk. We vonden een nieuw opgedoken bee zou wel accepteren 4 pi dsRNA, maar de sterfte snel gestegen als er meer dan 4 pl dsRNA werd geïnjecteerd. Daarom kan de tweedaagse injectiestrategie geschikter dan de enkele injectie voor een experiment dat grotere hoeveelheid injectievolume vereist.

Hier, de dubbel-gen knock-down 9

Bijvoorbeeld Vg en JH zijn in een feedback loop reguleren honingbij fysiologie 9 en gedragsmatige rijping 26,27. Eerdere studies hebben aangetoond dat vg gen knockdown JH niveau kan verhogen in honingbijen 28, terwijl lokale toepassing van JH vg expressie 29 kan verminderen. Bovendien hebben studies gesuggereerd USP is een vermeende receptor voor JH en kunnen mediëren te JH als een transcriptiefactor 14,30. Echter, hoe vg moduleert JH titer en of usp is betrokken bij de regulatie van vg door JH nog steeds slecht begrepen. Met behulp van de dubbele knock-down benadering, hebben we ontdekt gedetailleerde onderlinge relaties tussen vg, usp en JH ( vg speelt een centrale rol bij vg, usp en JH. Hoog niveau van Vg remt niet alleen JH productie 15, maar remt een systematische terugkoppeling reactie op usp knockdown (Figuur 4A). In vg en usp dubbele knockdown bijen, werd JH productie meer dan 9 die toegenomen in vg enkele knockdowns. Een mogelijke verklaring is dat de dramatische toename van JH in twee knockdowns gevolg van een aanzienlijke vermindering van de negatieve effecten van Vg op JH door vg knockdown en een compenserende reactie op een verlaagd JH transductie door usp knockdown (Figuur 4B). Ten tweede knock-down van vg eerste en usp tweede of gelijktijdig uitschakelen van beide veroorzaakte meer vermindering van de usp dan wat een knock-down van usp deed. Dit kan erop wijzen dat vg remt de gevoeligheid van usp mRNAto haar dsRNA. Dit resultaat is het eerste Vg koppelen RNAi processen. Vg is betrokken bij afweer in honingbijen 31 en RNAi is een van vele antivirale systemen 32 in eukaryoten. Studies hebben aangetoond dat het RNAi proces omvat argonaute eiwitten die geconserveerd eukaryoten 33. Interessant is dat we eerder geconstateerd dat argonaute 3 (GB19389, Piwi) is een van de kandidaat-genen reguleren honingbij sociaal gedrag waarbij Vg / JH module speelt centrale rol 34. Daarom is een alternatieve verklaring is dat Vg onderdrukt functies van argonaute eiwitten beïnvloeden van mRNA degradatie (Figuur 4A). Als vg is downregulated, ARGONAUTES meer actief bijdragen aan usp mRNA degradatie, veroorzaakt door zijn dsRNA (Figuur 4B). Tenslotte vonden we vg transcript overvloed werd niet veranderd door usp knockdown, en het werd verminderd door vg en usp dubbele knockdown bij The vergelijkbaar niveau als dat van vg enkele knockdown. Deze resultaten suggereren dat usp niet betrokken is bij het ​​remmende effect van JH op Vg. Algemeen, de dubbele gen knockdown blijkbaar is een krachtige aanpak om ons te helpen de regelgeving genetische netwerk te begrijpen in detail.

PER is een standaard test voor het meten van smaak-beleving in honingbijen, die is gebruikt als een voorspeller voor de ontwikkeling van de honingbij sociaal gedrag 35. Bijen met een hoge gevoeligheid voor suiker beginnen meestal foerageren vroeg in het leven en liever stuifmeel te verzamelen. Smaak perceptie kan ook getest worden voor het voorspellen van het effect van de behandeling op sociaal gedrag vóór alle andere grootschalige gedrag studies worden uitgevoerd. Daarnaast hebben we aangetoond dat smaak waarneming is gecorreleerd met interne metabole toestand 9 Derhalve PER kan worden gebruikt om verzadiging en hongerniveaus identificeren. Bovendien PER gekoppeld geur voorwaarden wordt gebruikt voor het bestuderen lerenen geheugen bij honingbijen. Collectief, PER test is een zeer nuttige techniek voor het bestuderen van honingbij gedrag en metabolische fysiologie. Echter, PER gevoelig voor behandeling methoden 36. Bijvoorbeeld, bijen die verdoofd door koeling of CO 2 waren waren meer ontvankelijk voor sucrose dan controles 36. PER ook varieert gedurende de dag en is gevoelig voor omgevingsfactoren en stress. Daarom is het erg belangrijk voor het milieu en de methode in overeenstemming tijdens het experiment te houden. In het algemeen, eindigen we PER in de ochtend en volg hetzelfde schema in volgende dagen. We meestal beginnen met het verzamelen bijen in de vroege ochtend om 8:00 uur, en het duurt 3 uur om klaar te zijn voor de PER. Als PER behoeften in verschillende dagen worden uitgevoerd, is het belangrijk om het af in een korte periode bij de omgeving verandert. PER moeten worden genomen in groepen en elke groep moet meer dan 20 bijen omdat minstens 2 minuten interval tussen verschillende concentrati worden bewaardons van sucrose oplossingen. We hebben gedaan 75-100 bijen per groep.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs willen graag Erin Fennern bedanken voor de ondersteuning van experiment. Dit werk werd gefinancierd door de Raad onderzoek van Noorwegen (180504, 185306 en 191699), Pew Charitable Trust, en het National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE Healthcare PCR beads in 96 well plate GE Healthcare 27-9557-01
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
RiboMax T7 RNA production system Promega P1300
Trizol LS Invitrogen 10296028
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma-Aldrich C0549
isopropyl alcohol Sigma-Aldrich I9516
Hamilton micro syringe Hamilton 80301
30G BD disposable needles BD Biosciences 305106
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
1 ml Syringe BD Biosciences 30960
Stereo dissection microscope Leica Microsystems S6D
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
Wax plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
  2. Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
  3. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  4. Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
  5. Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).
  6. Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509 (2007).
  7. Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
  8. Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).
  9. Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).
  10. Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).
  11. Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
  12. Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).
  13. Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
  14. Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).
  15. Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
  16. Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
  17. Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
  18. Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
  19. Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
  20. Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
  21. Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
  22. Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
  23. Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
  24. Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899 (2009).
  25. Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
  26. Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
  27. Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. Hormones, Brain and Behavio. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).
  28. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
  29. Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
  30. Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
  31. Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
  32. Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
  33. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
  34. Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
  35. Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
  36. Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).

Tags

Neurowetenschappen Genetica Gedrag Neurobiologie Moleculaire Biologie Chemie Biochemie biologie (algemeen) genetica (dieren en planten) biologie RNA-interferentie RNAi dubbelstrengs RNA dsRNA dubbel gen knockdown vitellogenine gen , Ultraspiracle gen, Vitellogenine eiwit Vg Ultraspiracle eiwit USP groene fluorescentie eiwit GFP smaak perceptie proboscis extensie respons PER honingbijen, Diermodel assay
RNAi-gemedieerde Dubbele Gene Knockdown en Smaak Perception Meting in Honingbijen (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V.… More

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V. RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (77), e50446, doi:10.3791/50446 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter